Name: Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri il metodo colorimetrico Prussian Blue per misurare il contenuto di ferro nei tessuti vegetali. Questa tecnica offre quantificazione precisa e affidabile per studi di biologia vegetale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da l'Israele Ministero della scienza, tecnologia e progettuali da una sovvenzione del Chief Scientist del Ministero israeliano dell'agricoltura (n. 16-16-0003).

1. materiale e le condizioni di crescita della pianta
<ol><li>Semi di semi di tabacco di una (cultivar Samsun) per vaso di 5cm x 5cm riempito con mezzo vaso standard. Posizionare i vasi su vassoi. Crescere le piante in una stanza di crescita in condizioni di giorno lungo (16/8 h chiaro/scuro) ad una temperatura costante di 23 ° C. Irrigare con acqua di rubinetto fino a quando gli scoli dell'acqua dalla pentola.</li>
	<li>Dopo giorni di 50 ± 5, iniziare trattamenti di Fe nell'irrigazione, secondo le concentrazioni adatte per l'esperimento. Ad esempio, abbiamo utilizzato un intervallo di concentrazioni di ferro da 0 a 6 mM, completato da un chelatore Fe solubile (Fe EDDHA). Irrigare le piante con la soluzione appropriata ogni due giorni (per evitare la disidratazione) per 6-8 giorni.</li>
</ol>2. preparazione delle foglie per la misura di ferro
Note: Tutti i materiali da utilizzare devono essere esente da ferro in modo da ridurre il rischio di contaminazione da ferro. Pulire il mortaio e il pestello due volte con soluzione di HCl 4% e asciugare con carta da filtro ogni volta prima dell'uso. Se qualsiasi materiale viene riutilizzato, pulirlo due volte con una soluzione di HCl 4% e asciugare con carta da filtro.
<ol><li>Staccare le foglie dal gambo a mano, utilizzando guanti (non utilizzare qualsiasi apparecchiatura del metallo). Utilizzare circa 10 g di foglie (peso fresco) per ogni campione. Pulire ogni foglia con doppia acqua distillata (DDW) utilizzando un flacone spray. Questo passaggio è importante per evitare la contaminazione di Fe.</li>
	<li>Asciugare le foglie su un tovagliolo di carta e metterli in un sacchetto di carta. Trasferire i sacchi di carta da forno ad una temperatura costante di 80 ° C per 2-3 giorni.</li>
	<li>Quando asciutto, schiacciare le foglie in polvere utilizzando un mortaio e pestello e trasferimento a tubi in plastica sterili da 15 mL.</li>
</ol>3. bruciare le foglie di frassino
Note: L'utilizzo di una basso pH (vicino a 0) soluzione di HCl è destinato per aumentare la solubilità del ferro. La lana di roccia viene utilizzata per impedire i gas di fuggire il flaconcino durante la masterizzazione.
<ol><li>Pesare una fiala di scintillazione 20ml nuovo, sigillato senza coperchio. Prendere nota del valore o impostare il valore su zero utilizzando il tasto tare. Aggiungere i fogli secchi schiacciati (campione) nel flaconcino.</li>
	<li>Pesare il campione e il contenitore e prendere nota del valore. Chiudere la cuvetta con lana di roccia.</li>
	<li>Pesare 3 fiale aggiuntive senza aggiungere campioni e notare i loro valori. Queste fiale usarsi come controlli per valutare la quantità di lana di roccia che potrebbe condurre ad un aumento in peso del campione.</li>
	<li>Posizionare le fiale del campione e controllo in una fornace e avviare la masterizzazione utilizzando la seguente procedura di temperatura: temperatura ambiente, rapido aumento di 425 ° C e, infine, a 425° C per 4 ore. Entro questo tempo, le foglie secche si sono rivolti alla cenere.</li>
	<li>Lasciate raffreddare il campioni a circa 100 ° C, ma non sotto questa temperatura per i due passaggi seguenti evitare l'umidità, che potrebbe pregiudicare il peso finale del campione. Utilizzando guanti pesanti, rimuovere i campioni dalla fornace con le pinzette, tenendo il flaconcino esteriormente.</li>
	<li>Posizionare le fiale su una superficie piana, rimuovere la lana di roccia e chiudere i flaconi con i loro coperchi originali.</li>
	<li>Pesare le fiale di 3 controllo (Vedi 3.3) e calcolare il loro guadagno di peso medio. Se l'aumento di peso è uguale o superiore all'1% del peso della cenere (Vedi punto 4.2), utilizzare questo valore come una stima dell'errore di misurazione.</li>
</ol>4. preparare le ceneri per la misura di ferro
Note: La concentrazione di ferro finale nel campione iniziale viene calcolata come il peso delle ceneri diviso per il volume aggiunto di HCl.
<ol><li>Preparare una soluzione di HCl 1 M (4% HCl) con l'aggiunta di 12,5 mL di una soluzione madre di HCl 37% a 87,5 mL di DDW (in un fiasco di vetro o plastica).</li>
	<li>Pesare un tubo di plastica da 15 mL e prendere nota del valore o impostare il valore su zero utilizzando il tasto tare. Trasferire le ceneri sul tubo, pesare e prendere nota del valore. Questo è il peso di cenere.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di 1 M HCl per le ceneri. Le ceneri filtrare su un filtro 22 µm e aggiungere un ulteriore 5 mL di 1 M HCl attraverso lo stesso filtro.</li>
	<li>Il volume finale deve essere di 10 mL. Si noti che parte della soluzione sarà perso nel filtro. Nota: I campioni sono ora pronti per la misurazione di Fe FAAS oppure dal metodo blu di Prussia.</li>
	<li>Fare una curva di calibrazione con la concentrazione di Fe misurata mediante Spettrometria atomica e dal metodo prussiano blu (Vedi Figura 4) per ogni specie di pianta. Successivamente, concentrazione di Fe può essere misurata con il metodo prussiano blu da solo.</li>
</ol>5. misurazione della concentrazione di Fe da FAAS
<ol><li>Rimuovere da 4 mL di ogni campione per la misura di FAAS.</li>
	<li>Dividere i risultati ottenuti dalla misurazione FAAS dal peso delle ceneri. Dividere il valore risultante da 0,01 (perché le ceneri erano solubilizzate in 10 mL). Il valore risultante è la concentrazione di ferro per grammo cenere (ppm).</li>
</ol>6. preparare il blu di Prussia macchiatura soluzione
<ol><li>Preparare un 4% soluzione di blu di Prussia con l'aggiunta di 4 g di K4Fe(CN)6 a 100 mL DDW e vortice (altri volumi e/o concentrazioni possono essere utilizzate per diverse esigenze). Si noti che in questo studio, un meno concentrata soluzione blu di Prussia che è stato utilizzato precedentemente segnalati (20%)14 .</li>
	<li>Mantenere la soluzione al buio a 4 ° C fino all'utilizzo. La soluzione è stabile per 6 mesi se conservato a tali condizioni.</li>
</ol>7. generazione di una curva di calibrazione per il metodo di blu di Prussia utilizzando FAAS risultati
Nota: Calcolare la concentrazione di ferro nella cenere utilizzando la seguente formula <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg">Equazione 1 C: concentrazione, v: volume, peso di w: cenere (g) del campione.
<ol><li>Mescolare 0,50 mL di soluzione di blu di Prussia e 0,50 mL di 1 M HCl. Questo servirà come la soluzione vuota.</li>
	<li>Mescolare 0,5 mL di campione (ceneri nel 4% HCl, come descritto nella sezione 3) e 0,5 mL di soluzione di blu di Prussia (punto 6.1) di pipettaggio. Attendere almeno 1 minuto, ma non più di 5 minuti. Dopo 5 minuti, si verificherà la sedimentazione nei campioni.</li>
	<li>Trasferire il mix in una cuvetta e misurare il diametro esterno a 715 nm utilizzando uno spettrofotometro. Prendere nota del valore.</li>
	<li>Dividere il valore di OD (punto 7.3) per il peso della cenere (punto 3.2) del campione. Il risultato rappresenta OD al grammo cenere.</li>
	<li>Tracciare la regressione lineare fra le concentrazioni di ferro ottenuti da misurazioni FAAS (asse Y) e i valori di OD (asse X). Utilizzare i risultati ottenuti ai punti 5.2 e 7.4. Calcolare la formula di regressione, Y = a + bX, dove Y rappresenta la concentrazione di ferro, una rappresenta l'assorbanza si intersecano, b rappresenta la pendenza di assorbanza e X rappresenta il OD.</li>
</ol>8. utilizzando il metodo di blu di Prussia per determinare i livelli di ferro in altri campioni provenienti dallo stesso tipo di pianta
Note: Dal momento che una curva di taratura è già stata stabilita per questo tipo di pianta, concentrazione di ferro in qualsiasi nuovi campioni provenienti dallo stesso tipo di pianta può essere direttamente calcolato utilizzando la formula di regressione lineare.
<ol><li>Eseguire i passaggi nelle sezioni 3 e 4, seguita da passaggi 7.1 a 7.4.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di ferro in soluzione mediante la formula ottenuta dalla regressione lineare (punto 7.5).</li>
</ol>

<ol><li>Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+uptake%2C+translocation%2C+and+regulation+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).</li>
<li>Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00775-016-1336-0">Ferritins: Furnishing proteins with iron.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).</li>
<li>Zielińska-Dawidziak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+ferritin+-+a+source+of+iron+to+prevent+its+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency.</a> Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).</li>
<li>Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+formation+of+biological+iron-sulfur+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).</li>
<li>Guo, H., Barnard, A. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ta/c2ta00523a">Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability.</a> Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).</li>
<li>Hem, J. D., Cropper, W. H. <a target="_blank" href="https://pubs.usgs.gov/wsp/1459a/report.pdf">Chemistry of iron in natural water.</a> Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).</li>
<li>Rout, G. R., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.agrsci.jp/ras/article/view/12">Role of iron in plant growth and metabolism.</a> Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).</li>
<li>Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+stress+in+plants+Dealing+with+deprivation+and+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload.</a> Plant Stress. 4, 57-69 (2010).</li>
<li>Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. <a target="_blank" href="https://www.shd.org.rs/JSCS/Vol69/No5/V69-No5-10.pdf">Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry.</a> Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).</li>
<li>Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluation+of+colorimetric+iron+determination+methods+commonly+used+in+geomicrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology.</a> Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Atomic+Spectroscopy+-+Guide+to+Selecting+the+Appropriate+Technique+and+System%22">Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System</a>. 16, (2011).</li>
<li>Wachasunder, S. D., Nafade, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00207230108711348">Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry.</a> Science. 58, 517-528 (2001).</li>
<li>Woods, J. T., Mellon, M. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/i560096a013">Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study.</a> Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).</li>
<li>Perls, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF01878983">Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten.</a> Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).</li>
<li>Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/04/28/131888">Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour.</a> bioRxiv. , 1-25 (2017).</li>
<li>de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11104-017-3251-8">Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv.</a> Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).</li>
<li>Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+defensin+gene%2C+AtPDF1.1%2C+mediates+defence+against+Pectobacterium+carotovorum+subsp.+carotovorum+via+an+iron-withholding+defence+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system.</a> Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+transformations+of+iron+at+extremely+low+pH%3A+Fundamental+and+applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).</li>
<li>Stumm, W., Lee, G. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ie50614a030">Oxygenation of ferrous iron.</a> Industrial & Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).</li>
<li>Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703714005663">Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).</li>
<li>Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+continental+crust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of the continental crust.</a> Nature. 443 (7113), (2006).</li>
<li>Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThompson%2C+LM+%22Soils+and+soil+fertility%22">Soils and soil fertility</a>. Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. , (1973).</li>
<li>Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1352231004006442">Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy.</a> Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).</li>
<li>Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistics+review+7%3A+Correlation+and+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Statistics review 7: Correlation and regression.</a> Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).</li>
<li>Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10408340500526766">The correlation coefficient: An overview.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves">https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves</a> (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Misurazione di ferro nei tessuti vegetali è molto importante per la valutazione degli effetti di irrigazione o altre condizioni ambientali. Qui, abbiamo descritto un metodo colorimetrico facile e preciso per la misurazione del contenuto Fe in foglie di tabacco, che può essere facilmente adattato ad altre specie di piante e tessuti.
Nell'ottimizzazione delle condizioni per il metodo colorimetrico, abbiamo usato un mezzo a basso pH (pH < 1.0) per consentire la solubilità del ferro. Il processo d...

Ferro (Fe) è un micronutriente importante in tutti gli organismi viventi. Nelle piante, è un micronutriente essenziale1 a causa del suo coinvolgimento in processi di base, come la respirazione, la fotosintesi e la clorofilla biosintesi. Elevato accumulo di ioni di ferro libero è nociva alla pianta cellule a causa di reazioni che portano alla liberazione di radicali liberi che causano stress ossidativo. Per mantenere l'omeostasi del ferro all'interno della cellula vegetale, gli ioni sono memorizzati nei vacuoli e sequestrati all'interno di ferritine, gabbie di proteina direttamente coinvolte nell' omeostasi di ferro2 e la struttura di archiviazione principale del ferro in tutti gli organismi viventi. Allo stesso tempo, l'anemia sideropenica colpisce una percentuale significativa della popolazione umana, risultante in un crescente bisogno di pianta Fe bioarricchimento. A causa delle proprietà uniche di ferritina pianta, arricchimento di cibo con ferritina-ferro offre una strategia promettente per combattere questo problema della malnutrizione3.
Gli ioni di ferro sono principalmente trovati in due stati di ossidazione, vale a dire i metalli ferrosi (ferro (II) o bivalente Fe2 + ) e ferrico (ferro (III) o trivalente Fe3 + ) forme. Diverse altre forme di ferro, come ferro cluster4, si trovano anche nelle cellule. Fe è memorizzato come ossido di ferro all'interno della cella e naturalmente ematiti forme (Fe2O3) e ferryhidrites ((Fe3 +)2O30,5 H2O) sotto condizioni fisiologiche5. Idrossidi formate in queste reazioni, soprattutto la forma ferrica, hanno solubilità molto bassa. Ritenzione di ferro conseguenza è influenzata dal pH della soluzione ed è in gran parte in uno stato solido sopra pH 56.
Considerando la scarsa solubilità e l'alta reattività del Fe, suo trasferimento tra organi e tessuti vegetali deve essere associato a molecole chelanti adatte. Inoltre, i suoi Stati redox tra i moduli ferrosi e ferrici1 devono essere controllati. All'interno di foglie, circa l'80% del ferro si trova nelle cellule fotosintetiche, a causa di suoi ruoli essenziali del sistema di trasporto dell'elettrone, nella biosintesi dei citocromi, clorofilla e altre molecole di eme e nella formazione di Fe-S cluster7. Nel caso di ferro in eccesso all'interno della cellula, l'eccedenza è traslocata nel vacuolo dove il metallo è memorizzato in molecole di ferritina8.
Ferro da stiro può essere misurata nei tessuti vegetali da diversi metodi, tra cui fiamma spettroscopia ad assorbimento atomico9 (FAAS) o saggi colorimetrici10, il primo è molto più precisa rispetto al secondo. FAAS è una tecnica estremamente precisa che consente di determinare la composizione elementare di un campione con l'emissione elettromagnetica dei singoli elementi. FAAS converte ioni metallici stati atomici di fiamma-riscaldamento del campione, che conduce agli ioni eccitazione e di emissione di una specifica lunghezza d'onda quando un determinato ione ritorna al suo stato fondamentale. Le emissioni da diversi ioni sono separate da un monocromatore e rilevate da un sensore di assorbimento11. FAAS quindi serve a quantificare direttamente le concentrazioni di ferro. Altre tecniche per la visualizzazione di ferro nei tessuti biologici sono, tuttavia, disponibili. Spettroscopia di massa del plasma ad accoppiamento induttivo (ICP-MS)12 è una tecnica molto precisa per la misurazione del ferro e altri oligoelementi, ma la mancanza di attrezzature, sia per FAAS e ICP-MS, è un problema comune. D'altra parte, misura del ferro di tiocianato colorimetria13 manca di precisione e non riesce a rilevare piccole variazioni tra campioni. 14,15,16,di colorazione blu di Prussia17 è un metodo indiretto basato sulla reazione di ferrocianuro ferrico di potassio (K4Fe(CN)6) con cationi di Fe, producendo un colore blu forte e viene utilizzato per la rilevazione qualitativa di ferro nelle sezioni istologiche dei tessuti animali e vegetali.
Ferro metallico (zero-valent) è rara nella litosfera. La forma ionica non complessato dominante di ferro nell'ambiente è principalmente dettata dalla quantità di ossigeno nei dintorni, con ferro ferroso, essendo relativamente più abbondante in ambienti anossici e ferro ferrico che predomina nei siti di aerobiche. Quest'ultima forma è anche dominante in ambienti estremamente acidi, anche se gli agenti causali di ossidazione del ferro ferroso spesso differiscono in un ambiente anossico e acide18. Quando il ferro viene solubilizzato in 4% HCl (pH 0) in un ambiente aerobico, la maggior parte del ferro diluito esiste come forma il ferrico (Fe3 +)19,20.
Le reazioni tra ioni Fe e K4Fe(CN)6 sono come segue:
Fe3 +: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2 +: 4 FeCl2 + 2K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
Nello studio presente, abbiamo chiesto se la colorazione blu di Prussia può essere utile per misurare i livelli di ferro in soluzione.
Inizialmente, abbiamo verificato la correlazione tra la concentrazione di Fe in soluzione acquosa e colorazione blu di Prussia. La concentrazione di Fe (come FeCl2, FeCl3 o una miscela di 1:1 dei due) in soluzioni acquose è stata misurata sia di assorbanza (OD) di spettroscopia atomica dopo l'aggiunta del blu di Prussia. La figura 1 Mostra le curve di regressione lineare per misurazioni ottenute da ciascun metodo. Abbiamo concluso che il metodo prussiano blu può essere utilizzato per l'analisi quantitativa della concentrazione di ferro in soluzione.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg"> Figura 1: regressione lineare tra concentrazione di Fe misurata FAAS e assorbanza della luce (OD, 715 nm) ottenuti con il metodo prussiano blu. I quadrati blu e linea rappresentano la soluzione di Fe2 + , i quadrati rossi e linea rappresentano la soluzione3 + Fe e i quadrati neri e linea rappresentano una miscela 1:1 tra Fe2 + e Fe3 +. Le regressioni seguenti sono state ottenute: [Fe2 +] = 3 + 123 x OD, r = 0,996, R2 = 0,989; [Fe3 +] = 1 + 292 x OD, r = 0,999, R2 = 0.997; e [Fe2 + 3 +] = 11 + 146 x OD, r = 0,983, R2 = 0.956. Il Fe2 + donatore era FeCl2 e il Fe3 + donatore era FeCl3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per adattare il metodo colorimetrico blu di Prussia per l'analisi quantitativa di ferro dei tessuti vegetali, il contenuto di ferro delle ceneri di foglia di tabacco è stato misurato dalla spettroscopia di assorbimento atomico di fiamma e colorazione blu di Prussia. C'era buona correlazione tra i risultati di due tecniche.

<table><tbody><tr><td>Esacianoferrato di potassio (II)</td> Fisher <td>Chemical</td><td>14459-95-1</td><td>Reagente per l'unità filtrante per siringa di miglio blu di Pussian</td></tr><tr><td>, sfiato per fiala 0,22 &mu; m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>Filtro utilizzato per filtrare le ceneri + 4% di HCl</td></tr><tr><td>Soluzione Fiale di scintillazione</td><td>Fisherbrand</td><td>03-337-4</td><td>Utilizzato per mantenere il materiale vegetale secco in polvere durante la procedura di combustione.</td></tr><tr><td>Siringa monouso 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>Siringa utilizzata durante la filtrazione</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>Utilizzata nella soluzione di HCl al 4% per diluire le ceneri e pulire i materiali</td></tr><tr><td>Tabacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN</td><td>Ottenuto dal Prof. Simon Barak e utilizzato abitualmente nel laboratorio</td> <td>ZaccaiBarak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Regolazione trascrizionale e post-trascrizionale del gene della glicolato ossidasi nelle piantine di tabacco. Biologia molecolare vegetale. 1 marzo 2001; 45(4):399-407.</td><td>Cultivar di tabacco utilizzata nel presente protocollo</td></tr><tr><td>Lana di vetro (lana di roccia)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>Utilizzato nella procedura di combustione dei campioni nel forno.</td></tr></tbody></table>

un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Ferro, uno dei più importanti micronutrienti negli organismi viventi, è coinvolto in processi di base, come la respirazione e la fotosintesi. Contenuto di ferro è piuttosto bassa in tutti gli organismi, pari a piante a circa 0,009% del peso secco. Ad oggi, uno dei metodi più precisi per misurare la concentrazione di ferro nei tessuti vegetali è fiamma spettroscopia di assorbimento atomico. Tuttavia, questo approccio è che richiede tempo e costoso e richiede attrezzature specifiche non comunemente trovate in laboratori di pianta. Pertanto, è necessario un metodo più semplice, ma preciso che può essere utilizzato regolarmente. Il metodo colorimetrico di blu di Prussia è regolarmente utilizzato per ferro qualitativo colorazione nelle sezioni istologiche di animali e vegetali. In questo studio, abbiamo adattato il metodo per la misurazione quantitativa del ferro nel tabacco lascia il blu di Prussia. Abbiamo validato la precisione di questo metodo utilizzando sia la spettroscopia atomica e blu di Prussia macchiatura per misurare il contenuto di ferro negli stessi campioni e trovato una regressione lineare (R2 = 0,988) fra le due procedure. Concludiamo che il metodo di blu di Prussia per la misurazione quantitativa del ferro nei tessuti vegetali è preciso, semplice e poco costoso. Tuttavia, la regressione lineare qui presentata non può essere appropriata per altre specie di piante, a causa di potenziali interazioni tra il campione e il reagente. Istituzione di una curva di regressione è quindi necessaria per diverse specie di piante.

Quando questo protocollo viene eseguito correttamente, si dovrebbe avere ottima correlazione tra i risultati ottenuti con i metodi di spettroscopia atomica e blu di Prussia. Pertanto, il metodo blu di Prussia può essere facilmente utilizzato per ottenere una misurazione accurata della concentrazione di ferro in campioni di piante, come risulta il seguente esperimento.
Piante di tabacco erano cresciute come descritto nel protocol...

Vi presentiamo un protocollo semplice e affidabile per misurare il contenuto di ferro nei tessuti vegetali, utilizzando il metodo colorimetrico di blu di Prussia.

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Solo dal punto di vista medico può aiutare a rispondere a una domanda chiave nel campo della biologia. Ad esempio, come possiamo quantificare facilmente il ferro nei campioni di biologia. L'obiettivo principale di questa tecnica è che è una tecnica colorimetrica facile da produrre e molto precisa.Pur preferendo questa tecnica, è necessario evitare la contaminazione da ferro. La dimostrazione visiva di questo metodo ti aiuterà a comprenderne i diversi passaggi. Per iniziare questa procedura, preparate pentole da cinque centimetri per cinque centimetri riempiendole con un normale terriccio.Pianta un seme di tabacco in ogni vaso. Trasferisci le piante in una stanza di crescita a temperatura costante, in condizioni di giornata lunga di 23 gradi Celsius. Irrigare con acqua di rubinetto fino a quando l'acqua non fuoriesce dal vaso e far crescere le piante per circa 50 giorni.Trascorso questo tempo, iniziare i trattamenti con ferro nell'irrigazione a concentrazioni adeguate all'esperimento. Irrigare le piante con questa soluzione ogni due giorni per sei-otto giorni. Quindi, stacca le foglie dal gambo a mano, facendo attenzione a non utilizzare attrezzature metalliche.Utilizzando un flacone spray riempito con acqua distillata doppia, pulire ogni foglia. Asciugare le foglie su un tovagliolo di carta, quindi trasferirle in un sacchetto di carta. Metti i sacchetti pieni di foglie in un forno, impostato a una temperatura costante di 80 gradi Celsius, per due o tre giorni.Pulire il mortaio e il pestello due volte, con una soluzione di acido cloridrico al 4%. E usa una carta da filtro per asciugare. Usando il mortaio e il pestello, schiaccia le foglie secche fino a ridurle in polvere.Quindi, trasferire la polvere in tubi di plastica sterili da 15 millilitri. Per prima cosa, pesare una nuova fiala di scintillazione da 20 millilitri sigillata senza coperchio. Prendi nota del peso o tara la bilancia.Quindi aggiungere le foglie schiacciate. Pesare il campione nella fiala e annotare il peso. Utilizzare lana di roccia per chiudere la fiala.Pesare tre fiale aggiuntive senza aggiungere campioni, da utilizzare come controlli, prendendo nota di ciascun peso. Quindi, trasferire il campione e le fiale di controllo in un forno. Brucia le foglie come indicato nel protocollo di testo.Successivamente, lasciare raffreddare i campioni a circa 100 gradi Celsius. Usando guanti pesanti e pinzette, rimuovere i campioni dal forno, assicurandosi di tenere la fiala all'esterno. Posizionare i flaconcini su una superficie piana.Togliete la lana di roccia e chiudete le fiale con i coperchi originali. Quindi, pesare le tre fiale di controllo e calcolare il loro aumento di peso medio. Se l'aumento di peso è uguale o superiore all'1% del peso della cenere, utilizzare questo valore come stima dell'errore di misurazione.Pesare un tubo di plastica da 15 millilitri. Registrare il peso o tarare la bilancia. Quindi trasferire le ceneri nel tubo.Registra questo valore, che è il peso della cenere. Quindi, aggiungi cinque millilitri della soluzione di acido cloridrico monomolare alle ceneri. Filtrare le ceneri attraverso un filtro da 22 micrometri.Quindi aggiungere altri cinque millilitri della soluzione di acido cloridrico molare attraverso lo stesso filtro, portando a un volume finale del campione di 10 millilitri. Successivamente, rimuovere quattro millilitri da ciascun campione per la misurazione mediante spettroscopia atomica. E determinare la concentrazione di ferro per grammo di cenere come indicato nel protocollo di testo.Per iniziare, aggiungere quattro grammi di ferrocianuro di potassio a 100 millilitri di acqua distillata doppia, per preparare la soluzione blu di Prussia. Vortice per mescolare e conservare a 4 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Al momento dell'uso, mescolare 50 millilitri di soluzione di blu di Prussia con 50 millilitri di acido cloridrico molare per fungere da soluzione bianca.Quindi, utilizzare una pipetta per mescolare 0,5 millilitri di un campione precedentemente ottenuto, con 0,5 millilitri di soluzione di blu di Prussia. Lasciate riposare il composto per almeno un minuto, ma per meno di cinque minuti. Trasferire questa miscela in una cuvetta e utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica a 715 nanometri.Quindi, determinare la densità ottica per grammo di cenere e tracciare la regressione lineare tra le concentrazioni di ferro, come indicato nel protocollo di testo. I risultati rappresentativi di 21 campioni di foglie di tabacco mostrano che la concentrazione di ferro nell'acqua di irrigazione ha influenzato notevolmente il contenuto di ferro nella foglia. Gli spettri di tutti i 21 campioni rappresentativi vengono quindi testati con il metodo del blu di Prussia.Come si vede qui, l'assorbanza a 715 nanometri è la lunghezza d'onda ottimale durante la misurazione di soluzioni contenenti diverse concentrazioni di ferro due e ferro tre. Una curva di regressione lineare, ottenuta tracciando i valori di concentrazione del ferro ottenuti mediante spettroscopia atomica, rispetto ai valori di assorbanza, ottenuti con il metodo del blu di Prussia, consente di analizzare nuovi campioni dello stesso tipo di pianta. Non dimenticare che lavorare con l'HCL può essere estremamente pericoloso.E le precauzioni, come la protezione degli occhi, dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura. Nella regressione lineare, è importante verificare che i risultati siano in un intervallo realistico. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aiutare i ricercatori di biologia a esplorare ulteriori piante per la produzione alimentare o il biorisanamento.

a-colorimetric-method-for-measuring-iron-content-in-plants

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

In questo video, descriviamo un metodo colorimetrico per determinare il contenuto di ferro non eme nel tessuto epatico del topo. Il bafenantrolina sulfonato viene utilizzato come substrato cromogenico in presenza di un agente riducente, che converte il ferro ferrico in ferro ferroso chelabile.

Saggio colorimetrico basato su bafenantrolina sulfonato: un metodo semplice e rapido per la quantificazione del ferro non eme nel tessuto epatico di topo

Questo video dimostra una tecnica in vitro per valutare la biodisponibilità del ferro in fonti alimentari complesse. La tecnica combina la simulazione della digestione umana con l'assorbimento del ferro da parte delle cellule Caco-2 differenziate. La formazione intracellulare di ferritina agisce come marcatore per l'assorbimento cellulare del ferro.

Biodosaggio cellulare Caco-2: un metodo in vitro per misurare la biodisponibilità del ferro in fonti alimentari complesse

Questo video descrive il metodo per quantificare i carboidrati digeribili presenti nei tessuti vegetali. Questo aiuta a raccogliere dati da vari tessuti vegetali per studiare l'ecologia nutrizionale, le interazioni pianta-erbivoro e le dinamiche della rete alimentare.

Saggio colorimetrico per la quantificazione di carboidrati non strutturali in tessuti vegetali

Abbiamo simulato un sistema di risalita marino ferruginosa Precambriano in una colonna a flusso continuo verticale la produzione su scala. L'obiettivo era quello di capire come i profili geochimici di O 2 e Fe (II) evolversi come cianobatteri producono O 2. I risultati mostrano l'istituzione di un chemoclino a causa di Fe (II) l'ossidazione da parte fotosinteticamente prodotte O 2.

Simulazione Laboratorio di ferro (II) ricchi di Precambriano Marine Upwelling sistema per esplorare la crescita di batteri fotosintetici

Questo metodo di speciazione di redox di ferro si basa sulla spettrometria di massa plasmatica accoppiata con elettroforesi capillare con impilamento del campione combinato con analisi breve in una sola esecuzione. Il metodo analizza rapidamente e fornisce bassi limiti di quantificazione per le specie di redox di ferro in una vasta gamma di tessuti e campioni di biofluidi.

Impostazione della spettrometria di massa al plasma accoppiata capillare (CE-ICP-MS) per la quantificazione delle specie di iron Redox (Fe(II), Fe(III))

Questo articolo dimostra come preparare e somministrare ferro isotopico non radioattivo legato alla transferrina per studi sul trasporto del ferro nella gravidanza del topo. Viene anche descritto l'approccio per quantificare il ferro isotopico nei compartimenti fetoplacentari.

Quantificazione del trasporto del ferro attraverso la placenta di topo in vivo utilizzando isotopi di ferro non radioattivi

Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e consolidato che può essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori.

Misurazione del contenuto di ferro non eme tissutale utilizzando un saggio colorimetrico basato su bathofenantrolina

Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la biodisponibilità del ferro (Fe) rappresenta un approccio economico e versatile per valutare la biodisponibilità del Fe da alimenti, prodotti alimentari, integratori, pasti e persino regimi dietetici. Completamente validato per studi sull'uomo, rappresenta lo stato dell'arte per gli studi sulla biodisponibilità del Fe.

Il saggio biologico delle cellule Caco-2 per la misurazione della biodisponibilità del ferro negli alimenti

Descriviamo un test fluorescente in grado di confermare in modo rapido ed economico la capacità di nuovi composti di chelare il ferro. Il test misura la capacità dei composti di superare l'attività di legame del ferro della debole sonda fluorescente chelante del ferro Calceina, con conseguente aumento quantificabile della fluorescenza quando si verifica la chelazione.

Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro 

Questo protocollo presenta metodi per valutare la distribuzione e la quantità di deposizione di ferro nei tessuti, in particolare nel cervello. Il protocollo descrive in dettaglio le procedure per la preparazione del campione, la colorazione Perls/DAB, l'acquisizione delle immagini e l'analisi dei dati.

Valutazione della deposizione di ferro nel cervello di topi 5xFAD mediante colorazione Perls/DAB

Questo lavoro ha discusso il protocollo per la progettazione e lo sviluppo di un dispositivo POCT E-Eye-Enable per rilevare Fe, Cr, As e F in campioni ambientali, campioni biologici e alimenti e bevande. Sono stati testati quasi 2000 campioni e i risultati concordano con la tecnica gold standard.

TD-DFT Tecnica avanzata di rilevamento E-Eye guidata per la quantificazione in loco di Fe, Cr, F e As nei campioni ambientali, biologici e alimentari

Scopri il metodo colorimetrico Prussian Blue per misurare il contenuto di ferro nei tessuti vegetali. Questa tecnica offre quantificazione precisa e affidabile per studi di biologia vegetale.

Un metodo colorimetrico per la misurazione del ferro contenuto nelle piante

Esplora altri video