Name: Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nellapparato circolatorio di piccoli pesci mediante linserimento di rene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Scopri una tecnica minimamente invasiva per iniettare microparticelle fluorescenti nel sistema circolatorio di zebrafish adulti tramite iniezione renale. Questo metodo consente la visualizzazione in vivo e misurazioni ripetute del pH sanguigno.

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Autori riconoscono notevolmente l'aiuto di Bogdan Osadchiy ed Evgenii Protasov (Università statale di Irkutsk, Russia) in preparazione del protocollo dei video. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione scienza russa (n. 15-14-10008) e dalla Fondazione russa per la ricerca di base (n. 15-29-01003).

Tutte le procedure sperimentali sono stati condotti in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali e sono state approvate da animale soggetti ricerca comitato di Istituto di biologia all'Università statale di Irkutsk.
1. fabbricazione di microcapsule
Nota: Microcapsule che trasportano una tintura fluorescente sono preparati utilizzando un assembly di strato dopo strato di carica opposta polielettroliti7,8. Tutte le procedure sono state effettuate a temperatura ambiente.
<ol><li>Per sintetizzare poroso CaCO3 microcarote che racchiude il colorante fluorescente, mescolare 2 mL della soluzione di SNARF-1-destrano (può essere usato più associato a polimero colorante fluorescente come FITC-BSA) ad una concentrazione di ~ 2 mg/mL con 0,6 mL ciascuna delle soluzioni di 1 mol/L di CaCl2 e Na2CO3 sotto veloce agitazione. Nota: Prestare attenzione alle diverse sensibilità di coloranti fluorescenti per photobleaching; Se viene utilizzata una sonda fluorescente sensibile alla luce (come SNARF-1), la manipolazione e lo stoccaggio delle microparticelle deve essere eseguite con come poca luce possibile.</li>
	<li>Dopo 5-10 s di agitazione, trasferire la sospensione alle provette microcentrifuga da 2 mL e centrifugare per 15 s a 10.000-12.000 g a pellet CaCO3 microcarote.</li>
	<li>Eliminare il supernatante, lavare i nuclei con ~ 2 mL di acqua deionizzata e risospendere il pellet agitando.</li>
	<li>Ripetere la procedura di centrifugazione-lavaggio tre volte in totale. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante.</li>
	<li>Incubare la microcarote per 1 min in un bagno ad ultrasuoni per ridurre la loro aggregazione. Attenzione: Non dimenticate di proteggere le orecchie con le cuffie.</li>
	<li>Per depositare il primo strato polimerico sui modelli, risospendere i nuclei in ~ 2 mL di una soluzione di 4 mg/mL di poly(allylamine hydrochloride) (PAH) in 1 mol/L NaCl.<ol>
<li>Tenere il microcarote soluzione per ~ 5 minuti con agitazione costante.</li>
		<li>Dopo 15 s di centrifugazione, scartare il surnatante con la PAH non associato. Lavare il microcarote coperto con acqua deionizzata, almeno 3 volte attraverso centrifugazione più e fasi di lavaggio. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante.</li>
		<li>Incubare la microcarote per 1 min in un bagno ad ultrasuoni per ridurre la loro aggregazione. Nota: Se il colorante fluorescente applicato è cationico, a partire da poli (4-Stirensolfonato di sodio) (PSS) in 1 mol/L NaCl (Vedi punto 1.7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere il passaggio 1.6 ~ 2 ml di una soluzione di 4 mg/mL di PSS (contenente anche 1 mol/L NaCl) per depositare il secondo strato polimerico sui modelli.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.6 e 1.7 sei volte a depositare 12 strati polimerici. Nota: Non è consigliabile prendere una lunga pausa (~ 12 h o più) nella procedura fino a ~ 3-5 strati sono stati depositati perché CaCO3 microcarote senza copertura tendono a cristallizzare. Si noti che copertura PSS provoca una maggiore aggregazione della microcarote, e la lunga pausa è consigliabile che solo quando PAH o poli-L-lisina innestato con polietilenglicole (PLL-g-PEG) è lo strato più esterno.</li>
	<li>Incubare il microcarote coperto a 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL ogni microprovetta) per almeno 2 h.<ol>
<li>Lavare il microcarote con acqua tramite centrifugazione sequenziale e passaggi di risospensione. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per ottenere cavità microcapsule, sciogliere i CaCO3 modelli con l'aggiunta di 2 mL di 0,1 mol/L acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) soluzione acida (regolata a pH 7,1 con NaOH) per il microcarote coperto.<ol>
<li>Dopo ~ 5 min di incubazione, centrifugare le microcapsule per 45 s e scartare il surnatante con l'EDTA.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 1.10-1.10.1 due volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le microcapsule con 0,9% NaCl tre volte attraverso centrifugazione più passi entro 45 s seguita da fasi di lavaggio. Dopo l'ultimo passo di centrifugazione, scartare il surnatante. Nota: La soluzione finale microcapsule iniettabile deve essere mantenuta sterile (ad esempio con l'aggiunta di ampicillina, 0,1 mg/mL), e i media dovrebbero essere biocompatibili con l'oggetto di indagine (isotonica media con pH neutro).</li>
	<li>Stimare la concentrazione di microcapsule preparate in un emocitometro sotto un microscopio a fluorescenza. Prendere una serie di immagini di microcapsule, misurare il diametro di circa un centinaio di microcapsule usando ImageJ9 o equivalente software e indagare la distribuzione di dimensione utilizzando un istogramma.</li>
	<li>Archivio ottenuto incapsulato sonda al buio. Nota: dopo diversi lavaggi in sterile 0,9% NaCl, le microcapsule possono essere conservate per mesi a 4 ° C. Si consiglia di non completa essiccazione delle microcapsule durante la conservazione.</li>
</ol>2. preparazione del Setup ottico e calibrazione di microincapsulati SNARF-1
Nota: Misure di pH ruvido con microincapsulati SNARF-1 può essere fatta utilizzando immagini in due canali di un microscopio a fluorescenza7, ma in questo protocollo un microscopio a fluorescenza un canale collegato ad uno spettrometro di fibra è stato applicato.
<ol><li>Inserire il corretto set di filtri di fluorescenza al microscopio fluorescente secondo le caratteristiche del colorante fluorescente applicata e accendere la lampada fluorescente.<ol>
<li>Estrarre la leva per gli oculari. Attenzione: Luce in eccesso può danneggiare la matrice di spettrometro. Così, assicurarsi che la leva sia in modalità "oculare", quando non viene utilizzato lo spettrometro.</li>
		<li>Collegare un'estremità della fibra ottica per lo spettrometro e l'altra estremità a un collimatore. Utilizzando adattatori, posizionare il collimatore nella messa a fuoco del tubo fotocamera o altra porta disponibile del microscopio fluorescente.</li>
		<li>Accendere lo spettrometro. Eseguire il programma di controllo di spettrometro e tarare lo spettrofotometro per misure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la calibrazione del batch microcapsule, mettere ~ 5 µ l della sospensione di microcapsule (microcapsule ~ 10 000 per µ l in acqua deionizzata) su un vetrino da microscopio e asciugare la goccia in un luogo buio (ad esempio, in un termostato a 35 ° C).<ol>
<li>Per calibrare le caratteristiche spettrali del microincapsulati SNARF-1, è possibile utilizzare una serie di buffer con diversi gradi di pH nell'intervallo ~ 6-9. Goccia ~ 10 µ l di un tampone sulle microcapsule secche con SNARF-1-destrano e coprire con un vetrino coprioggetti.</li>
		<li>Porre il vetrino di vetro sulla fase di microscopio. Individuare le microcapsule usando un obiettivo di 40 ×.</li>
		<li>Ruotare la leva di microscopio alla porta macchina fotografica. Registrare loro fluorescenza con lo spettrometro. Ruotare la leva indietro verso gli oculari. Nota: Assicurarsi che il segnale spettrale è ben oltre il livello di sfondo e garantire che le microcapsule nel campo di vista non sono in una bolla (passando ad un ingrandimento minore se necessario). Evitare illuminazione prolungata di microcapsule stesse. SNARF-1 è sensibile al photobleaching.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 2.2.3 per diversi microcapsule 10 - 15 volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcolare i rapporti di picchi di fluorescenza (ad esempio, utilizzando R o Scilab) per tutti gli spettri registrati e determinare la retta di regressione tra il rapporto mediano (per ogni buffer) e pH medio utilizzando la seguente formula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> Nota: SNARF-1 ha uno spettro con due picchi corrispondenti all'emissione della tintura protonata e deprotonato, e il rapporto tra le cime è sensibile al pH del mezzo. In questo studio, il rapporto tra l'intensità di fluorescenza per 605 e 660 nm viene utilizzato. Queste lunghezze d'onda vengono scelti a seconda del filtro utilizzato. a e b sono coefficienti da determinarsi di regressione non lineare (ad esempio, utilizzando R). Valori 0,15 e 1.1 sono, rispettivamente, i valori minimi e massimo di ho605/I660 osservati durante la calibrazione.</li>
	<li>Raccogliere circa 10 µ l di sangue di pesce da circa 5 animali adulti. Pesce posto in una capsula di Petri con 1 µ l/mL sospensione di olio di chiodi di garofano per anestesia di acqua e attendere che l'animale si trasforma sul suo lato e si blocca a pizzichi della pinna (solitamente ~ 2-3 min). Trasferire il pesce su un vetrino. Tagliare la coda di pesce con un bisturi e raccogliere circa 2 µ l di sangue di pesce da vena caudale. Nota: Per evitare la coagulazione del sangue, trattare l'incisione con l'eparina (5000 U/mL) e utilizzare tubi capillari in vetro eparinizzata e tubi per microcentrifuga per raccogliere il sangue.<ol>
<li>Circa 10 µ l di sangue con una pipetta sulla punta del microelettrodo a goccia e determinare il pH utilizzando un pH-metro.</li>
		<li>Goccia di sangue su un vetrino con microcapsule secchi e registrare il rapporto tra l'intensità della fluorescenza come descritto per i buffer di calibrazione (punti 2.2-2.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regolare il coefficiente lineare della curva di calibrazione per rendere la curva corrispondono le misurazioni nel sangue di pesce (per maggiori dettagli vedere Borvinskaya et al 20175).</li>
</ol>3. preparazione iniettabile
<ol><li>Rilasciare l'ago in acciaio dalla punta della penna dell'insulina (o siringa) rimuovendo la plastica con un bisturi affilato. Nota: Qualsiasi ago sottile (Ø0.33 mm o meno) o capillare di vetro (solitamente Ø1 mm) può essere preparato per microiniezione10,11.</li>
	<li>Inserire l'ago a metà del vetro microcapillary; rapidamente e delicatamente solder utilizzando un cannello a gas.</li>
	<li>Collegare il vetro microcapillary per la microinjector e sciacquarlo con acqua sterile tre volte. Assicurarsi che il liquido fluisce attraverso l'ago.</li>
	<li>Riempire l'impianto con acqua distillata. Nota: Assicurarsi che non ci siano bolle nel sistema.</li>
</ol>4. iniezione
<ol><li>Risospendere la soluzione ricostituita di microcapsule (in sterile 0,9% NaCl, o qualsiasi altro supporto utilizzato per le iniezioni, con una concentrazione di 0,5 a 6 milioni di microcapsule per microlitro) utilizzando il bagno a ultrasuoni per 1 min. Nota: Poiché le microcapsule tendono a precipitare, durante l'iniezione seguente, agitare il flaconcino con le microcapsule meccanicamente (tramite un rotore) o manualmente ogni pochi minuti per risospendere li e prevenire la loro aggregazione.</li>
	<li>Mettere il pesce in una capsula di Petri con anestetico (0,1 mL/L di olio di chiodi di garofano sospesa in acqua) per ~ 2-3 min. attendere che il pesce gira su un fianco e si blocca a un leggero pizzico della pinna.</li>
	<li>Usando un cucchiaio, trasferire il pesce fuori l'anestetico e inserirlo delicatamente su una spugna umida in posizione laterale con la testa verso sinistra (per destri) o verso destra (per persona di sinistra).</li>
	<li>Appena prima dell'iniezione, succhiare 1-2 mm di aria nel vetro capillare collegato con microinjector. Poi, caricarlo con circa 2 µ l di microcapsule dispersione. Nota: Prima dell'iniezione, la soluzione di microcapsule deve essere regolata alla temperatura a cui sono tenuti i pesci.</li>
	<li>Delicatamente e stabilizzare il corpo del pesce sulla spugna con mano non dominante.<ol>
<li>Trovare la linea laterale dei pesci. Selezionare mentalmente un segmento che si estende dall'opercolo fino alla fine della cavità addominale. Trovare la metà di questo segmento. Mettere l'ago 1 mm inferiore in direzione ventrale.</li>
		<li>Con un movimento di raschiatura, muovete delicatamente il pesce scale da parte e fare una puntura. Inserire l'ago nel corpo ad un angolo di 45° verso la superficie del tavolo.</li>
		<li>Spingere l'ago verso la spina dorsale fino a posizionarla con attenzione contro di esso.</li>
		<li>Circa 1 µ l di sospensione delle microcapsule di rilascio nel rene e ritirare lentamente l'ago. Nota: Per trovare il sito di puntura corretto più facilmente, è utile alla pratica trovando il rene di tronco di transilluminating i pesci usando una luce di fondo, come mostrato in Figura 2A e 2B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sciacquare il pesce dalla testa alla coda con un flusso di acqua per rimuovere qualsiasi microcapsule versati al sito di iniezione.</li>
</ol>5. visualizzazione in Vivo
<ol><li>Utilizzare le forbici di dissezione per rimuovere il coperchio di gill dalla testa del pesce e denudare le branchie di pesce. Sciacquare le branchie con acqua.</li>
	<li>Usando un cucchiaio, trasferire il pesce a un vetrino da microscopio e posizionarlo sul palco del microscopio fluorescente. Nota: Assicurarsi che le branchie dei pesci non asciugarsi durante le procedure successive. Per evitare questo problema, periodicamente di bagnarli con acqua usando una pipetta di Pasteur (circa ogni 1-2 min).</li>
	<li>Oscurare la stanza e utilizzando basso ingrandimento (x 10 obiettivo) ispezionare le branchie per trovare le microcapsule fluorescente. Nota: Quando la procedura viene utilizzata per l'introduzione di alcune particelle fluorescenti nel sistema circolatorio di pesce, si consiglia di ispezionare le branchie di parecchi individui per particelle fluorescenti impreviste prima iniezioni. Branchie di selvaggio-tipo zebrafish non hanno autofluorescenza, ma in alcuni casi sporadiche particelle fluorescenti (come pezzi di cibo o simbionti unicellulari) possono essere presenti sulle branchie. Se necessario, tali particelle possono essere riconosciute sulla loro forma specifica base (ad esempio, pezzi di cibo hanno forma irregolare, a differenza di microcapsule sferiche) o dello spettro di fluorescenza (cioè, colori).<ol>
<li>Passare la lente di una magnitudo superiore (obiettivo × 40) e posizionare un microcapsule o un gruppo di microcapsule al centro del campo visivo.</li>
		<li>Ruotare la leva alla porta con uno spettrometro connesso. Registrare il segnale spettrale.</li>
		<li>Ruotare la leva indietro verso l'oculare.</li>
		<li>Ripetere le misurazioni per diversi microcapsule diverse volte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire i pesci nell'acquario con adeguata aerazione per il recupero. Nota: Con la minima pratica, è possibile effettuare l'iniezione e il segnale di registrazione a un ritmo approssimativo di 2-3 min per pesce. La misura può essere ripetuta per una individuale più volte con l'uso di dosi ripetute di basse, innocue di anestesia o un altro metodo di fissazione. Per l'osservazione a lungo termine, è necessario utilizzare un sistema con anestesia continua12.</li>
</ol>

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<li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Per dimostrare l'iniezione di microparticelle in zebrafish rene, abbiamo usato semipermeabile microcapsule caricati con un colorante indicatore. Così, il protocollo contiene le istruzioni per la fabbricazione di microcapsule usando l'Assemblea strato dopo strato di carica opposta polielettroliti7,8,15,16,17 ,18 (<strong clas...

La somministrazione di particelle micro-dimensione in un organismo animale è un compito importante in tali zone come droga e vaccino consegna1, sistema vascolare visualizzazione2, cellula transgenica impianto3e l'impianto piccolo sensore ottico 4 , 5. Tuttavia, la procedura di impianto per le particelle di Microscala nel sistema vascolare di piccoli animali da laboratorio è difficile, soprattutto per gli organismi acquatici delicati. Per campioni di ricerca popolari come zebrafish, è consigliabile che queste procedure essere chiarita mediante protocolli dei video.
Microiniezioni intracardiache e capillare richiedono personale qualificato e servizi di microchirurgia unico per la consegna dei microobjects nel sangue di zebrafish. In precedenza, un' iniezione manuale retro-orbitale3 è stato suggerito come un metodo facile ed efficace per la somministrazione di cellule intere. Tuttavia, nella nostra esperienza, a causa della piccola zona della rete capillare occhio, ci vuole molta pratica per ottenere il risultato desiderato da questa tecnica.
Qui, descriviamo un metodo per l'impianto di microparticelle solide ed efficienti nell'apparato circolatorio di iniezione manuale direttamente nel tessuto del rene di zebrafish adulto, che è ricca di vasi capillari e vasi renali. Questa tecnica si basa sul protocollo dei video per trapianto di cellule in zebrafish rene6, ma sono stati eliminati i passaggi di microsurgical traumatici e che richiede tempo. Il metodo proposto è caratterizzato da bassa mortalità (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili.
Una parte importante del protocollo proposto è la visualizzazione delle impiantato microparticelle (se sono fluorescenti o colorato) nei capillari gill, che permette di verificare la qualità di iniezione, una valutazione relativa approssimativa del numero di particelle iniettate e la rilevazione del segnale spettrale per misurazioni fisiologiche direttamente dal sangue circolante. Come esempio delle possibili applicazioni della tecnica descritta, dimostriamo il protocollo per in vivo misure di pH del sangue di zebrafish usando una sonda fluorescente microincapsulata, SNARF-1, originariamente suggerito nel Borvinskaya et al. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-destrano, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Sonda fluorescente. Qualsiasi altro colorante fluorescente legato al polimero appropriato può essere utilizzato come riempitivo per microcapsule</td></tr><tr><td>Coniugato di isotiocianato di albumina-fluoresceina (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Sonda fluorescente</td></tr><tr><td>Isotiocianato di rodamina B-destrano (RITC-destrano)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Sonda fluorescente</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>Formazione</td></tr> <tr><td>di modelli CaCO3Carbonato di sodio</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO3 modelli</td></tr> di <tr><td>formazione Poli(allilammina cloridrato), MW 50000 (IPA)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Polimero cationico</td></tr><tr><td>Poli(sodio 4-stirensolfonato), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Polimero anionico</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina [20 kDa] innestato con polietilenglicole [5 kDa], g = da 3,0 a 4,5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)- g[3.5]-PEG(5)</td><td>Polimero finale per aumentare la biocompatibilità delle microcapsule</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>Per sciogliere i polimeri applicati Sistema</td></tr> di <tr><td>purificazione dell'acqua</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>Per preparare acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>Stegler</td><td></td><td>Per la formazione</td></tr> <tr><td>di modelli CaCO3Eppendorf&nbsp; Ricerca&nbsp; più pipetta, 1000 & micro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Soluzioni di dosaggio</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Ricerca&nbsp; più pipetta, 10 & micro; L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Soluzioni di dosaggio</td></tr><tr><td>Puntali per pipette, gamma di volume da 200 a 1000 &; L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Soluzioni di dosaggio</td></tr><tr><td>Puntali per pipette, gamma di volume 0,1-10&nbsp; &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Soluzioni di dosaggio</td></tr><tr><td>Mini-centrifuga Microspin 12, BioSan</td><td></td><td></td> ad alta velocità <td>Per la procedura di centrifugazione-lavaggio delle microcapsule</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Sintesi e conservazione delle microcapsule</td></tr><tr><td>Agitatore Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>Per ridurre l'aggregazione delle microcapsule</td></tr><tr><td>Pulitore</td><td></td><td></td><td>ad ultrasuoni Per ridurre l'aggregazione delle microcapsule</td></tr><tr><td>Cuffie</td><td></td><td></td><td>Per proteggere le orecchie dagli ultrasuoni</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>Per sciogliere i modelli CaCO3</td></tr><tr><td>Fosfato monosodico</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Preparazione di tamponi pH</td></tr><tr><td>Fosfato disodico</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Preparazione di tamponi pH</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>Per regolare il pH della soluzione di EDTA e dei tamponi</td></tr><tr><td>Camera termostatica</td><td></td><td></td><td>Per essiccare le microcapsule su un vetrino di vetro</td></tr><tr>Camera <td></td><td></td> per<td>la conta delle cellule del sangue dell'emocitometro</td><td>Per studiare la distribuzione dimensionale e la concentrazione delle microcapsule preparate</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>Visualizzazione in vivo delle microcapsule nel sangue</td></tr> <tr><td>dei pesciSet di filtri fluorescenti per SNARF-1 (da scegliere in base al modello di microscopio; l'esempio è fornito)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualizzazione di microcapsule con sonde fluorescenti</td></tr><tr><td>Spettrometro a fibra QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Calibrazione di microcapsule al microscopio</td></tr><tr><td>Fibra ottica QP400-2-VIS NIR, 400 &mu; m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td>Per collegare lo spettrometro con la</td><td></td> porta del microscopio</tr><tr><td>Collimatore F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Per collegare lo spettrometro con la porta del microscopio</td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Calibrazione di microcapsule al microscopio</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Calibrazione di microcapsule al microscopio</td></tr><tr><td>Microcapillari in vetro Intra MARK, 10 &micro; L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>Per raccogliere il sangue di pesce</td></tr><tr><td>Olio di chiodi di garofano</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Anestesia di pesce</td></tr><tr><td>Lancetta n. 11</td><td>Apexmed international BV</td><td>P00588</td><td>Per tagliare la coda di pesce e rilasciare l'ago d'acciaio dalla punta dell'autoiniettore di insulina</td></tr><tr><td>Eparina, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>Per il trattamento di tutte le superfici che vengono a contatto con il sangue di pesce durante la raccolta del sangue di pesce</td></tr><tr><td>Seven, 2 Go Pro pH-meter con un microelettrodo</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Per determinare il pH del sangue di pesce</td></tr><tr><td>Aghi per penna per insulina Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>Per la procedura di iniezione. Qualsiasi ago sottile (&Oslash; 0,33 mm o meno) è appropriato</td></tr><tr><td>Capillari di vetro, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co</td><td>9201075</td><td>Per la procedura di iniezione</td></tr><tr><td>Torcia</td><td></td><td></td><td>a gas Per saldare l'ago d'acciaio al capillare di vetro</td></tr><tr><td>Microiniettore IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>Per il dosaggio preciso di microcapsule in sospensione</td></tr><tr><td>Piastre di Petri, 60 mm x 15 mm, polistirene</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>Per manipolazioni con pesci sotto anestesia</td></tr><tr><td>Cucchiaio</td><td></td><td></td> <td>di plasticaPer manipolazioni con pesci in anestesia</td></tr><tr><td>Spugna</td><td></td><td></td> umida <td>Per manipolazioni con pesci in anestesia</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>Per rimuovere il coperchio branchiale dalla testa del pesce</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur, 3,5 mL</td><td>MARCA</td><td>Z331767</td><td>Per inumidire le branchie dei pesci</td></tr></tbody></table>

amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

La somministrazione sistemica di particelle micro-dimensione in un organismo vivente può essere applicata per la visualizzazione del sistema vascolare, droga e distribuzione del vaccino, l'impianto di cellule transgeniche e piccoli sensori ottici. Tuttavia, microiniezioni endovenosa in piccoli animali, che sono principalmente utilizzati nei laboratori biologici e veterinari, sono molto difficili e richiedono personale qualificato. Qui, dimostriamo un metodo robusto ed efficiente per l'introduzione di microparticelle nell'apparato circolatorio di adulto zebrafish (Danio rerio) tramite l'iniezione nel rene pesce. Per visualizzare le microparticelle introdotte nel sistema vascolare, vi proponiamo una semplice tecnica di imaging videomicroscopia nelle branchie di pesce. In vivo monitoraggio del pH del sangue di zebrafish è stato compiuto usando un fluorescente microincapsulati iniettato sonda, SNARF-1, per dimostrare una delle possibili applicazioni della tecnica descritta. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di incapsulamento di pH sensibili colorante e dimostra i principi dell'iniezione rapida e la visualizzazione di microcapsule ottenute per registrazione in vivo del segnale fluorescente. Il metodo proposto di iniezione è caratterizzato da un tasso di mortalità basso (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili. Tutte le procedure descritte possono essere eseguite su altre specie di piccoli pesci, come i guppies e medaka.

I risultati ottenuti provengono da una delle tre principali categorie del protocollo presentato: la formazione di microparticelle fluorescenti di incapsulamento di un colorante fluorescente (Figura 1), l'iniezione di rene di microcapsule con ulteriore visualizzazione in Gill capillari (Figura 2 e 3) e, infine, la in vivo spettrale registrazione della fluorescenza di SNARF-1 per il monito...

Questo articolo illustra i principi di un'iniezione rapida, come minimo dilagante di microparticelle fluorescenti in circulatory system di piccoli pesci e la visualizzazione in vivo delle microparticelle in sangue di pesce.

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una tecnica per l'introduzione di microparticelle nel sistema circolatorio del pesce zebra adulto mediante iniezione nel rene del pesce. Le microparticelle introdotte vengono ulteriormente visualizzate nel sistema vascolare mediante una semplice tecnica di imaging intravitale nelle branchie dei pesci. Questa procedura può essere utilizzata, ad esempio, per effettuare misurazioni ripetute del pH del sangue di pesce in vivo mediante l'introduzione di sonde fluorescenti microincapsulate per il pH.Per fare ciò, nella prima fase, il colorante sensibile al pH SNARF-1 coniugato con destrano viene incapsulato nel guscio di polielettrolita semipermeabile utilizzando l'approccio strato per strato. Il colorante fluorescente viene co-precipitato in micronuclei porosi di carbonato di calcio e i nuclei sono rivestiti con strati multipli di polimeri non biodegradabili caricati in modo opposto e rivestiti con un polimero biocompatibile contenente polietilenglicole. Successivamente, i nuclei di carbonato di calcio vengono risolti per ottenere intere microcapsule che racchiudono SNARF-1.Nella seconda fase dell'anestesia e della fissazione del pes

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Qui vi mostriamo come fare retro-orbitale iniezione in zebrafish adulti.

Retro-orbitale iniezione in Zebrafish adulti

Descriviamo una tecnica di microinjecting l'aminoglicoside, gentamicina, in 2 giorni dopo fetilization (DPF) larve di zebrafish per indurre danno renale acuto (AKI). Abbiamo anche descritto un metodo per intero immunoistochimica montaggio, plastica embedding e sezionamento delle larve di zebrafish per visualizzare il danno mediato AKI.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

Questo video dimostra la microiniezione endovenosa di nefrotossine nella vena caudale di un embrione di zebrafish per studiare i loro effetti chimici sulla funzione renale.

Microiniezione endovenosa di nefrotossine nell'embrione di zebrafish: una tecnica per rilasciare agenti nefrotossici nel flusso sanguigno dell'embrione di zebrafish

Il metodo descritto qui permette l'analisi time-lapse di sviluppo degli organi in embrioni di zebrafish utilizzando un microscopio a fluorescenza dissezione in grado di eseguire sezionamento ottico e semplici strategie di riadattamento per correggere la deriva focale e planare.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

lesioni renali sostenuti da nefrotossine, che comprendono farmaci che vanno dagli antibiotici ai chemioterapici, può portare a disturbi complessi, la cui patogenesi rimane completamente sconosciuto. Questo protocollo dimostra come zebrafish può essere utilizzato per la malattia modellazione di queste condizioni, che possono essere applicati alla individuazione di misure renoprotettivi.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Vi presentiamo uso di microscopia di 2 fotoni per posizionare una micropipetta all'interno dello spazio urinario di Bowman in topi, che unisce 2 tecniche fondamentali della fisiologia renale. Uso di microscopia di 2 fotoni supera i limiti critici di microscopia convenzionale per micropuntura studi di fisiologia renale.

Micropuntura dello spazio di Bowman in topi nei paraggi 2 Photon microscopia

Questo metodo si basa sull'iniezione di 0,5 − 3 μL di soluzione nel torace di zebrafish adulto. La procedura trasporta efficacemente proteine e composti chimici nella vicinanza del cuore del pesce zebra senza danneggiare l'organo. L'approccio è adatto per testare gli effetti di fattori esogeni su vari tessuti del cuore.

Iniezione intrathoracica per lo studio del cuore di zebrafish adulto

Viene descritto un nuovo metodo di iniezione intraperitoneale (IP) nel pesce zebra adulto. Quando si maneggiano composti tossici come la doxorubicina, questa procedura è più efficace dei due metodi IP precedentemente riportati. La tecnica è progettata per essere facilmente adottata da ricercatori con esperienza limitata nel modello del pesce zebra.

Una tecnica di iniezione intraperitoneale nel pesce zebra adulto che riduce al minimo i danni al corpo e la mortalità associata

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato ed efficace per l'iniezione endovenosa di cellule o agenti farmacologici in zebrafish adulto, con conseguente aumento dell'attecchimento cellulare e aumento dei tassi di sopravvivenza del zebrafish trattato.

Iniezione endovenosa ottimizzata nel pesce zebra adulto

Scopri una tecnica minimamente invasiva per iniettare microparticelle fluorescenti nel sistema circolatorio di zebrafish adulti tramite iniezione renale. Questo metodo consente la visualizzazione in vivo e misurazioni ripetute del pH sanguigno.

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nellapparato circolatorio di piccoli pesci mediante linserimento di rene (Video) | JoVE Journal

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

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