Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

L'obiettivo di questo protocollo è sequenziare il genoma di un organismo microscopico chiamato tardigradi. Abbiamo stabilito un metodo per sequenziare il genoma di un tardigrado, Hypsibius dujardini, da un singolo campione con un minimo di 50 picogrammi di DNA genomico con un'applicazione dell'intero genoma. Dopo aver isolato un singolo tardigrado, riduciamo al minimo la contaminazione batterica utilizzando antibiotici e l'ispezione visiva.

Abbiamo anche utilizzato due metodi di omogeneizzazione. Il primo e il più comunemente usato nei C.elegans che utilizzano cicli di congelamento e scongelamento e, in secondo luogo, una frantumazione manuale del tardigrado con la punta di una pipetta. Il DNA viene quindi utilizzato per costruire una libreria di sequenziamento e quindi sequenziato in uno strumento MiSeq.

Un riassunto generale del protocollo. Dopo l'isolamento di un singolo individuo, viene sottoposto a tre cicli di congelamento e disgelo per l'omogeneizzazione. Il DNA genomico viene estratto e purificato e viene frammentato mediante sonicazione.

Quindi viene costruita una libreria di sequenziamento e, dopo la convalida della distribuzione delle dimensioni della libreria, viene sequenziata con uno strumento di sequenziamento. Preparare il gel di agarosio al 2% utilizzando acqua distillata come solvente in un piatto di coltura di plastica da 90 millimetri e 10 millimetri di penicillina streptomicina all'1% con acqua distillata. Il gel può essere conservato per due o tre settimane in un'incubatrice impostata a 18 gradi.

Raccogli un singolo tardigrado e mettilo sulla piastra di agar preparata e lavalo con acqua distillata due o tre volte per rimuovere le particelle rimanenti. Mettere il singolo tardigrado negli antibiotici penicillina streptomicina per due o sei ore per rimuovere la contaminazione batterica e posizionare l'animale decontaminato su un vetrino pulito utilizzando una pipetta P10. Osserva il tardigrado al microscopio a un ingrandimento di 500 volte e conferma che non ci sono batteri rimasti.

Raccogliere l'individuo utilizzando una pipetta P10 con un massimo di cinque microlitri di liquido e metterlo in una provetta PCR a basso legame e rimuovere il liquido in eccesso il più possibile. Omogeneizzazione ed estrazione del DNA. Omogeneizzare l'animale per ottenere il DNA genomico con uno dei seguenti metodi.

Omogeneizzazione con cicli di gelo e disgelo. Immediatamente dopo il passaggio 2.5, aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi alla provetta PCR contenente il tardigrado. Metti la provetta PCR nell'azoto liquido per 10 minuti e passa a un blocco termico, riscalda a 37 gradi per 10 minuti.

Ripeti questo passaggio tre volte. Frantumazione manuale. Sotto uno stereomicroscopio, schiacciare l'individuo con una punta di pipetta P10 premendo l'animale contro la parete della provetta PCR e aggiungere immediatamente 100 microlitri di tampone di lisi.

Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente affinché avvenga la lisi. Trasferire l'intero volume della miscela di lisi in una microprovetta pulita da 1,5 millilitri a basso legame. Aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi alla provetta per PCR a basso legante, che viene utilizzata per l'omogeneizzazione ed è ora vuota.

Dopo il pipettaggio, trasferire la miscela in una microprovetta a basso legame da 1,5. Ripetere questo passaggio due volte. Aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi a una provetta per PCR a basso legame e, dopo il pipettaggio, spostare la miscela in una microprovetta a basso legame da 1,5 millilitri.

Aggiungere il totale di 600 microlitri di miscela di lisi alla colonna di centrifuga posta nella provetta di raccolta e centrifugare a 10.000 G per un minuto. Riapplicare il flusso attraverso la colonna e centrifugare a 10.000 G per un minuto. Questo passaggio è fondamentale per garantire che la maggior parte del DNA genomico sia legato alla colonna.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio alla colonna di centrifuga e centrifugare a 10.000 G per un minuto. Trasferire la colonna di centrifuga in una microprovetta pulita da 1,5 millilitri. Applicare 20 microlitri di 10 millimolari di primo LCA sulla colonna di centrifuga e attendere cinque minuti a temperatura ambiente.

Centrifugare a 10.000 g per un minuto. Il tampone di diluizione non deve contenere EDTA, poiché interferisce con gli enzimi della preparazione in laboratorio. Riapplicare il flusso attraverso la colonna di centrifuga e, dopo cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare per un minuto a 10.000 G.

Frammentazione del DNA. Trasferire 15 microlitri di DNA genomico eluito in una microprovetta da 15 microlitri per la frammentazione del DNA e centrifugare per un minuto utilizzando una centrifuga da tavolo. Frammentare il DNA genomico in 550 coppie di basi.

Dopo il pipettaggio, trasferire 10 microlitri di miscela di DNA frammentato in una provetta PCR pulita e a basso legame. L'esperimento può essere interrotto qui. Conserva il DNA a quattro o meno 20 gradi.

Sequenziamento della costruzione della libreria. È assolutamente fondamentale utilizzare il kit specificato nelle seguenti procedure, a causa del basso input del DNA. Preparare i reagenti necessari, seguendo il protocollo del produttore, e costruire la libreria di sequenziamento senza alcuna modifica.

Dopo aver applicato la miscela di amplificazione della libreria a una miscela di sintesi della libreria, eseguire la reazione PCR in un termociclatore. La reazione PCR è stata condotta come mostrato. Purificazione della reazione PCR.

Aggiungere 50 microlitri di microsfere magnetiche e pipettare 10 volte e centrifugare brevemente con una microcentrifuga da tavolo. Incubare per due minuti a temperatura ambiente. Incubare su supporto magnetico per cinque minuti, o fino a quando la soluzione diventa completamente limpida, e rimuovere il surnatante.

Seguire il protocollo del produttore. Trasferire il surnatante senza disturbare il pellet in una nuova provetta per PCR a basso legante. Controllo e quantificazione della qualità del DNA e sequenziamento.

Validazione della distribuzione dimensionale della libreria di DNA. Aggiungere tre microlitri di acqua campione con un microlitro di libreria di sequenziamento, mescolare accuratamente per un minuto con un vortice e centrifugare brevemente con una centrifuga da tavolo. Esegui l'elettroforesi e convalida la distribuzione delle dimensioni della libreria con il software associato.

Il picco del frammento principale dovrebbe variare da circa 300 a 1.000 coppie di basi. Quantificazione del DNA. Aggiungere 796 microlitri di tampone soluzione e quattro microlitri di reagente di fluorescenza e mescolare accuratamente.

Erogare 190 microlitri della soluzione di lavoro in due provette per il saggio e 197 microlitri in una provetta per il test. Aggiungere 10 microlitri di standard con concentrazioni note di DNA a ciascuna provetta contenente 190 microlitri di soluzione di lavoro e tre microlitri della provetta preparata per la libreria contenente 197 microlitri di soluzione di lavoro. Agitare brevemente e centrifugare sulla centrifuga da tavolo.

Quantificare il DNA utilizzando un fluorimetro con impostazioni di tre microlitri. Sequenziamento della libreria del DNA. Preparare la libreria di sequenziazione in base al protocollo del produttore.

Inserire la cassetta dei reagenti e la cella di flusso nello strumento di sequenziamento e inserire le informazioni sull'esecuzione del sequenziamento, seguendo il protocollo del produttore. Eseguire la sequenziazione. Risultati rappresentati.

L'esposizione ai contaminanti nell'estrazione di DNA di alta qualità rimane il punto critico del nostro protocollo. Per esaminare visivamente se sono contaminanti, abbiamo incubato il tardigrado in antibiotici, che sono penicillina e streptomicina, e abbiamo anche esaminato l'individuo sotto un microscopio 500 volte. Come mostrato qui, i microbi visibili intorno ai tardigradi sono completamente illuminati.

A seguito di un'efficiente omogeneizzazione, estrazione del DNA, frammentazione e preparazione della libreria. La distribuzione dimensionale della libreria è convalidata utilizzando un'elettroforesi ad alta sensibilità per il controllo di qualità. Le linee viola e verde indicano i marcatori superiore e inferiore rispettivamente a 1, 500 e 25 paia di basi.

La corsia L è un segnavia a scala, la corsia S e da N1 a N4 sono cinque repliche dello stesso esperimento, tutte a partire da un singolo esemplare di tardigrado. Come si può vedere dall'ampia uniforme e dalla distribuzione tra 200 e 1.000 coppie di basi, il nostro protocollo è altamente riproducibile, anche con l'input ultra-basso. Ecco il risultato di un controllo qualità veloce, per letture sincronizzate ottenute da una singola esecuzione di sequenziamento.

Le letture sono ottenute come estremità di riserva di 300 coppie di basi, dove le letture in avanti e all'indietro sono mostrate rispettivamente in alto e in basso. La distribuzione mostrata qui è tipica di 300 letture finali di coppie, con chiamate di base di altissima qualità superiori a Q30 per le prime 200 coppie di basi e gradualmente in calo fino alla fine. Quindi questo metodo utilizza solo un singolo individuo per un campione.

Non ci sono requisiti di grandi quantità di animali, come quelli richiesti nei precedenti progetti di sequenziamento del genoma dei tardigradi. I metodi di coltura per la maggior parte dei tardigradi non sono ancora stati stabiliti. Pertanto, consentire il sequenziamento genomico di un singolo individuo, come quelli direttamente dal lavoro sul campo, avrà un grande impatto sulla biologia molecolare dei tardigradi e possibilmente per altri piccoli animali.

I nostri metodi di sequenziamento del DNA consentono di analizzare altri numerosi organismi microscopici che non sono ancora stati sequenziati, come rare specie di panace, nematodi, abeti d'acqua e altre opzioni, collegando la parte delle zone e un'area pubblica più ampia, favorendo l'ambiente in cui possono essere possibili vari meccanismi biologici.