Name: Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri la preparazione di librerie per il sequenziamento del genoma di Hypsibius dujardini a partire da un singolo esemplare. Questo metodo riduce i rischi di contaminazione batterica e consente l'analisi genomica con quantità minime di DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Nozomi Abe, Yuki Takai e Nahoko Ishii per il loro supporto tecnico nel sequenziamento genomico. Quest'opera è stata sostenuta di sovvenzione per la società del Giappone per la promozione della scienza (JSPS) Research Fellow, sovvenzione dai KAKENHI per giovani scienziati (No.22681029) e KAKENHI sovvenzione per la ricerca scientifica (B), no. 17 H 03620 da JSP, da un Sovvenzione per progetti di ricerca di scienza base da The Sumitomo Foundation (No.140340) e in parte da fondi di ricerca dal governo della Prefettura di Yamagata e città di Tsuruoka, Giappone. Chlorella vulgaris utilizzata per alimentare i tardigradi è stato fornito per gentile concessione di clorella Industry Co. Ltd.

1. preparazione
<ol><li>Preparare il gel di agarosio al 2% utilizzando acqua distillata (DW) come il solvente contenuto in una piastra di coltura plastica 90 mm e 10 mL di una cocktail con DW penicillina/streptomicina 1%. Il gel può essere conservato per 2-3 settimane in un incubatore a 18 ° C. Nota: Evitare qualsiasi deposito del gel sotto i 10 ° C, per la bassa temperatura si ridurrà il gel di agarosio, risultante in un minuscolo gap tra il gel e la parete del piatto di cultura in cui i tardigradi possono essere intrappolati.</li>
</ol>2. campione preparazione ed esclusione delle sostanze contaminanti
<ol><li>Raccogliere un singolo Tardigrada, posizionarlo sulla piastra agar preparata e lavarlo 2x - 3x con DW per rimuovere eventuali particelle rimanenti.</li>
	<li>Incubare il Tardigrada a 18-22 ° C per 24 h per rimuovere qualsiasi cibo in eccesso dagli intestini.</li>
	<li>Posizionare il Tardigrada affamato in antibiotici penicillina/streptomicina per 2-6 h rimuovere qualsiasi contaminazione batterica e mettere l'animale decontaminato in un bicchiere pulito diapositiva utilizzando una pipetta P10.</li>
	<li>Osservare il Tardigrada sotto un microscopio a 500 ingrandimenti e confermare che non esistono nessun batteri rimanente. Nota: L'alto ingrandimento con un microscopio stereoscopico è ottima, ma un microscopio ottico può essere utilizzato in alternativa senza applicare un vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Raccogliere l'individuo utilizzando una pipetta P10 con un massimo di 5 µ l di liquido, metterlo in una provetta di reazione a catena (PCR) di basso-associazione della polimerasi e rimuovere come liquido molto in eccesso possibile. Nota: Le microprovette, provette per PCR e puntali per pipette dovrebbero tutti essere obbligatoria bassa per minimizzare la perdita di DNA. Nota: Condurre un'omogeneizzazione più presto, per la rapida essiccazione o morte dell'animale in modo significativo possa danneggiare il DNA genomico.</li>
</ol>3. omogeneizzazione ed estrazione del DNA
<ol><li>Omogeneizzare l'animale per ottenere il suo DNA genomico (gDNA) con uno dei seguenti metodi. Nota: È fondamentale usare il kit specificato mostrato in Tabella materiali nelle seguenti operazioni di estrazione del DNA, per altri kit (colonna e perlina basata) non sono efficaci a questo ingresso estremamente basso. Il buffer di lisi genomico è stato fornito con 0,5% beta-mercaptoetanolo prima dell'uso.<ol>
<li>Omogeneizzare l'animale con cicli di gelo e disgelo18.<ol>
<li>Subito dopo passo 2.5, aggiungere 100 µ l di tampone di lisi nella provetta di PCR contenente il Tardigrada.</li>
			<li>Collocare la provetta PCR in azoto liquido per 10 minuti e, per 10 min, spostarlo in un blocco di calore riscaldato a 37 ° C. Ripetere questo passaggio x 2. Nota: Questo passaggio può essere ripetuto quando l'omogeneizzazione non è sufficiente o può essere eseguita dopo la pigiatura manuale.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Manualmente e schiacciare l'animale.<ol>
<li>Subito dopo passo 2.5, sotto un microscopio stereoscopico, schiacciare l'individuo con la punta di P10 della pipetta premendo l'animale contro la parete del tubo PCR e immediatamente aggiungere 100 µ l di tampone di lisi. Nota: È fondamentale osservare questa procedura sotto un microscopio stereoscopico, perchè il Tardigrada può facilmente scivolare via e frantumazione inefficiente si tradurrà in un errore per estrarre gDNA. Assicurarsi che la cuticola tardigrade è rotta in modo che il buffer di lisi possa infiltrare l'organismo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare la provetta per 30 min a temperatura ambiente per lisi si verifichi. Nota: Un minimo di 30 minuti è necessario per un efficiente Lisi, ma l'incubazione può essere più lunga.</li>
	<li>Trasferire il volume completo (100 µ l) della miscela Lisi ad una pulito 1,5 mL basso-associazione microprovetta.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi per il tubo PCR di basso-associazione che è stato utilizzato per l'omogeneizzazione e ora è vuoto e dopo la miscela di pipettaggio, trasferirlo nella microprovetta basso-associazione 1,5 mL utilizzato al punto 3.3. Ripetere questo passaggio x 2.</li>
	<li>Come descritto al punto 3.4, aggiungere 300 µ l di tampone di lisi per la provetta PCR bassa-associazione e, dopo il pipettaggio, spostare la miscela nella microprovetta 1,5 mL basso-associazione. I conetti di basso-associazione di 1,5 mL dovrebbero contenere 600 µ l della miscela dopo questo passaggio. Nota: Questi passaggi sono per minimizzare la perdita di gDNA vincolato alla parete del tubo PCR, il campione di lavaggio più volte.</li>
	<li>Aggiungere il totale di 600 µ l di miscela di Lisi a colonna spin inserito in un tubo di raccolta e centrifugare esso a 10.000 x g per 1 min.</li>
	<li>Applicare nuovamente il flusso attraverso la colonna ed e centrifugare a 10.000 x g per 1 min. Nota: Questo passaggio è fondamentale per garantire che la maggior parte del gDNA è associato alla colonna.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio per la colonna di spin e centrifugare a 10.000 x g per 1 min. trasferimento della colonna di spin ad una microprovetta 1,5 mL pulito.</li>
	<li>Applicare 20 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, alla colonna di spin, attendere 5 min a temperatura ambiente e centrifugare esso a 10.000 x g per 1 min. Nota: Il tampone di eluizione non deve contenere EDTA, perché interferisce con gli enzimi di preparazione di biblioteca.</li>
	<li>Applicare nuovamente il flusso attraverso la colonna di spin e dopo 5 min di incubazione a temperatura ambiente, e centrifugare per 1 min a 10.000 x g. Nota: Questo passaggio è fondamentale per garantire la massima eluizione di gDNA associato alla colonna.</li>
</ol>4. sequenza di costruzione biblioteca
<ol><li>
Frammentazione del DNA
	<ol>
<li>Trasferire 15 µ l di eluente il gDNA una microprovetta 15-µ l per frammentazione del DNA e centrifugare la provetta per 1 min utilizzando una microcentrifuga da tavolo. Nota: Nella microprovetta specificata mostrata in Tabella materiali è ottima per un basso input. La frammentazione con basso volume sonicazione è fondamentale, e questo non può essere sostituito con frammentazione enzimatica a causa della bassissima concentrazione di DNA.</li>
		<li>Frammentare il gDNA a 550 bp. Nota: Le impostazioni di bp 550 abbiamo usato sono come segue: potenza incidente picco = 30 W, fattore di utilizzo = 20%, cicli al burst = 50, tempo di trattamento = 23 s.</li>
		<li>Dopo un'approfondita di pipettaggio, trasferire 10 µ l di miscela di DNA frammentata in una provetta PCR di pulito basso-associazione. Nota: L'esperimento può essere fermato qui. Conservare il DNA a 4 ° C o -20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sequenza di costruzione di libreria Nota: È assolutamente fondamentale per utilizzare il kit specificato nella Tabella materiali nelle procedure seguenti, a causa della quantità bassa di ingresso del DNA.<ol>
<li>Aggiungere 2 µ l di tampone di preparazione del modello e 1 µ l di enzima di preparazione del modello e mescolare accuratamente con una pipetta.</li>
		<li>Eseguire la reazione di preparazione del modello in un termociclatore con le seguenti condizioni: 22 ° C per 25 min, 55 ° C per 20 min, presa a 4 ° C e un coperchio riscaldato a 101-105 ° C. Una volta completata la reazione, procedere al passaggio successivo.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l di buffer sintesi libreria e 1 µ l di enzima di sintesi la libreria per il prodotto di reazione di preparazione di modello e incubare la miscela a 22 ° C per 40 min (con una tenuta di 4 ° C). Una volta completata la reazione, procedere al passaggio successivo.</li>
		<li>Aggiungere 30 µ l di mix master biblioteca amplificazione (25 µ l di tampone di amplificazione la biblioteca, 1 µ l di enzima amplificazione libreria e 4 µ l di acqua priva di nucleasi) e 5 µ l di reagente di indicizzazione.</li>
		<li>Mescolare il tutto accuratamente con una pipetta e centrifugare la miscela con una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Eseguire una PCR con le condizioni presentate nella tabella 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Temperatura</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>Cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚ c</td>
			<td>3 minuti</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>85 ˚ c</td>
			<td>2 minuti</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ° C</td>
			<td>2 minuti</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ° C</td>
			<td>20 secondi</td>
			<td rowspan="3">4 cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>67 ˚ c</td>
			<td>20 secondi</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚ c</td>
			<td>40 secondi</td>
		</tr>
<tr>
<td>98 ° C</td>
			<td>20 secondi</td>
			<td rowspan="2">16 cicli</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ˚ c</td>
			<td>50 secondi</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ˚ c</td>
			<td>Tenere premuto</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Condizioni di PCR.
<ol start="3"><li>
Purificazione dei prodotti di PCR Nota: Questo passaggio può essere sostituito con altri metodi di purificazione. Se viene utilizzato un metodo alternativo, assicuratevi di controllare per la purezza di DNA risultante utilizzando uno spettrofotometro. Rapporti di assorbanza 260/280 e 260/230 devono essere entrambi sopra 1.8.<ol>
<li>Aggiungere 50 µ l di biglie magnetiche, dispensare la soluzione 10 x e centrifugare con una microcentrifuga da tavolo.</li>
		<li>Incubare la soluzione per 2 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare su un supporto magnetico per 5 minuti o fino a quando la soluzione diventa completamente cancellare e rimuovere il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 200 µ l di etanolo di 80% preparati al momento nella provetta PCR di basso-associazione su un supporto magnetico, attendere per 30 s e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio x 2. Non disturbare le perline.</li>
		<li>Brevemente, centrifugare la provetta PCR bassa-associazione con una centrifuga da tavolo e rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso sul supporto magnetico. Asciugare le perline, ma evitare di seccare.</li>
		<li>Risospendere le perline con 15 µ l di 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, accuratamente Pipettare la soluzione in modo che i branelli magnetici sono distribuiti in modo omogeneo, incubare la provetta per 2 min a temperatura ambiente e dopo una breve centrifugazione, incubare su un supporto magnetico per 2 min fino a quando la soluzione è limpida. Nota: Il tampone di eluizione non deve contenere EDTA, perché interferisce con la chimica di sequenziamento.</li>
		<li>Trasferire il surnatante, senza disturbare il pellet, ad un nuovo tubo PCR di basso-associazione. Nota: L'esperimento può essere fermato qui. Conservare il DNA a 4 ° C o a-20 ° C per lo stoccaggio di lunga data.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. qualità di controllo, la quantificazione e la sequenza del DNA
Nota: Un controllo di qualità non viene eseguito prima che questo passo a causa della bassa quantità di DNA.
<ol><li>
Convalida della distribuzione di dimensione di biblioteca del DNA Nota: Altri sistemi di elettroforesi ad alta sensibilità con una segnalazione digitale di distribuzione delle dimensioni possono essere utilizzati.<ol>
<li>Restituire il reagente tampone di elettroforesi e gel cartuccia (25-1.000 bp nella gamma) a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 3 µ l di reagente tampone di elettroforesi con 1 µ l della libreria di sequenziamento e mescolare accuratamente per 1 min con un vortice e li Centrifugare brevemente con una centrifuga da tavolo.</li>
		<li>Condurre l'elettroforesi e convalidare la distribuzione di dimensione di biblioteca con il software associato. Il picco di frammento principale dovrebbe essere largamente vanno da circa 300 a 1.000 bp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificazione del DNA Nota: Altri metodi basati sulla fluorescenza o PCR quantitativa può anche essere utilizzato, ma spettrofotometria dovrebbe essere evitato, in quanto non è sufficientemente accurata per quantificare le librerie di sequenziamento.<ol>
<li>Aggiungere 796 µ l di soluzione tampone e 4 µ l di reagente fluorescente e mescolare accuratamente. Erogare 190 µ l di soluzione di lavoro di due provette e 197 µ l in una provetta di analisi.</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l di standard con concentrazioni note di DNA a ciascuna provetta di analisi contenente 190 µ l di soluzione di lavoro e 3 µ l della biblioteca preparata nella provetta di analisi contenente 197 µ l di soluzione di lavoro.</li>
		<li>Vortex le provette brevemente e centrifugare li su una centrifuga da tavolo. Quantificare il DNA utilizza un fluorometro con impostazioni 3-µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sequenza di DNA biblioteca Nota: La piattaforma di sequenziamento deve essere compatibile con il kit di costruzione libreria specificata.<ol>
<li>Preparare la libreria di sequenziamento basata sul protocollo del produttore.</li>
		<li>Impostare la cella di cassette e flusso di reagente nello strumento sequenziamento e immettere la sequenza di esecuzione informazioni seguendo il protocollo del produttore.</li>
		<li>Eseguire il sequenziamento. Nota: Abbiamo condotto due esecuzioni di sequenziamento: un esempio di esecuzione, come pure quattro campioni multiplexati in una corsa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analisi computazionale
<ol><li>Chiamata di base e, se necessario, demultiplex le letture.</li>
	<li>Convalidare la qualità dei dati di sequenza con FastQC19. Nota: Per una convalida più approfondita dei dati ottenuti, Vedi il nostro precedente rapporto16.</li>
</ol>

<ol><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.ph.54.030192.003051">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).</li>
<li>Mobjerg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+extreme+environments+-+on+the+current+knowledge+of+adaptations+in+tardigrades%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades.</a> Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).</li>
<li>Becquerel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+suspension+de+la+vieau+dessous+de+1%2F20+K+absolu+par+demagnetization+adiabatique+de+L%27alun+de+fer+dans+le+vide+les+plus+el%C3%A9ve%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Acad%C3%A9mie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve.</a> Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).</li>
<li>Ono, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/23311940.2016.1167575">Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia.</a> Cogent Physics. 3 (1), 1167575(2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+anhydrobiotic+eggs+of+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+to+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments.</a> Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+repair+and+protection+in+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+and+Hypsibius+dujardini+after+exposure+to+UVC+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation.</a> PLoS One. 8 (6), e64793(2013).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+tardigrade+Milnesium+tardigradum%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).</li>
<li>May, R. M., Maria, M., Gumard, J. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10021039778/">Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché.</a> Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).</li>
<li>Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+eutardigrade+Richtersius+coronifer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer.</a> International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).</li>
<li>Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+a+tardigrade%3A+Horizontal+gene+transfer+or+bacterial+contamination%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).</li>
<li>Delmont, T. O., Eren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+contamination+with+advanced+visualization+and+analysis+practices%3A+metagenomic+approaches+for+eukaryotic+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies.</a> PeerJ. 4, e1839(2016).</li>
<li>Koutsovoulos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+in+the+genome+of+the+tardigrade+Hypsibius+dujardini%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+Bemm+et+al.+and+Arakawa%3A+Identifying+foreign+genes+in+independent+Hypsibius+dujardini+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).</li>
<li>Arakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057(2016).</li>
<li>Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+a+single+tardigrade+Hypsibius+dujardini+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual.</a> Scientific Data. 3, 160063(2016).</li>
<li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+tardigrades+Hypsibius+dujardini+and+Ramazzottius+varieornatus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002266(2017).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e47">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio101, e47(2011).</li>
<li>Andrews, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndrews%2C+S+%22FastQC+a+quality-control+tool+for+high-throughput+sequence+data%22">FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Hashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremotolerant+tardigrade+genome+and+improved+radiotolerance+of+human+cultured+cells+by+tardigrade-unique+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein.</a> Nature Communications. 7, 12808(2016).</li>
<li>Zimin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaSuRCA+genome+assembler%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The MaSuRCA genome assembler.</a> Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualimap+2%3A+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+rearing+system+of+the+extremotolerant+tardigrade+Ramazzottius+varieornatus%3A+a+new+model+animal+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology.</a> Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Contaminazione batterica rappresenta una minaccia per il sequenziamento genomico di organismi microscopici. Mentre gli studi precedenti sul sequenziamento del genoma tardigrade hanno filtrato contaminazione utilizzando metodi informatica vasto12,20, abbiamo sequenziato il genoma da un singolo individuo per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni. Poiché un singolo Tardigrada contiene circa il 50-200 pg di genomic DNA16 ed è racchius...

I tardigradi sono animali microscopici che possono entrare in uno stato di ametabola chiamato anhydrobiosis quando essiccazione di fronte. Recuperano dall'assorbimento di acqua1,2. Nello stato ametabola, i tardigradi sono in grado di tollerare i vari ambienti estremi, quali temperature estreme pressioni e3 4,5, un alto dosaggio di luce ultravioletta6, raggi x e raggi gamma 7 , 8e9di spazio cosmico. Dati genomici sono un fondamento indispensabile per lo studio dei meccanismi molecolari della anhydrobiosis.
Precedenti tentativi di sequenziare il genoma di tardigradi hanno mostrato segni di contaminazione batterica10,11,12,13,14. Sequenziamento genomico da tali piccoli organismi richiede un gran numero di animali ed è soggetto a contaminazione batterica; di conseguenza, abbiamo precedentemente stabilito un protocollo di sequenziamento utilizzando un metodo di input ultrabasso a partire da un singolo esemplare di Tardigrada, per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni15. Utilizzando questi dati, abbiamo condotto ulteriormente una nuova sequenza di alta qualità e riassemblaggio del genoma di H. dujardini16,17. Qui descriviamo in dettaglio questo metodo di sequenziamento genomico da un singolo individuo tardigrade (nella figura 1). La convalida di questo metodo di sequenziamento è oltre il focus di questo lavoro e già è stata accuratamente esaminata nella nostra precedente relazione16.
Questo metodo è composto di due parti: l'isolamento di un singolo Tardigrada con il più basso possibile di contaminazione, l'estrazione di alta qualità dei livelli di pittogramma del DNA. Il Tardigrada è affamato e sciacquare accuratamente con acqua, così come gli antibiotici e osservato sotto un microscopio con ingrandimento X 500 per garantire la rimozione di qualsiasi contaminazione batterica. Misurazioni e stime precedenti indicano che un singolo individuo di Tardigrada contiene circa il 50-200 pg di genomic DNA16, che viene estratta per cracking l'esoscheletro di chitina dai cicli di gelo-disgelo o di omogeneizzazione manuale. Il DNA di genomic è presentato alla costruzione della libreria e sequenziato su uno strumento di sequenziamento del DNA. Un'analisi informatica ulteriori Mostra sequenziamento di alta qualità, così come i bassi livelli di contaminazione rispetto ai precedenti progetti di sequenziamento tardigrade.

<table><tbody><tr><td>Microscopio SZ61</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>VHX-5000 Sistema</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2mL Tubo con rivestimento in silicone</td><td>Bio Medical Science</td><td>BC-bmb20200</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Kit Microprep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3021</td><td>L'uso di questo kit è assolutamente fondamentale; vedere il passaggio 3.1</td></tr><tr><td>Microprovetta da 1,5 mL</td><td>greiner bio-one</td><td>616-201</td><td>Vedere 4.1.1</td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata ad alta velocità</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Covaris M220</td><td>Covaris Inc.</td><td></td><td></td>4482277</tr><tr><td>Kit ThruPLEX DNA-Seq</td><td>Rubicon Genomics CAT</td><td>. NO. R400406</td><td>L'uso di questo kit è assolutamente fondamentale; vedere il passaggio 4.2</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td></td></tr><tr><td>Reagente AMPure XP</td><td>BECKMAN COULTER Life Science</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Wako</td><td>054-027335</td><td></td></tr><tr><td>EB tampone</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2965AA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Reagenti</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Tampone/Reagente</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Cubee Mini-Centrifuge</td><td>RecenttecGenereach</td><td>R5-AQBD01aqbd</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 600 ciclo v3</td><td>Illumina Inc.</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>Sequenziatore MiSeq</td><td>Illumina Inc.</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di tardigrade

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

I tardigradi sono animali microscopici che entri in uno stato di ametabola anhydrobiosis chiamato fronte di essiccazione e può tornare al loro stato originale quando l'acqua è fornita. Il sequenziamento genomico di microscopici animali come i tardigradi rischi la contaminazione batterica che a volte porta a interpretazioni errate, ad esempio, per quanto riguarda il limite di trasferimento genico orizzontale in questi animali. Qui, forniamo un metodo di input ultrabasso per sequenziare il genoma di Tardigrada, Hypsibius dujardini, da un singolo esemplare. Impiegando rigorosa esclusione di lavaggio e contaminante insieme ad un'efficiente estrazione del 50 ~ 200 pg DNA genomico da un singolo individuo, abbiamo costruito una biblioteca sequenziata con uno strumento di sequenziamento del DNA. Queste librerie sono state altamente riproducibile e imparziale, e un'analisi informatica della sequenza si legge con altri genomi di H. dujardini ha mostrato una quantità minima di contaminazione. Questo metodo può essere applicato per i tardigradi saggiati che potrebbero non essere sequenziati utilizzando metodi precedenti.

Esclusione delle sostanze contaminanti:
Questo protocollo prevede un lavaggio accurato del Tardigrada e una sterilizzazione con antibiotici cura per minimizzare la contaminazione. Implica anche un processo di verifica visivo per assicurare la completezza di questi processi. Un'immagine del microscopio fatta durante la convalida (punto 2.4 del protocollo) è illustrata nella Figura 2....

Contaminazione durante il sequenziamento genomico di organismi microscopici rimane un grande problema. Qui, vi mostriamo un metodo per sequenziare il genoma di un Tardigrada da un singolo esemplare con appena 50 pg di DNA genomic senza amplificazione intero genoma per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

L'obiettivo di questo protocollo è sequenziare il genoma di un organismo microscopico chiamato tardigradi. Abbiamo stabilito un metodo per sequenziare il genoma di un tardigrado, Hypsibius dujardini, da un singolo campione con un minimo di 50 picogrammi di DNA genomico con un'applicazione dell'intero genoma. Dopo aver isolato un singolo tardigrado, riduciamo al minimo la contaminazione batterica utilizzando antibiotici e l'ispezione visiva.Abbiamo anche utilizzato due metodi di omogeneizzazione. Il primo e il più comunemente usato nei C.elegans che utilizzano cicli di congelamento e scongelamento e, in secondo luogo, una frantumazione manuale del tardigrado con la punta di una pipetta. Il DNA viene quindi utilizzato per costruire una libreria di sequenziamento e quindi sequenziato in uno strumento MiSeq.Un riassunto generale del protocollo. Dopo l'isolamento di un singolo individuo, viene sottoposto a tre cicli di congelamento e disgelo per l'omogeneizzazione. Il DNA genomico viene estratto e purificato e viene frammentato mediante sonicazione.Quindi viene costruita una libreria di sequenziamento e, dopo la convalida della distribuzione delle dimensioni della libreria, viene sequen

ultralow-input-genome-sequencing-library-preparation-from-single

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo manoscritto descrive un approccio automatizzato di selezione delle dimensioni del gel per purificare i frammenti di DNA per il sequenziamento di nuova generazione. La tecnologia Ranger fornisce l'automazione completa dell'intero processo di caricamento del gel di agarosio, analisi elettroforetica e recupero di frammenti di DNA mirati, consentendo librerie di sequenziamento di nuova generazione ad alta produttività e di alta qualità.

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

Regolazione traduzionale svolge un ruolo importante nel controllo dell'abbondanza di proteine. Qui, descriviamo un metodo di alto-rendimento per analisi quantitativa di traduzione nel lievito Saccharomyces cerevisiae.

Genome-wide quantificazione della traduzione nel lievito gemmante mediante profilatura, ribosoma

Questo articolo viene illustrato un protocollo dettagliato per isolamento di DNA e la costruzione della libreria sequenziamento ad alte prestazioni da materiale di erbario tra cui salvataggio di eccezionalmente scarsa qualità del DNA.

Isolamento del DNA robusto e costruzione della libreria High-throughput sequenziamento per campioni di erbario

Questo lavoro descrive un protocollo per la generazione di alta risoluzione in situ Hi-C librerie da strettamente in scena pre-gastrulazione Drosophila melanogaster embrioni.

Generazione di Genome-wide cromatina conformazione cattura librerie da strettamente in fasi precoce embrioni della drosofila

Lungo-ha letto sequenze notevolmente facilitano l'assemblaggio di complessi genomi e caratterizzazione di variazione strutturale. Descriviamo un metodo per generare sequenze ultra-lunghi di piattaforme nanopore di sequenziamento. L'approccio adotta un'estrazione di DNA ottimizzata seguita da preparazioni di libreria modificata per generare centinaia di kilobase letture con moderata copertura da cellule umane.

Sequenziamento di lettura ultra-lungo per analisi di DNA Genomic intero

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Descriviamo un metodo per generare librerie mutanti trasposoni saturanti nei batteri Gram-negativi e la successiva preparazione di librerie di amplicone di DNA per il sequenziamento ad alto rendimento. Ad esempio, ci concentriamo sull'agente patogeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ma questo protocollo è summostico per una vasta gamma di organismi Gram-negativi.

Generazione di librerie di inserimento transposon in batteri Gram-Negativi per il sequenziamento ad alta velocità effettiva

Questo protocollo descrive un approccio completo per la coltura, il sequenziamento e l'assemblaggio del genoma ibrido de novo dei batteri urinari. Fornisce una procedura riproducibile per la generazione di sequenze genomiche circolari complete utili nello studio di elementi genetici sia cromosomici che extracromosomiali che contribuiscono alla colonizzazione urinaria, alla patogenesi e alla diffusione della resistenza antimicrobica.

Assemblaggio di genoma ibrido De Novo per la generazione di genomi completi di batteri urinari utilizzando tecnologie di sequenziamento a lettura breve e lunga

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

Questo lavoro presenta un metodo di estrazione rapida dell'RNA e di confronto del livello di trascrizione per analizzare l'espressione genica nel tardigrado Hypsibius exemplaris. Utilizzando la lisi fisica, questo metodo ad alto rendimento richiede un singolo tardigrado come materiale di partenza e si traduce in una robusta produzione di cDNA per la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR).

Estrazione di RNA in provetta singola su un singolo animale per il confronto dei livelli relativi di trascrizione tramite qRT-PCR nell'esemplare di Tardibius expsibius

Scopri la preparazione di librerie per il sequenziamento del genoma di Hypsibius dujardini a partire da un singolo esemplare. Questo metodo riduce i rischi di contaminazione batterica e consente l'analisi genomica con quantità minime di DNA.

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Esplora altri video