Name: Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Scopri una metodologia ChIP-seq nativa modificata per l'analisi della densità dei nucleosomi, che integra l'accessibilità della MNasi con le misurazioni delle modificazioni istoniche. Questo approccio fornisce informazioni approfondite sulle caratteristiche epigenetiche a livello del singolo nucleosoma.

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A.L. è stato sostenuto da una borsa di studio laurea canadese dall'istituti canadesi di ricerca sanitaria. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal genoma British Columbia e l'istituti canadesi di ricerca sanitaria (CIHR-120589) come parte dell'epigenetica canadese, ambiente e salute Research Consortium Initiative e dal programma di Terry Fox Research Institute Progetto Grant #TFF-122869 M.H. e un Istituto di ricerca di Terry Fox nuovo Investigator Award (Grant # 1039) di M.H.

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Data la natura combinatoria di modificazione della cromatina e nucleosoma posizionamento nella regolazione trascrizionale, un metodo che consente misurazioni simultanee di queste caratteristiche rischia di fornire nuove intuizioni regolazione epigenetica. Il ndChIP-seq presentato qui è un protocollo di ChIP-seq nativo ottimizzato per attivare interrogazione simultanea della modifica dell'istone e densità nucleosoma in cellule primarie rare9,10. ndChIP-seq utilizza la digestione enzimatica della cromatina che, quando accoppiato al sequenziamento massivamente parallelo accoppiato-fine e un modello di distribuzione gaussiana mistura, consente per le modifiche dell'istone di indagine a livello di singolo nucleosoma e il deconvoluzione di epigenomic profili guidato da eterogeneità all'interno di una popolazione. Usando questo protocollo, precedentemente abbiamo segnalato una distribuzione unica di dimensioni frammento immuno-precipitato, determinato da accoppiato-fine leggere i confini, connessi con cromatina specifici stati definiti da ChromHMM10,24.
La qualità di una biblioteca di ndChIP-seq è dipende da molteplici fattori, come la specificità dell'anticorpo e sensibilità, condizioni ottimali di digestione MNase e qualità della cromatina. La specificità degli anticorpi utilizzati è cruciale nella produzione di successo ndChIP-seq biblioteca. Un anticorpo ideale Mostra alta affinità contro l'epitopo di interesse con poca reattività crociata con altri epitopi. È altrettanto importante scegliere biglie magnetiche con il più alta affinità per l'anticorpo di scelta.
MNase digestione è una reazione critica e sensibili di tempo e di concentrazione in questo protocollo. Pertanto, durante l'elaborazione di campioni multipli, è importante che ogni reazione viene incubato per un controvalore complessivo di tempo (Vedi punto 2.2). La qualità della cromatina è un altro fattore che condiziona significativamente l'esito della porta di cromatina Fragmented ndChIP-segg. per un profilo di digestione MNase Sub-ottimo e risultati nelle librerie con un basso rapporto segnale-rumore. Campioni primari con bassa vitalità cellulare o degradato della cromatina, come formalina tessuto di paraffina (FFPE) non sono consigliate per questo protocollo.
L'aggiunta di un PIC durante l'estrazione della cromatina riduce indesiderati (vale a dire, casuale) della cromatina frammentazione e conserva l'integrità di istoni. Come tale, PIC deve essere aggiunto al buffer di lisi e immunoprecipitazione buffer appena prima di utilizzare. Mentre selezione cellule tramite flusso cytometry, selezionare per cellule vitali e garantire le cellule vengono ordinate a un tasso di flusso debole per aumentare l'accuratezza della stima numero cellulare e attuabilità delle cellule. Evitare l'ordinamento celle direttamente nel tampone di lisi. Il buffer di guaina diluirà il buffer di lisi e impedisce l'efficace permeabilizzazione della membrana cellulare a MNase. Secondo un tipo di cellule o di un organismo, titolazione di MNase può essere richiesto per ottenere una digestione ottimale.
ndChIP-seq sulle cellule di mammiferi richiede una profondità minima di sequenziamento di 50 milioni accoppiato-letture (frammenti di 25 milioni) per 100 milioni accoppiato-letture (frammenti di 50 milioni) e i segni stretti per l'input e grandi marchi. L'algoritmo di distribuzione gaussiana miscela non eseguirà in modo ottimale sulle biblioteche che sono stati sequenziati fino ad una profondità significativamente di sotto di questa raccomandazione. ndChIP-seq non classificano promotori con separazione poco tra il valore di distribuzione ponderata per lunghezze di frammento di mono - e di-nucleosome in mono - o di-nucleosoma dominato promotori. Pertanto, questi promotori devono essere rimosso in analisi successive. Replicati biologici possono essere generati per aumentare la fiducia nel predetti distribuzioni e identificare tecniche variabilità nella costruzione di digestione e Biblioteca del MNase.
A differenza di precedenti iterazioni di protocolli nativi di ChIP-seq, ndChIP-seq fornisce i mezzi per studiare effetto combinatorio di modificazione di struttura e istone di cromatina utilizzando frammento dimensione post immunoprecipitazione per integrare densità nucleosoma, determinata dall'accessibilità di MNase, con misure di modifica dell'istone. Applicazione di ndChIP-seq per tessuti e cellule primarie fornirà nuove conoscenze sulla natura integrativa della regolazione epigenetica e permettere l'identificazione di marcatori epigenetici dovuto eterogeneità all'interno della popolazione.

Il genoma eucariotico è confezionato in cromatina via ripetendo strutture nucleosoma che consistono di due copie di quattro proteine istoniche (ad es., H2A, H2B, H3 e H4) circoscritte da 146 paia di basi di DNA1,2. Complessi di rimodellamento della cromatina controllano nucleosoma posizione entro i confini di gene promotore e partecipano alla regolazione dell'espressione genica alterando l'accessibilità del DNA ai fattori di trascrizione e alla RNA polimerasi macchinari3, 4.
Terminale amminica code degli istoni entro il nucleosoma sono sottoposti a varie modificazioni covalenti, tra cui acetilazione, metilazione, fosforilazione, ubiquitilazione, sumoilazione, formilazione e idrossilazione di specifici amminoacidi5 , 6 , 7 , 8. posizioni e gradi di queste modifiche determinano uno stato di cromatina che influenzano l'accesso di controllo e struttura della cromatina dei complessi molecolari che consentono l'attivazione della trascrizione7. Dato che entrambi modifica di densità e istone nucleosoma svolgono un ruolo nel controllo locale della trascrizione genica, abbiamo sviluppato un approccio nativo di ChIP che consente la misurazione simultanea di densità nucleosoma e istone modifica9, 10.
Nativo di ChIP-seq sfrutta la nucleasi di micrococchi endonucleasi (MNase) per digerire la cromatina intatta nel suo stato nativo all'interno del nucleo11,12, una proprietà che è stata sfruttata per mappare il nucleosoma posizionamento13 , 14 , 15. densità nucleosome ChIP-seq (ndChIP-seq) sfrutta la proprietà di accesso preferenziale di MNase per aprire le regioni di cromatina per generare misure che combinano MNase accessibilità con istone modifica10. ndChIP-seq è adatto per la profilatura delle modificazioni istoniche in cellule primarie rare, tessuti e cellule in coltura. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato che consente la generazione di sequenza DataSet adatto per un telaio analitico descritto in precedenza opera10 che integra frammento dimensione post immunoprecipitazione, determinato da accoppiato-fine leggere i confini, per contemporaneamente indagare MNase accessibilità con misure di modifica dell'istone. In precedenza, l'applicazione del presente protocollo a 10.000 sangue del cordone ombelicale umano primario derivato CD34+ cellule e cellule staminali embrionali umane hanno rivelato relazioni uniche tra modificazioni della cromatina struttura e istone all'interno di questi tipi10 cellulari . Data la sua capacità di misurare simultaneamente nucleosoma accessibilità e modifica dell'istone, ndChIP-seq è capace di rivelare caratteristiche epigenomic in una popolazione delle cellule a livello di singolo nucleosoma e risoluzione eterogenee firme in loro elementi costitutivi. Un esempio dell'esplorazione di eterogenee popolazioni cellulari di ndChIP-seq è indagine dei promotori bivalenti, dove sia H3K4me3, un marchio di attivo e H3K27me3, un marchio repressivo, sono presenti10.

<table><tbody><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 7.5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl &ndash; pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma</td><td>1001385276</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>1001412354</td><td></td></tr><tr><td>Sodio-desossicolato</td><td>Sigma</td><td>1001437582</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Fisher</td><td>Scientific S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom piastra a 96 pozzetti (AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P2 pipettatore</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P10 pipettatore</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 pipettatore</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P100 pipettatore</td><td>Mandel</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P200 pipettatore</td><td>Mandel</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P1000 pipettatore</td><td>Mandel</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>nucleasi micrococcica...</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Mixer C (Miscelatore a blocco riscaldante)</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canali Pippet P20</td><td>Rainin</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>Multi 12 canali Pippet P200</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tubo LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Tubo LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio della piastra in plastica</td><td>Edge Bio</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio PCR</td><td>Bio Rad</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio della piastra in alluminio</td><td>Bio Rad</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di eluizione (tampone EB)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga Eppendorf 5810R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Protein G dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Protein A dynabeads</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi Cocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma rotante</td><td>Mandel</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Piastra magnetica</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>Striscia bombata a 12 tappi</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>Tubo magnetico (DynaMag-2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tubo magnetico (DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio in plastica a forma di V</td><td>Mandel</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Mandel</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>Scala analitica</td><td>Mandel</td><td>LB109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di reazione di legatura rapida, 5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi I, grande frammento (Klenow)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Frammento di Klenow (3'-5' eso)</td><td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerasi</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotide chinasi</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di soluzione di desossinucleotide, 10mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>soluzione dATP 10mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (ATP), 25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>DNA polimerasi</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>NEB</td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata di Hank</td><td>Thermo Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Soluzione</td><td></td> salina tampone fosfato Thermo Scientific A3160702 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Segnalazione cellulare</td><td>H3K4me3</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp; super-paramagnetico spumare</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Vi presentiamo un'immunoprecipitazione della cromatina native modificate sequenziamento protocollo sperimentale (ChIP-seq) compatibile con una miscela gaussiana distribuzione basata metodologia di analisi (densità nucleosoma ChIP-seq; ndChIP-seq) che consente la generazione di combinato misure di accessibilità di nucleasi di micrococcal (MNase) con modifica dell'istone genoma. Posizione nucleosome e densità locale e le modifiche post-traduzionali di loro subunità dell'istone, agire di concerto per regolare la trascrizione locale Stati. Combinatoriale misure di accessibilità nucleosome con modifica dell'istone generata da ndChIP-seq consente l'interrogazione simultanea di queste caratteristiche. La metodologia di ndChIP-seq è applicabile ad un piccolo numero di cellule primarie inaccessibili al cross-linking base protocolli di ChIP-seq. Presi insieme, ndChIP-seq consente la misurazione di modifica dell'istone in combinazione con densità nucleosoma locale per ottenere nuove visioni dei meccanismi comuni che regolano la trascrizione del RNA all'interno delle popolazioni cellulari primarie rara.

Vi presentiamo un'immunoprecipitazione della cromatina native modificate sequenziamento (ChIP-seq) metodologia per la generazione di sequenza DataSet adatto per un quadro analitico di densità ChIP-seq nucleosoma integrando l'accessibilità nucleasi di micrococcal (MNase) con misure di modifica dell'istone.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare librerie di sequenziamento per l'immunoprecipitazione della cromatina nativa al fine dell'analisi della densità dei nucleosomi. Questo metodo può rispondere a domande nell'ambito dell'epigenetica, ad esempio rivelando caratteristiche epigenomiche in una popolazione cellulare a livello singolo di nucleosoma e risolvendo firme cromatiniche eterogenee nei loro elementi continui. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzare la proprietà della MNasi di accedere preferenzialmente alle regioni di cromatina aperta, generando così una misurazione che combina l'accessibilità della MNasi con la modificazione degli istoni.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché non saranno in grado di ottenere una digestione ottimale con MNase. Iniziare questo protocollo con la preparazione delle cellule come descritto nel protocollo testuale. Al primo giorno, scongelare ogni pellet cellulare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 secondi.Successivamente, trasferire le cellule sul ghiaccio. A ogni pellet di cellule, aggiungere immediatamente un buffer di lisi freddo a concentrazione uno-X più PIC a concentrazione uno-X, per una concentrazione finale di 10.000 cellule ogni 20 microlitri. Mescolare 10 volte aspirando e dispensando con la pipetta, senza formare bolle.Lavorando sul ghiaccio, aliquotare 20 microlitri per pozzetto dei lisati ottenuti in una piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con la pellicola adesiva prima di incubarla sul ghiaccio per 20 minuti. Etichettare la piastra come MNase e registrare i pozzetti in un modello di riferimento.Poco prima del completamento della lisi di 20 minuti, diluire l'enzima MNase one con il buffer di diluizione MNase one fino a una concentrazione finale di 20 unità per microlitro e mantenerlo sul ghiaccio. Lavorando sul ghiaccio, preparare la miscela maestra per la digestione con MNase one come descritto nel protocollo testuale. Quindi, aliquotare 20 microlitri della miscela maestra per ogni riga di campioni, più cinque microlitri di volume aggiuntivo, in una piastra serbatoio a 96 pozzetti.Dopo il completamento dell'incubazione dei lisati, rimuovere la piastra per la digestione con MNase dal ghiaccio. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 microlitri del master mix di digestione con MNase in ogni riga di campioni e mescolare aspirando e dispensando 10 volte. Cambiare le punte tra una riga e l'altra.Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente esattamente per cinque minuti. Per arrestare la reazione dopo cinque minuti, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere sei microlitri di EDTA 250 micromolare in ogni riga di campioni e mescolare su e giù alcune volte. Assicurarsi di cambiare i puntali tra una riga e l'altra.Dopo l'aggiunta di EDTA, impostare la pipetta su 20 microlitri ed eseguire 10 movimenti di pipettaggio come in precedenza per assicurare l'arresto completo della reazione di digestione. Infine, aggiungere sei microlitri di tampone per la lisi 10X a ciascuna riga dei campioni digeriti con MNase e mescolare accuratamente eseguendo 0 movimenti di pipettaggio su e giù. Coprire la piastra con un sigillo di plastica e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.Preparare la piastra del complesso anticorpo-perle e la piastra di pre-pulizia come descritto nel protocollo testuale. Centrifugare brevemente entrambe le piastre per 10 secondi a 200 ×g. Successivamente, posizionare la piastra del complesso anticorpo-perle su un magnete per piastre e attendere 15 secondi affinché la soluzione diventi limpida. Rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante utilizzando una pipetta, senza disturbare le perle.Quindi, rimuovere la piastra dal magnete per piastre e mantenerla sul ghiaccio. Posizionare la piastra della reazione di pre-pulizia sul magnete per piastre e attendere 15 secondi affinché le perle si separino e la soluzione diventi limpida. Senza disturbare le perle, utilizzare una pipetta per trasferire con attenzione il soprannatante nei pozzetti corrispondenti della piastra contenente il complesso di perle con anticorpo, mantenuta sul ghiaccio.Mescolare delicatamente ogni pozzetto aspirando e dispensando 15 volte. Sigillare il pozzetto con un coperchio in alluminio e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante. Al termine dell'incubazione, etichettare nuovamente la piastra come IP Reaction.Il secondo giorno, impostare il termomiscelatore a 65 gradi Celsius, quindi preparare un tampone di lavaggio a basso contenuto salino e un tampone di lavaggio ad alto contenuto salino su ghiaccio. Centrifugare brevemente la piastra della reazione di immunoprecipitazione per 10 secondi a 200 ×g. Posizionare la piastra della reazione di immunoprecipitazione su un magnete per piastre e attendere 15 secondi affinché la soluzione diventi limpida. Utilizzando una pipetta multicanale, senza disturbare le perline, rimuovere con attenzione e scartare il soprannatante.Togliere la piastra dal magnete per piastre e posizionarla sul ghiaccio. Aggiungere a ciascuna fila di campioni nella piastra della reazione di immunoprecipitazione 150 microlitri di tampone di lavaggio a basso sale freddo di ghiaccio e mescolare lentamente su e giù per 10 volte per risospendere completamente le perle. Rimettere la piastra della reazione di immunoprecipitazione sul magnete per piastre ed eliminare il sopranatante come in precedenza.Successivamente, rimettere la piastra sul ghiaccio e ripetere i passaggi di lavaggio per un totale di due lavaggi. Lavorando sul ghiaccio, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio ad alto contenuto salino a ciascuna fila di campioni nella piastra della reazione di immunoprecipitazione. Mescolare delicatamente i campioni aspirando e dispensando lentamente 10 volte per ri-sospendere completamente le perline.Dopo aver rimosso il surnatante come in precedenza, posizionare la piastra della reazione di immunoprecipitazione sul ghiaccio e pre-raffreddare una nuova piastra a 96 pozzetti accanto ad essa. Aggiungere a ogni riga di campioni nella piastra della reazione di immunoprecipitazione 150 microlitri di tampone di lavaggio ad alto contenuto salino e mescolare lentamente 10 volte aspirando e dispensando per risospendere completamente le perle. Dopo la risospensione, trasferire ogni riga di campioni alla corrispondente riga della nuova piastra a 96 pozzetti pre-raffreddata.Scartare la vecchia piastra. Posizionare la nuova piastra per la reazione di IP sul magnete per piastre e scartare il surnatante come in precedenza. Mantenere la piastra a temperatura ambiente.Aggiungere a ciascuna fila di campioni nella piastra della reazione di IP 30 microlitri di buffer di eluizione ChIP e mescolare lentamente aspirando e dispensando 10 volte con una pipetta. Prestare attenzione a evitare la formazione di bolle. Sigillare la piastra con un coperchio PCR e incubare in un termomiscelatore a 65 gradi Celsius per 1 ora e 30 minuti con una velocità di agitazione di 1.350 giri al minuto.Dopo un'incubazione di 1 ora e 30 minuti, centrifugare la piastra della reazione di immunoprecipitazione a 200 × g per un minuto a quattro gradi Celsius. Successivamente, posizionare la piastra della reazione di immunoprecipitazione su un magnete per piastre e attendere che la soluzione si schiarisca. Utilizzando una pipetta multicanale e senza disturbare i campioni, trasferire con attenzione 20 microlitri del soprannatante in una nuova piastra a 96 pozzetti, usando punte nuove per ogni riga.Etichettare la piastra come Reazione IP e mantenerla a temperatura ambiente. Procedere alla digestione delle proteine seguita dalla costruzione della libreria come descritto nel protocollo testuale. Qui sono mostrati risultati rappresentativi di cromatina digerita con MNase in condizioni ottimali, sottodigerita e sovradigerita, prima della generazione della libreria.Il profilo di digestione ottimale è dominato da frammenti di singoli nucleosomi, senza essere eccessivamente digerito, in modo da permettere il recupero di frammenti di nucleosomi di ordine superiore. Una digestione subottimale della cromatina sarà inoltre evidente nel profilo della libreria di sequenziamento generata dal materiale immunoprecipitato. Per validare le librerie mediante qPCR, è stato valutato l'arricchimento in termini di fold delle librerie IP rispetto alla libreria di input per bersagli positivi e negativi.Inoltre, l'analisi visiva dei read allineati delle librerie con un elevato arricchimento in termini di fold, valutato mediante qPCR, su un browser genomico dovrebbe rivelare arricchimenti visivamente rilevabili rispetto alla libreria di input. Le librerie di ChIP-sequencing per la densità dei nucleosomi considerate valide conterranno repliche altamente correlate con una porzione significativa di read allineati all'interno dei picchi arricchiti identificati da MACS2. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se effettuata correttamente.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare librerie di sequenziamento per l'immunoprecipitazione della cromatina nativa per l'analisi della densità dei nucleosomi. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante assicurarsi che la cromatina venga digerita in modo ottimale e utilizzare solo anticorpi che mostrino un'elevata affinità per l'epitopo di interesse e una scarsa o nulla cross-reattività con altri epitopi. Successivamente a questa procedura, può essere eseguita una modellizzazione computazionale dell'accessibilità di MNase per rispondere a domande come le firme epigenetiche dovute all'eterogeneità all'interno di una popolazione cellulare.Questo metodo fornisce informazioni sull'effetto combinatorio della posizione dei nucleosomi e della loro densità locale, nonché sulle modifiche post-traduzionali delle subunità istoniche, ed è applicabile a qualsiasi sistema, come cellule umane o di topo, cellule primarie e tessuti congelati.

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