Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare librerie di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina nativa per l'analisi della densità dei nucleosomi. Questo metodo può rispondere a domande di epigenetica come rivelare le caratteristiche epigenomiche in una popolazione cellulare a livello di singolo nucleosoma e risolvere firme di cromatina eterogenee nei loro elementi continui. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di utilizzare la proprietà MNase di accesso preferenziale alla regione della cromatina aperta per generare una misura che combina l'accessibilità MNasi con la modifica degli istoni.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non sono in grado di ottenere una digestione ottimale della MNasi. Iniziare questo protocollo con la preparazione delle cellule come descritto nel protocollo di testo. Il primo giorno, scongelare ogni pellet di cella in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10 secondi.

Quindi, trasferisci le celle nel ghiaccio. A ciascun pellet di cellule, aggiungere immediatamente un tampone di lisi one-X ghiacciato più un X PIC fino a una concentrazione finale di 10.000 cellule per 20 microlitri. Miscelare 10 volte pipettando su e giù senza creare bolle.

Lavorando sul ghiaccio, aliquotare 20 microlitri per pozzetto dei lisati risultanti in una piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con il sigillo di plastica prima di incubare sul ghiaccio per 20 minuti. Etichettare la piastra come MNase e registrare i pozzetti in una chiave modello.

Poco prima del completamento della lisi di 20 minuti, diluire l'enzima MNasi uno con il tampone di diluizione MNasi uno a una concentrazione finale di 20 unità per microlitro e mantenerlo in ghiaccio. Lavorando sul ghiaccio, preparare la miscela master di digestione MNase one come descritto nel protocollo di testo. Quindi, aliquotare 20 microlitri della miscela master per ogni fila di campioni, più cinque microlitri di volume extra in una piastra serbatoio a 96 pozzetti.

Dopo che i lisati hanno terminato l'incubazione, rimuovere la piastra di digestione MNase dal ghiaccio. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 microlitri di MNnase one digestion master mix in ciascuna fila di campioni e miscelare pipettando su e giù 10 volte. Cambia i suggerimenti tra le righe.

Quindi, incubare la piastra a temperatura ambiente per esattamente cinque minuti. Per arrestare la reazione dopo cinque minuti, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere sei microlitri di EDTA da 250 micromolari in ciascuna fila di campioni e mescolare su e giù alcune volte. Assicurati di cambiare i suggerimenti tra le righe.

Dopo l'aggiunta di EDTA, impostare la pipetta su 20 microlitri e mescolare 10 volte come prima per garantire l'arresto completo della reazione di digestione. Infine, aggiungere sei microlitri di tampone di lisi 10X a ciascuna fila di campioni digeriti da MNase e mescolare bene pipettando su e giù 10 volte. Coprire la piastra con un sigillo di plastica e incubare con ghiaccio per 15 minuti.

Preparare la piastra del complesso di perline di anticorpi e la piastra di pre-clearing come descritto nel protocollo di testo. Far girare rapidamente entrambe le piastre centrifugando per 10 secondi a 200 volte G.Quindi, posizionare la piastra del complesso di perline di anticorpi su una piastra magnetica e attendere 15 secondi affinché la soluzione diventi limpida. Rimuovere e gettare con cautela il surnatante utilizzando una pipetta senza disturbare le microsfere.

Quindi, rimuovi la piastra dal magnete e tienila in ghiaccio. Posizionare la piastra di reazione di pre-pulizia su una piastra magnetica e attendere 15 secondi affinché le perle si separino e la soluzione diventi limpida. Senza disturbare le microsfere, utilizzare una pipetta per trasferire con cura il surnatante nei pozzetti corrispondenti della piastra del complesso di perle anticorpali tenuta in ghiaccio.

Mescolare delicatamente ogni pozzetto pipettando su e giù 15 volte. Sigillare bene la piastra con un coperchio di alluminio e incubare per una notte a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante. Dopo l'incubazione, rietichettare la piastra IP Reaction.

Il secondo giorno, imposta il miscelatore di riscaldamento a 65 gradi Celsius, quindi prepara un tampone di lavaggio a basso contenuto di sale e un tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale su ghiaccio. Far girare rapidamente la piastra di reazione IP per 10 secondi a 200 volte G.Posizionare la piastra di reazione IP su una piastra magnetica e attendere 15 secondi affinché la soluzione diventi limpida. Utilizzando una pipetta multicanale, senza disturbare le perline, rimuovere ed eliminare con cura il surnatante.

Togliete la piastra dal magnete e posizionatela sul ghiaccio. A ogni fila di campioni nella piastra di reazione IP, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale ghiacciato e mescolare lentamente su e giù per 10 volte per risospendere completamente le perle. Riposizionare la piastra di reazione IP sulla piastra magnetica e rimuovere il surnatante come prima.

Quindi, riposizionare la piastra sul ghiaccio e ripetere le fasi di lavaggio per un totale di due lavaggi. Lavorando sul ghiaccio, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale a ciascuna fila di campioni nella piastra di reazione IP. Miscelare lentamente i campioni pipettandoli su e giù 10 volte per risospendere completamente le microsfere.

Dopo aver rimosso il surnatante come prima, posizionare la piastra di reazione IP sul ghiaccio e preraffreddare una nuova piastra a 96 pozzetti accanto ad essa. A ciascuna fila di campioni nella piastra di reazione IP, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale e mescolare lentamente 10 volte pipettando su e giù per risospendere completamente le perle. Dopo la risospensione, trasferire ciascuna fila di campioni nella fila corrispondente della nuova piastra pre-raffreddata a 96 pozzetti.

Scartare la vecchia targa. Posizionare la nuova piastra di reazione IP sulla piastra magnetica ed eliminare il surnatante come prima. Conservare il piatto a temperatura ambiente.

A ciascuna fila di campioni nella piastra di reazione IP, aggiungere 30 microlitri del tampone di eluizione ChIP e mescolare lentamente pipettando su e giù 10 volte. Fare attenzione a prevenire la formazione di bolle. Sigillare la piastra con un coperchio per PCR e incubare in un miscelatore riscaldante a 65 gradi Celsius per 1 ora e mezza con una velocità di miscelazione di 1.350 giri/min.

Dopo un'incubazione di 1 ora e mezza, far girare la piastra di reazione IP a 200 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Quindi, posizionare la piastra di reazione IP su una piastra magnetica e attendere che la soluzione si liberi. Utilizzando una pipetta multicanale, senza disturbare le perline, trasferire con cura 20 microlitri di surnatante in una nuova piastra a 96 pozzetti utilizzando puntali freschi per ogni fila.

Etichettare la piastra IP Reaction e conservarla a temperatura ambiente. Procedere alla digestione delle proteine seguita dalla costruzione della libreria come descritto nel protocollo di testo. Qui sono mostrati i risultati rappresentativi della cromatina digerita MNasi ottimale, sotto-digerita e sovra-digerita prima della generazione della libreria.

Il profilo digerito in modo ottimale è dominato dalle dimensioni dei singoli frammenti di nucleosomi, ma non viene digerito eccessivamente per consentire il recupero di frammenti di nucleosomi di ordine superiore. La digestione non ottimale della cromatina sarà evidente anche nel profilo della libreria di sequenziamento generata dal materiale IP. Per convalidare le librerie mediante qPCR, è stato valutato l'arricchimento delle librerie IP rispetto alla libreria di input per obiettivi positivi e negativi.

Inoltre, l'ispezione delle letture allineate delle librerie con un elevato arricchimento di pieghe valutato dalla qPCR su un browser del genoma dovrebbe rivelare arricchimenti visivamente rilevabili rispetto alla libreria di input. Le librerie di sequenziamento ChIP per la densità nucleosomica di successo conterranno repliche altamente correlate con una porzione significativa di reads allineate all'interno di picchi arricchiti identificati da MACS2. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare librerie di sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina nativa per l'analisi della densità dei nucleosomi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che la cromatina sia digerita in modo ottimale e di utilizzare solo anticorpi che mostrano un'elevata affinità con l'epitopo di interesse e mostrano poca o nessuna reattività crociata con altri epitopi. Seguendo questa procedura, la modellazione computazionale dell'accessibilità della MNasi può essere eseguita per rispondere a domande come le firme epigenetiche dovute all'eterogeneità all'interno di una popolazione cellulare.

Questo metodo fornisce informazioni sull'effetto combinatorio della posizione del nucleosoma e della densità locale, nonché sulla modifica post-traduzionale delle loro subunità istoniche e può essere applicato a qualsiasi sistema come l'uomo o il topo, le cellule primarie e i tessuti congelati.