Name: Un metodo veloce e quantitativo per la modificazione post-traduzionale e variante attivato Mapping dei peptidi di genomi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara a mappare i peptidi con modificazioni post-traduzionali e dati quantitativi da spettrometria di massa su genomi di riferimento con PoGo. Questo metodo facilita l'integrazione con dati genomici ortogonali.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Wellcome Trust (WT098051) e la concessione di NIH (U41HG007234) per il progetto GENCODE.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo viene descritto come lo strumento software PoGo e la sua interfaccia grafica PoGoGUI abilitare un mapping veloce dei peptidi sul genoma coordinate. Lo strumento offre caratteristiche uniche come modificazione post-traduzionale, quantitativa e abilitati alla variante mappatura di genomi mediante annotazione di riferimento. In questo articolo viene illustrato il metodo su uno studio su larga scala proteogenomic ed evidenzia la sua velocità e memoria efficienza rispetto ad altri strumenti disponibili18. In combinazione con lo strumento TrackHubGenerator, che crea online accessibile mozzi di genomic e genoma i dati collegati, PoGo, con la sua interfaccia utente grafica, studi proteogenomics su larga scala consente di visualizzare rapidamente i loro dati in contesto genomico. Inoltre, dimostriamo le caratteristiche uniche di PoGo con DataSet cercato contro varianti database e fosfoproteomica quantitativa22,29.
Singoli file, ad esempio il file GCT, forniscono preziose visualizzazione e collegamenti tra caratteristiche del peptide e loci genomici. Tuttavia, è importante notare che un'interpretazione fondata su questi da soli può essere difficile o fuorviante a causa loro limitazione ai singoli aspetti del proteogenomics come unicità, modificazioni post-traduzionali e valori quantitativi. Pertanto, è importante scegliere con attenzione quali file di output, le opzioni e combinazioni sono appropriati per la domanda di proteogenomic a portata di mano e modificare le combinazioni. Ad esempio, informazioni circa l'unicità del mapping da un locus genomico specifico potrebbero essere di grande valore per l'annotazione di una funzione genomica7, mentre la quantificazione attraverso diversi campioni potrebbe essere più appropriata per studi relativi caratteristiche genomiche ai cambiamenti nella proteina abbondanza29. L'Output deve essere generato da PoGo per ogni impostazione. Nel caso in cui non genera alcun output, o file vuoti vengono visualizzati nella cartella di output, si raccomanda di controllare i file di input per il contenuto desiderato e il formato di file desiderato. In casi dove il formato di file o il contenuto non segue le aspettative di PoGo (ad esempio, il file FASTA presumibilmente contenente le sequenze di traduzione di trascrizione contiene le sequenze nucleotidiche delle trascrizioni), messaggi di errore chiederà all'utente di Verifica i file di input.
Restrizioni del protocollo e lo strumento sono principalmente basate sul riutilizzo dei formati di file comunemente utilizzati nel campo della genomica. Riuso di formati di file utilizzati nel campo della genomica per applicazioni di proteogenomic è accompagnata da limitazioni specifiche. Questi sono dovuto le diverse serie di requisiti per la visualizzazione del genoma centrato di genomic e proteogenomic dati, ad esempio la necessità di visualizzare le modifiche post-traduzionali dai dati di proteomica. Questo è limitato nei formati di file di genomica di uso delle singole funzioni. Molti approcci e strumenti sono stati sviluppati per proteomica localizzare con fiducia all'interno del peptide sequenze31,32,33,34post-traduzionali. Tuttavia, la visualizzazione di più modifiche in maniera unica e distinguibile sul genoma è ostacolata dalla struttura dei formati di file genomica. Di conseguenza, la visualizzazione del singolo blocco di PTMs multiple dello stesso tipo non costituisce alcuna ambiguità dei siti modifica ma è la conseguenza del requisito differente della community di genomica di visualizzare solo funzionalità di single in un momento. Ciò nonostante, PoGo ha il vantaggio di modificazioni post-traduzionali di mappatura sulla genomiche coordinate per consentire studi focalizzati sull'effetto delle caratteristiche genomiche quali varianti di singolo nucleotide su modificazioni post-traduzionali. Utilizzando PoGo, variante mapping aumenta il numero di mapping totale. Tuttavia, la codifica dei colori unici dei peptidi mappate evidenzia i mapping affidabili da quelle inaffidabili. La mappatura dei peptidi variante identificata da varianti noto singolo nucleotide può essere accompagnata da visualizzare i peptidi mappati a fianco le varianti in formato VCF. In questo modo il codice di colore che indica un mapping inaffidabile di un peptide variante è respinta dalla presenza della variante del nucleotide noto.
Un passo fondamentale per l'utilizzo di PoGo è l'uso dei formati e file corretti. L'utilizzo di sequenze di trascrizione tradotta come sequenze proteiche per accompagnare l'annotazione in formato GTF è il criterio principale. Un altro elemento critico quando si considera l'utilizzo di PoGo per mappare peptidi con aminoacido mismatch è memoria. Mentre memoria efficiente per un'applicazione standard, significativamente ed esponenzialmente crescente numero di possibili mapping con uno o due non corrispondenti conduce ad un aumento esponenziale allo stesso modo in memoria utilizzo18. Vi proponiamo un mapping in fasi, come descritto in questo protocollo per prima mappa i peptidi senza disallineamenti e rimuoverli dal set. I peptidi non precedentemente mappati successivi quindi possono essere mappati utilizzando una mancata corrispondenza e la procedura può essere ripetuta con due mismatch per i peptidi restanti non mappata.
Poiché ha aumentato significativamente la velocità effettiva della spettrometria di massa e studi interfacciamento genomico e proteomico dati sono sempre più frequenti negli ultimi anni, sono strumenti per consentire facilmente l'interfaccia di questi tipi di dati nello stesso sistema di coordinate sempre più indispensabile. Lo strumento presentato qui sarà di aiuto la necessità di combinare genomico e proteomico dati per migliorare una migliore comprensione di studi integrativi attraverso piccole e grandi set di dati mappando peptidi su un'annotazione di riferimento. Incoraggiante, PoGo è stato applicato per eseguire il mapping peptidi candidati gene forniti nello stesso formato come l'annotazione di riferimento per sostenere gli sforzi di annotazione di nuovi geni espressi nel testicolo umano35. L'approccio qui presentato è indipendente dei database utilizzati per identificazione del peptide. Il protocollo potrebbe aiutare nell'identificazione e visualizzazione dei prodotti di traduzione romanzo utilizzando adattato da sequenze di traduzione dei file di ingresso e GTF file da esperimenti di RNA-seq associati.
Diversi approcci e strumenti con una vasta gamma di scenari di applicazioni speciali per mappare peptidi Coordinate genomiche, che vanno dal mapping di peptidi direttamente alla sequenza del genoma a mapping di RNA-sequenziamento guidato, sono stati introdotti10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Tuttavia, questi possono provocare un guasto per mappare correttamente peptidi quando modificazioni post-traduzionali sono presenti ed errori nella mappatura sottostante di letture di RNA-sequenziamento possono essere propagati al livello del peptide. PoGo è stato sviluppato specificamente superare quegli ostacoli e affrontare il rapido aumento dei DataSet proteomic quantitativa ad alta risoluzione per l'integrazione con piattaforme di genomica ortogonale. Lo strumento descritto qui può essere integrato nei flussi di lavoro ad alta produttività. Tramite l'interfaccia grafica PoGoGUI, lo strumento è semplice da usare e non richiede alcuna formazione di bioinformatica di specialista.

Nelle cellule, genoma, trascrittoma e proteoma influenzano a vicenda per modulare una risposta agli stimoli interni ed esterni e interagiscono tra loro per svolgere funzioni specifiche che porta a salute e malattia. Quindi, caratterizzare e quantificare i geni, le trascrizioni e le proteine è cruciale per comprendere appieno i processi cellulari. Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è una delle strategie più comunemente applicate per identificare e quantificare l'espressione genica e trascrizione. Tuttavia, l'espressione della proteina è comunemente valutata mediante spettrometria di massa (MS). Significativi avanzamenti nella tecnologia MS nell'ultimo decennio ha permesso più una completa identificazione e quantificazione dei proteomi, rendere i dati comparabili con trascrittomica1. Proteogenomics e multi-omics come modi per integrare dati NGS e MS sono diventati potenti approcci per valutare processi cellulari attraverso più livelli molecolari, identificazione di sottotipi di cancro e portando a nuovi potenziali bersagli di droga nel cancro2 , 3. è importante notare che proteogenomics è stato inizialmente utilizzato per fornire la prova di proteomica per annotazioni gene e trascrizione4. Parecchi geni pensati di essere non-codificazione recentemente sono stati sottoposti a rivalutazione considerando il tessuto umano su larga scala i DataSet5,6,7. Inoltre, dati proteomica sono utilizzati con successo per sostenere gli sforzi di annotazione in organismi non-modello8,9. Tuttavia, proteogenomic l'integrazione dei dati possono essere sfruttati ulteriormente evidenziare l'espressione della proteina in relazione alle caratteristiche genomiche e delucidare cross-talk tra trascrizioni e proteine, fornendo un sistema combinato di riferimento e metodi per Co-visualizzazione.
Al fine di fornire un riferimento comune per dati di genomica, trascrittomica e proteomica, sono stati implementati numerosi strumenti per peptidi mapping identificati attraverso MS sul genoma coordinate10,11,12 ,13,14,15,16,17. Approcci differiscono in aspetti come riferimento per il mapping, il supporto di browser del genoma e grado di integrazione con altri strumenti di proteomica come mostrato in Figura 1. Mentre alcuni strumenti mappa inversione peptidi tradotte in un genoma16, altri usano una posizione di search engine con annotata all'interno di un'annotazione del gene e della proteina per ricostruire la sequenza nucleotidica del peptide15. Ancora altri usano una traduzione di 3 - o 6-struttura del genoma per mappare peptidi contro11,13. Infine, diversi strumenti di saltare le sequenze del nucleotide e utilizzano traduzioni di sequenza dell'amminoacido da trascritti di RNA-sequenziamento mappato come intermedio per mappare il genoma associato coordinate10,12, peptidi 14,17. Tuttavia, la traduzione di sequenze nucleotidiche è un processo lento e database personalizzati sono inclini a errori che si propagano alla mappatura del peptide. Per la mappatura di alto-rendimento e veloce, un piccolo e completo riferimento è cruciale. Pertanto, un riferimento di proteina standardizzato con genoma associato coordinate è essenziale per accurata del peptide alla mappatura del genoma. Nuovi aspetti in proteogenomics, come l'incorporazione di varianti e modifiche post-traduzionali (PTM)2,3, stanno guadagnando slancio attraverso studi recenti. Tuttavia, generalmente non sono supportati da corrente proteogenomic strumenti di mappatura, come mostrato nella Figura 1. Per migliorare la velocità e la qualità della mappatura, PoGo è stato sviluppato, uno strumento che permette la mappatura veloce e quantitativa dei peptidi a genomi18. Inoltre, PoGo consente la mappatura di peptidi con fino a due varianti di sequenza e modificazioni post-traduzionali con annotazioni.
PoGo è stato sviluppato per far fronte con il rapido aumento dei quantitativi DataSet ad alta risoluzione cattura proteomi e modifiche globali e fornisce un'utilità centrale per analisi su larga scala come variazione personali e medicina di precisione. Questo articolo descrive l'applicazione di questo strumento per visualizzare la presenza di modificazione post-traduzionale in relazione alle caratteristiche genomiche. Inoltre, questo articolo evidenzia l'individuazione degli eventi di splicing alternativi attraverso peptidi mappate e la mappatura dei peptidi identificati attraverso database personalizzati varianti di un genoma di riferimento. Questo protocollo si avvale di set di dati pubblicamente disponibili scaricato dal orgoglio archivio19 per dimostrare queste funzionalità di PoGo. Inoltre, questo protocollo descrive l'applicazione di TrackHubGenerator per la creazione di mozzi online accessibile dei peptidi mappati genomi per gli studi su larga scala proteogenomics.

<table><tbody><tr><td>PoGo (software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://github.com/cschlaffner/PoGo</td></tr><tr><td>PoGoGUI (software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://github.com/cschlaffner/PoGoGUI</td></tr><tr><td>TrackHubGenerator (software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://github.com/cschlaffner/TrackHubGenerator</td></tr><tr><td>Visualizzatore di genomica integrativa (software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>UCSC genoma browser (sito web)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>https://genome.ucsc.edu/</td></tr> <tr><td>GENCODE (sito web)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://gencodegenes.org</td></tr><tr><td>Ensembl (sito web)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://ensembl.org</td></tr><tr><td>bedToBigBed (software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td></tr><tr><td>fetchChromSizes.sh (software)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>http://hgdownload.soe.ucsc.edu/admin/exe/</td></tr></tbody></table>

un metodo veloce e quantitativo per la modificazione post-traduzionale e variante attivato mapping dei peptidi di genomi

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Cross-talk tra geni, trascrizioni e proteine è la chiave per risposte cellulari; quindi, analisi dei livelli molecolari come entità distinte lentamente viene esteso agli studi integrativi per migliorare la comprensione delle dinamiche molecolari all'interno delle cellule. Attuali strumenti per la visualizzazione e l'integrazione della proteomica con altri set di dati di omics sono inadeguate per gli studi su larga scala. Inoltre, catturano solo la sequenza base identificare, scartando le modificazioni post-traduzionali e quantificazione. Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato PoGo per mappare peptidi con associate modificazioni post-traduzionali e quantificazione di annotazione del genoma di riferimento. Inoltre, lo strumento è stato sviluppato per abilitare il mapping dei peptidi identificati dai database di sequenza personalizzata incorporando varianti di singolo amminoacido. Mentre PoGo è uno strumento da riga di comando, l'interfaccia grafica PoGoGUI consente ai ricercatori di non-bioinformatica mappare facilmente peptidi a 25 specie supportati da Ensembl annotazione del genoma. L'output generato prende in prestito i formati di file dal campo della genomica e, pertanto, la visualizzazione è supportata nella maggior parte dei browser del genoma. Per gli studi su larga scala, PoGo è supportato da TrackHubGenerator per creare web accessibile repository di dati mappati genomi che permettono anche una facile condivisione dei dati proteogenomics. Con poco sforzo, questo strumento può mappare milioni di peptidi di genomi di riferimento entro pochi minuti, superando altri strumenti disponibili identità di sequenza basato. Questo protocollo viene illustrato gli approcci migliori per proteogenomics mappatura tramite PoGo con set di dati pubblicamente disponibili di quantitativi e fosfoproteomica, nonché studi su larga scala.

Una rappresentazione grafica di evidenziazione a cui viene applicata la fase di un flusso di lavoro regolare proteomica PoGo18 , così come a valle opzioni di visualizzazione, è illustrato nella Figura 5. Proteomica di fucile da caccia (cioè, la digestione proteolitica delle proteine seguita da cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem) è un passo precursore del mapping proteogenomic. Gli spettri di massa tandem risultante sono comunemente rispetto al teorici spettri derivati da database di sequenza della proteina. Proteogenomics studi presentano sequenze di traduzione del romanzo trascrizioni con codifica varianti potenziali e non sinonimo di singolo nucleotide (SNVs) nel database, rendendo difficile a relazionarsi facilmente questi indietro con il genoma di riferimento8. L'interfaccia utente grafica di PoGo (PoGoGUI) supporta i formati di file per il reporting standardizzato di identificazioni di peptide da esperimenti di spettrometria di massa e li converte nel formato semplificato 4-colonna pogo. PoGoGUI avvolge lo strumento della riga di comando PoGo e quindi permette la mappatura dei peptidi sul genoma coordinate utilizzando l'annotazione di riferimento di geni di proteina-codificazione comunemente fornito nel GTF e le sequenze di trascrizione tradotta in formato FASTA. Diversi formati di output sono generati da PoGo per abilitare la visualizzazione dei diversi aspetti dei peptidi identificati mediante spettrometria di massa, tra cui modificazioni post-traduzionali e quantificazione livello del peptide. I file di output nel letto possono essere ulteriormente convertiti ed combinati in directory accessibile online chiamata mozzi pista. File di uscita singola, nonché mozzi pista, quindi possono essere visualizzati nel browser come l'UCSC Genome Browser25, Ensembl Genome Browser20, IGV24e Biodalliance28 (Vedi Figura 5 inferiore).
Abbiamo applicato PoGo per la rianalisi del progetto proteoma umano mappe filtrato a alto significato, come descritto in Wright et al. 7 e rispetto a due altri strumenti per la mappatura di proteogenomic, vale a dire iPiG14 e PGx10. Il dataset comprende 233.055 unici peptidi attraverso 59 tessuti adulti e fetali, risultante in un totale di oltre 3 milioni di sequenze. PoGo ha superato questi strumenti in fase di esecuzione (6.9 x e 96,4 x più veloce, rispettivamente) e l'utilizzo della memoria (20% e il 60% meno di memoria, rispettivamente) come mostrato nella Figura 618. Nella Figura 7è riportato un esempio di un peptide con successo mappato.
Mentre PoGo significativamente sovraperformato gli altri strumenti in velocità e memoria, è anche capace di modificazioni post-traduzionali di mappatura e informazioni quantitative connesso con peptidi sul genoma. Figura 8A raffigura schematicamente la visualizzazione del formato letto in un browser del genoma per peptidi mapping da un esone e da altra parte della giuntura giunzioni. PoGo utilizza l'opzione di colorazione per fornire facile aiuto visivo per quanto riguarda l'unicità della mappatura del peptide all'interno del genoma. Mapping in rosso indicano l'unicità di una trascrizione singola, mentre nero evidenzia il mapping a un singolo gene. Tuttavia, il peptide è condivisa tra diverse trascrizioni. Mapping di grigio mostrano un peptide condiviso tra geni multipli. Queste sono, per esempio, meno affidabile per la quantificazione di un gene o inaffidabile per chiamare l'espressione di un gene. L'opzione di PTM letto di PoGo ridefinisce il codice colore per ospitare diversi tipi di modificazioni post-traduzionali, come mostrato in Figura 8B. Inoltre, PTM sono indicati da blocchi di spessore (Vedi Figura 8B). Un singolo PTM di un tipo è evidenziato da un blocco di spesso nella posizione del residuo dell'amminoacido modificate, mentre PTMs multiple dello stesso tipo sono occupate da un blocco di spesso dal primo amminoacido modificato fino all'ultimo.
Abbiamo applicato PoGo e, successivamente, TrackHubGenerator a un dataset di 50 linee cellulari di cancro colorettale tra cui intero proteoma e phosphoproteome29. Mentre l'hub di traccia caricata nel Browser genoma UCSC Mostra i peptidi mappati il genoma e mette in evidenza l'unicità dei mapping e i siti di fosforilazione (Vedi Figura 9), nella cartella supplemento sono forniti ulteriori dati. I file GCT quindi attivare la visualizzazione del peptide e phosphopeptide quantificazione in un contesto genomico. Tuttavia, i file GCT non forniscono una visualizzazione semplice dei peptidi si estendono su giunzioni della giuntura (Vedi Figura 10 top). I peptidi sui nodi di giunzione sono divisi nelle loro rispettive parti mapping tra gli esoni. Mentre è possibile identificare peptidi della giuntura attraverso gli stessi valori quantitativi di mapping essone, mapping basato sulla sequenza di caricamento file come letto o GTF che collegano gli esoni di un introne sottile che attraversa la linea di supporto all'interpretazione (Vedi Figura 10 in basso).
Per evidenziare l'utilità della variante abilitata mappatura, abbiamo applicato il PoGo in due configurazioni a un dataset del proteoma umano testicolo cercato contro neXtProt a caccia di proteine mancante utilizzando una strategia multi-enzima22. Il neXtProt comprende oltre a sequenze della proteina di riferimento oltre 5 milioni di varianti di singolo amminoacido30. Mapping di peptidi identificati con una variante di singolo amminoacido non è supportato da altri strumenti di mappatura. Un totale di 177.012 unici peptidi sono stati identificati. Di questi, peptidi di 99,8% (176.694) in primo luogo sono stati mappati correttamente senza consentire disallineamenti. Rimuovendo quelli dall'elenco del peptide identificato ha provocato peptidi di 0,2% (318) che successivamente sono stati mappata permettendo una sostituzione dell'amminoacido. Ciò ha provocato 3.446 mapping di 162 peptidi che non sarebbero stati mappati il genoma di riferimento con qualsiasi altro strumento disponibile. Mentre il numero medio di mapping tra cui una mancata corrispondenza è alto, 62 peptidi sono stati associati a solo un singolo locus, che indica la vere variante sequenze. Un esempio di un peptide mappato con una singola sostituzione dell'amminoacido è evidenziato con la sequenza e la sequenza genomic tradotta nella Figura 11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig1.jpg"> Figura 1. Confronto visivo di strumenti di mapping del peptide al genoma diverso. Il confronto è indicato per quanto riguarda vari aspetti. Questi aspetti comprendono un riferimento di mappatura, il livello di integrazione nella rete e il supporto dei browser online e offline. Inoltre, nuovi aspetti della proteogenomics e il loro sostegno di funzionalità viene evidenziato separatamente. PoGo manca solo la capacità di mappare direttamente a una sequenza di genoma rispetto ad altri strumenti. Tuttavia, supporta tutte le caratteristiche novelle che non supportano la maggior parte degli altri strumenti. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig2.jpg"> Figura 2. File di input di esempio per i peptidi mappatura. PoGo accetta dati di input in un formato separato da tabulazioni con 4 colonne. Le intestazioni di colonna nella prima riga sono 'Esperimento', 'Peptide', 'PSMs' e 'Quant', che indica nelle righe che seguono l'esperimento o identificatore di esempio, la sequenza del peptide, il numero di corrispondenze di peptide-spettro e un valore quantitativo per il peptide, rispettivamente. Estensioni di file supportate sono *. txt, *.tsv e *.pogo. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig3.jpg"> Figura 3. PoGoGUI interfaccia con passaggi evidenziati per parametro opzioni e selezioni file. La figura mostra i passaggi per la selezione e il caricamento di tutti i file necessari e la selezione delle opzioni per i peptidi di mappatura con modificazioni post-traduzionali sul genoma umano di riferimento. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig4.jpg"> Figura 4. Screenshot dei dati Integrative Genomics Viewer (IGV) caricare procedura. La figura evidenzia la procedura per il caricamento di file di output di PoGo nel browser IGV. Inoltre, Mostra la possibilità di espandere la traccia dei peptidi mappate per evidenziare la mappatura e la sequenza. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig5.jpg"> Figura 5. Semplificate il flusso di lavoro di passi da LC-MS/MS per la visualizzazione nei browser genoma. PoGo mappatura segue l'identificazione dei peptidi da spettri di massa tandem. Per ottenere la mappatura del genoma, PoGo utilizza annotazione di riferimento fornito come annotazione del genoma (GTF) e sequenze di trascrizione traduzione (FASTA). Output di diversi formati sono generati che possono essere caricati separatamente in browser del genoma. Inoltre, i file in formato letto possono essere combinati in pista Hub supporta la visualizzazione di DataSet su larga scala. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig6.jpg"> Nella figura 6. PoGo contro PGx e iPiG di benchmarking. PoGo sorpassa gli altri strumenti sul benchmarking. Mappatura 233.055 unici peptidi attraverso 59 tessuti adulti e fetali con conseguente oltre 3 milioni di sequenze, PoGo era 6,9 x e 96,4 x più veloce di PGx e iPiG, rispettivamente. Inoltre, PoGo necessaria 20% e il 60% meno memoria rispetto a PGx e iPiG, rispettivamente. Mentre PoGo e PGx terminato con successo, iPiG ha provocato un errore di memoria a 16 GB. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig7v2.jpg"> Figura 7. Visualizzazione di esempio di browser UCSC genoma di peptidi mappate. La figura mostra peptidi mappati il gene mTOR. Mentre la pista combinata presenta i peptidi si estendono su giunzioni della giuntura ed eseguire il mapping solo di un esone con le sequenze associate, le tracce di tessuto-specifica solo evidenziano il mapping in un formato ridotto. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig7v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig8.jpg"> Figura 8. Schema di mapping di visualizzazione e codifica a colori. (A) nel file di output letto standard, peptidi mapping a un esone sono indicati come singoli blocchi (a sinistra), mentre peptidi mappatura attraverso multipli esoni clou dell'esone che coprono parti come blocchi (a destra). Gli introni sono mostrati come sottili linee di concatenazione. PoGo color-codes l'unicità di mappatura o peptidi ai geni e trascrizioni utilizzando un sistema a 3 livelli. (B) oltre alla struttura di blocco del formato letto, letto PTM uscita sottolinea la posizione di modificazioni post-traduzionali come blocchi di spessore. La presenza di un singolo PTM di un tipo mette in evidenza il residuo modificata dell'aminoacido con un blocco di spesso, mentre i luoghi multipli della stessa PTM sono combinati in blocchi lunghi che vanno dal primo all'ultimo sito modification. Mapping del peptide sono ulteriormente divisi di codec di tipo e colore PTM basato sulla modifica. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig9v2.jpg"> Nella figura 9. Tenere traccia di visualizzazione hub nel browser UCSC genoma del cancro colorettale proteoma e phosphoproteome dati. L'hub di pista comprende intero proteoma dati così come phosphoproteome. Mentre il colore rosso nelle tracce proteoma e phosphoproteome indicare l'unicità del mapping per la singola trascrizione di SFN, tracce che termina in _ptm Visualizza i siti di fosforilazione in peptidi. Qui, il colore rosso indica il tipo di modifica come fosforilazione. Solo due peptidi sono stati identificati con ogni mostrando una singola fosforilazione (blocchi di spessore). <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig9v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig10.jpg"> Figura 10. Vista del cancro colorettale fosfopeptidi e quantificazione associata a IGV. La figura mostra un sottoinsieme delle linee cellulari del 50 cancro. Esso inoltre presenta quattro colonne di blocchi in diverse tonalità di luce rosso. Il colore indica l'abbondanza relativa tra basso (bianco) e alta (rosso). Mentre le quattro colonne inizialmente potrebbero portare a credere che ci sono 4 peptidi, diventa chiaro con associato basato su sequenze GTF file di output che in realtà si tratta di due peptidi, ogni che abbracciano una giunzione della giuntura. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57633/57633fig11.jpg"> Figura 11. Vista del peptide con variante dell'aminoacido in IGV. La figura mostra un peptide con una variante di singolo amminoacido mappata il genoma di riferimento all'inizio di traduzione del gene GPSM1. La variante è posizionata a residuo dell'amminoacido 8 e risultati nella sostituzione dell'alanina per valina (A→V). Le sequenze di traduzione delle trascrizioni con annotazioni (blue) evidenziano la variante rispetto la sequenza del peptide. <a href="/files/ftp_upload/57633/57633fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui vi presentiamo lo strumento proteogenomic PoGo e protocolli per la modifica veloce, quantitativa e post-traduzionale e variante attivato mapping dei peptidi identificati mediante spettrometria di massa sul genoma di riferimento. Questo strumento è utile per integrare e visualizzare proteogenomic e studi di proteomica personali interfacciamento con dati di genomica ortogonale.

Un metodo veloce e quantitativo per la modificazione post-traduzionale e variante attivato Mapping dei peptidi di genomi

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

L'obiettivo generale di questo protocollo software è dimostrare l'uso di PoGo per mappare i peptidi con le modifiche post-traduzionali associate e le informazioni quantitative provenienti da esperimenti di spettrometria di massa per fare riferimento ai genomi e consentire l'integrazione e la visualizzazione con i dati di genomica ortogonale. Questo strumento può aiutare ad aggiungere informazioni genomiche agli elenchi di peptidi generati dalle ricerche di proteomica con spettrometria di massa in modo da facilitare l'integrazione con i dati di sequenziamento dell'RNA. Il vantaggio principale di questo strumento è che è semplice da usare, veloce e supporta informazioni aggiuntive come le modifiche post-traduzionali, la quantificazione e la varianza degli amminoacidi.Per iniziare, scaricare e installare il software illustrato in questo video come descritto nel protocollo di testo allegato. Una volta installato, accedere alla cartella degli eseguibili della GUI di PoGo e avviare il programma facendo doppio clic sull'icona della GUI di PoGo. Utilizzare il pulsante di selezione accanto all'eseguibile PoGo.Quindi navigare nella cartella degli eseguibili fino alla sottocartella del sistema operativo pertinente e selezionare il file PoGo eseguibile. Conferma la sua selezione facendo clic sul pulsante Apri. Quindi, selezionare il file di input di riferimento per le sequenze proteiche facendo clic su Seleziona.Andate alla cartella dei dati e selezionate il file del giorno di digiuno di traduzione. Confermare la selezione facendo clic su Apri. Selezionare il file di annotazione della trascrizione utilizzando il pulsante di selezione.Quindi vai alla cartella dei dati, seleziona il file GTF di annotazione e fai clic su Apri. Aggiungi il file di identificazione del peptide utilizzando il pulsante Aggiungi accanto ai file peptidici. Qui, seleziona il file nel formato supportato MZ Tab, MZ Ident ML o MZ ID, oppure nel formato a quattro colonne separato da tabulazioni.Inoltre, deseleziona le caselle di controllo accanto a BED NGTF nella selezione del formato di output. Lasciare solo PTM BED e GCT selezionati. Quindi selezionare la specie appropriata per i dati dalla selezione a discesa e avviare la mappatura facendo clic su Avvia.Innanzitutto, carica il file di output PoGo che termina con _ptm. bed nel visualizzatore di genomica integrativa. Ripetere l'operazione per caricare anche il file che termina con _noptm.bed.Questo file contiene tutti i peptidi trovati senza alcuna modifica. Riordina le tracce trascinandole nella posizione desiderata nell'elenco. Ogni file verrà mostrato come tracce separate con il nome del file che identifica la traccia.Ogni traccia viene inizialmente mostrata in modo compresso. Per espanderli, fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome della traccia e selezionare espanso per una visualizzazione completa dei peptidi, comprese le sequenze. Ora carica il file che termina con gct.Questo file contiene le informazioni sulla quantificazione dei peptidi. A differenza dei file caricati in precedenza, ogni campione annotato verrà caricato come una traccia separata. Riorganizzate i campioni come desiderato utilizzando le operazioni di trascinamento della selezione.Naviga all'interno del genoma selezionando un cromosoma nel menu a discesa, facendo clic e tenendo premuta una sezione di un cromosoma per ingrandire o digitando le coordinate genomiche. La mappatura PoGo può essere eseguita utilizzando l'interfaccia utente grafica o tramite l'interfaccia a riga di comando. In questa parte del protocollo, l'interfaccia della riga di comando viene utilizzata per evidenziare l'intercambiabilità.Per mappare i peptidi varianti ottenuti attraverso i passaggi precedenti nel protocollo di testo al genoma di riferimento, aprire un prompt dei comandi e accedere alla cartella degli eseguibili di PoGo. Quindi digita il comando mostrato qui. Confermare l'esecuzione premendo il tasto Invio e attendere il termine dell'esecuzione prima di procedere ulteriormente.Visualizza i peptidi mappati senza discrepanza e con discrepanza nel visualizzatore di genomica integrativa. Nel software dell'interfaccia utente grafica PoGo, aggiungere i file di identificazione dei peptidi utilizzando il pulsante Aggiungi accanto ai file dei peptidi e selezionare uno o più file, nonché trascinare e rilasciare nel campo vuoto sotto i file dei peptidi. Quindi deseleziona le caselle di controllo accanto a PTM BED, GTF e GCT nella sezione del formato di output e lascia selezionato solo BED.Inoltre, seleziona l'opzione unisci più file di input in un unico output. Ciò si tradurrà in un singolo file di output che combina tutti i peptidi dei file di input. Se si lascia questa opzione deselezionata, si otterrà un'esecuzione sequenziale del programma per ciascun file di input separatamente.Quindi, seleziona la specie appropriata per i dati dal menu a discesa che è coerente con i file NGTF del giorno veloce. Una volta selezionato, avvia la mappatura facendo clic sul pulsante di avvio. Per generare un hub di traccia da peptidi mappati, aprire una finestra di terminale e digitare il seguente comando nel prompt dei comandi.Confermare l'esecuzione premendo il tasto Invio. L'esecuzione richiederà solo poco tempo per essere completata. Una volta terminato, trasferisci l'hub di traccia generato con tutto il suo contenuto su un server FTP accessibile via web o GitHub.In un browser Web, accedere al browser UCSC Genome e selezionare My Data Track Hubs. Quindi fare clic sulla scheda I miei hub. Copiare l'URL dell'hub della traccia nel campo di testo, quindi caricare l'hub della traccia facendo clic su aggiungi hub.Infine, seleziona il browser del genoma per accedere alla visualizzazione del browser. Il mozzo della pista personalizzata verrà visualizzato in cima all'elenco. Se più file BED hanno creato la base per l'hub di traccia, ciascuno dei file verrà rappresentato come una traccia separata all'interno dell'hub.PoGo e altri due strumenti di mappatura proteogenomica sono confrontati qui per il loro utilizzo complessivo della memoria e il tempo di esecuzione analitico. PoGo supera significativamente gli altri strumenti sia in termini di velocità che di memoria ed è in grado di mappare le modifiche post-traduzionali e le informazioni quantitative associate ai peptidi sul genoma. PoGo utilizza l'opzione di colorazione per fornire un facile aiuto visivo rispetto all'unicità della mappatura dei peptidi all'interno del genoma.Le mappature in rosso indicano l'unicità di un singolo trascritto, mentre il blocco evidenzia la mappatura di un singolo gene. Le mappature grigie mostrano peptidi condivisi tra più geni. L'opzione PTM BED di PoGo ridefinisce il codice colore per adattarsi a diversi tipi di modifiche post-traduzionali, indicando la posizione della modifica con un blocco spesso in corrispondenza del residuo di amminoacidi modificato.Nei dati del proteoma mostrati qui che rappresentano quelli del cancro del colon-retto, sono stati identificati solo due peptidi, ciascuno dei quali mostra una singola fosforilazione. Le informazioni nel file GCT di output forniscono valori quantitativi per le regioni genomiche coperte dai peptidi. I peptidi che attraversano le giunzioni di giunzione sono divisi nelle loro parti senza essere collegati.Per informazioni più complete sulla giunzione, è necessario anche il file GTF di output. Una volta scaricate e configurate le sequenze proteiche di riferimento e l'annotazione, è possibile mappare migliaia di peptidi sulle coordinate genomiche in meno di cinque minuti, senza consentire disallineamenti di sequenza. Quando si tenta di mappare i peptidi sui genomi di riferimento utilizzando PoGo, è importante ricordare di utilizzare le sequenze tradotte dei trascritti di codifica delle proteine e l'annotazione dei trascritti associati.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare PoGo e PoGo GUI per mappare i peptidi da esperimenti di spettrometria di massa proteomica con informazioni associate su genomi di riferimento e visualizzarli.

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Presentiamo un metodo per la purificazione, il rilevamento e l'identificazione di peptidi diGly che provengono da proteine ubiquitinate da campioni biologici complessi. Il metodo presentato è riproducibile, robusto e supera i metodi pubblicati rispetto al livello di profondità dell'analisi dell'ubiquitinome.

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Questo flusso di lavoro descrive contemporaneamente le prestazioni dell'arricchimento in termini di tempo ed efficiente in termini di costi di più modifiche post-traslazionali proteiche (PPM) per l'analisi proteomica globale quantitativa. Il protocollo utilizza l'arricchimento PTM a livello di peptide con più anticorpi coniugati, seguito dall'analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sul crosstalk PTM.

Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

La proteina arginina (R)-metilazione è una diffusa modificazione post-traduzionale che regola molteplici percorsi biologici. La spettrometria di massa è la migliore tecnologia per profilare globalmente il R-metil-proteoma, quando accoppiata ad approcci biochimici per l'arricchimento peptidico modificato. Il flusso di lavoro progettato per l'identificazione ad alta confidenza della R-metilazione globale nelle cellule umane è descritto qui.

Un approccio proteomico basato sulla spettrometria di massa per l'analisi globale e ad alta confidenza della R-metilazione delle proteine

Le modifiche post-traduzionali (PTM) modificano le strutture e le funzioni delle proteine. I metodi per l'arricchimento simultaneo di più tipi di PTM possono massimizzare la copertura nelle analisi. Presentiamo un protocollo che utilizza cromatografia di affinità metallica immobilizzata Ti(IV) a doppia funzionalità seguita da spettrometria di massa per l'arricchimento e l'analisi simultanei della proteina N-glicosilazione e fosforilazione nei tessuti pancreatici.

Una strategia di arricchimento spin-tip per l'analisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani

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Impara a mappare i peptidi con modificazioni post-traduzionali e dati quantitativi da spettrometria di massa su genomi di riferimento con PoGo. Questo metodo facilita l'integrazione con dati genomici ortogonali.

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