Un metodo veloce e quantitativo per la modificazione post-traduzionale e variante attivato Mapping dei peptidi di genomi

L'obiettivo generale di questo protocollo software è dimostrare l'uso di PoGo per mappare i peptidi con le modifiche post-traduzionali associate e le informazioni quantitative provenienti da esperimenti di spettrometria di massa per fare riferimento ai genomi e consentire l'integrazione e la visualizzazione con i dati di genomica ortogonale. Questo strumento può aiutare ad aggiungere informazioni genomiche agli elenchi di peptidi generati dalle ricerche di proteomica con spettrometria di massa in modo da facilitare l'integrazione con i dati di sequenziamento dell'RNA. Il vantaggio principale di questo strumento è che è semplice da usare, veloce e supporta informazioni aggiuntive come le modifiche post-traduzionali, la quantificazione e la varianza degli amminoacidi.

Per iniziare, scaricare e installare il software illustrato in questo video come descritto nel protocollo di testo allegato. Una volta installato, accedere alla cartella degli eseguibili della GUI di PoGo e avviare il programma facendo doppio clic sull'icona della GUI di PoGo. Utilizzare il pulsante di selezione accanto all'eseguibile PoGo.

Quindi navigare nella cartella degli eseguibili fino alla sottocartella del sistema operativo pertinente e selezionare il file PoGo eseguibile. Conferma la sua selezione facendo clic sul pulsante Apri. Quindi, selezionare il file di input di riferimento per le sequenze proteiche facendo clic su Seleziona.

Andate alla cartella dei dati e selezionate il file del giorno di digiuno di traduzione. Confermare la selezione facendo clic su Apri. Selezionare il file di annotazione della trascrizione utilizzando il pulsante di selezione.

Quindi vai alla cartella dei dati, seleziona il file GTF di annotazione e fai clic su Apri. Aggiungi il file di identificazione del peptide utilizzando il pulsante Aggiungi accanto ai file peptidici. Qui, seleziona il file nel formato supportato MZ Tab, MZ Ident ML o MZ ID, oppure nel formato a quattro colonne separato da tabulazioni.

Inoltre, deseleziona le caselle di controllo accanto a BED NGTF nella selezione del formato di output. Lasciare solo PTM BED e GCT selezionati. Quindi selezionare la specie appropriata per i dati dalla selezione a discesa e avviare la mappatura facendo clic su Avvia.

Innanzitutto, carica il file di output PoGo che termina con _ptm. bed nel visualizzatore di genomica integrativa. Ripetere l'operazione per caricare anche il file che termina con _noptm.bed.

Questo file contiene tutti i peptidi trovati senza alcuna modifica. Riordina le tracce trascinandole nella posizione desiderata nell'elenco. Ogni file verrà mostrato come tracce separate con il nome del file che identifica la traccia.

Ogni traccia viene inizialmente mostrata in modo compresso. Per espanderli, fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome della traccia e selezionare espanso per una visualizzazione completa dei peptidi, comprese le sequenze. Ora carica il file che termina con gct.

Questo file contiene le informazioni sulla quantificazione dei peptidi. A differenza dei file caricati in precedenza, ogni campione annotato verrà caricato come una traccia separata. Riorganizzate i campioni come desiderato utilizzando le operazioni di trascinamento della selezione.

Naviga all'interno del genoma selezionando un cromosoma nel menu a discesa, facendo clic e tenendo premuta una sezione di un cromosoma per ingrandire o digitando le coordinate genomiche. La mappatura PoGo può essere eseguita utilizzando l'interfaccia utente grafica o tramite l'interfaccia a riga di comando. In questa parte del protocollo, l'interfaccia della riga di comando viene utilizzata per evidenziare l'intercambiabilità.

Per mappare i peptidi varianti ottenuti attraverso i passaggi precedenti nel protocollo di testo al genoma di riferimento, aprire un prompt dei comandi e accedere alla cartella degli eseguibili di PoGo. Quindi digita il comando mostrato qui. Confermare l'esecuzione premendo il tasto Invio e attendere il termine dell'esecuzione prima di procedere ulteriormente.

Visualizza i peptidi mappati senza discrepanza e con discrepanza nel visualizzatore di genomica integrativa. Nel software dell'interfaccia utente grafica PoGo, aggiungere i file di identificazione dei peptidi utilizzando il pulsante Aggiungi accanto ai file dei peptidi e selezionare uno o più file, nonché trascinare e rilasciare nel campo vuoto sotto i file dei peptidi. Quindi deseleziona le caselle di controllo accanto a PTM BED, GTF e GCT nella sezione del formato di output e lascia selezionato solo BED.

Inoltre, seleziona l'opzione unisci più file di input in un unico output. Ciò si tradurrà in un singolo file di output che combina tutti i peptidi dei file di input. Se si lascia questa opzione deselezionata, si otterrà un'esecuzione sequenziale del programma per ciascun file di input separatamente.

Quindi, seleziona la specie appropriata per i dati dal menu a discesa che è coerente con i file NGTF del giorno veloce. Una volta selezionato, avvia la mappatura facendo clic sul pulsante di avvio. Per generare un hub di traccia da peptidi mappati, aprire una finestra di terminale e digitare il seguente comando nel prompt dei comandi.

Confermare l'esecuzione premendo il tasto Invio. L'esecuzione richiederà solo poco tempo per essere completata. Una volta terminato, trasferisci l'hub di traccia generato con tutto il suo contenuto su un server FTP accessibile via web o GitHub.

In un browser Web, accedere al browser UCSC Genome e selezionare My Data Track Hubs. Quindi fare clic sulla scheda I miei hub. Copiare l'URL dell'hub della traccia nel campo di testo, quindi caricare l'hub della traccia facendo clic su aggiungi hub.

Infine, seleziona il browser del genoma per accedere alla visualizzazione del browser. Il mozzo della pista personalizzata verrà visualizzato in cima all'elenco. Se più file BED hanno creato la base per l'hub di traccia, ciascuno dei file verrà rappresentato come una traccia separata all'interno dell'hub.

PoGo e altri due strumenti di mappatura proteogenomica sono confrontati qui per il loro utilizzo complessivo della memoria e il tempo di esecuzione analitico. PoGo supera significativamente gli altri strumenti sia in termini di velocità che di memoria ed è in grado di mappare le modifiche post-traduzionali e le informazioni quantitative associate ai peptidi sul genoma. PoGo utilizza l'opzione di colorazione per fornire un facile aiuto visivo rispetto all'unicità della mappatura dei peptidi all'interno del genoma.

Le mappature in rosso indicano l'unicità di un singolo trascritto, mentre il blocco evidenzia la mappatura di un singolo gene. Le mappature grigie mostrano peptidi condivisi tra più geni. L'opzione PTM BED di PoGo ridefinisce il codice colore per adattarsi a diversi tipi di modifiche post-traduzionali, indicando la posizione della modifica con un blocco spesso in corrispondenza del residuo di amminoacidi modificato.

Nei dati del proteoma mostrati qui che rappresentano quelli del cancro del colon-retto, sono stati identificati solo due peptidi, ciascuno dei quali mostra una singola fosforilazione. Le informazioni nel file GCT di output forniscono valori quantitativi per le regioni genomiche coperte dai peptidi. I peptidi che attraversano le giunzioni di giunzione sono divisi nelle loro parti senza essere collegati.

Per informazioni più complete sulla giunzione, è necessario anche il file GTF di output. Una volta scaricate e configurate le sequenze proteiche di riferimento e l'annotazione, è possibile mappare migliaia di peptidi sulle coordinate genomiche in meno di cinque minuti, senza consentire disallineamenti di sequenza. Quando si tenta di mappare i peptidi sui genomi di riferimento utilizzando PoGo, è importante ricordare di utilizzare le sequenze tradotte dei trascritti di codifica delle proteine e l'annotazione dei trascritti associati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare PoGo e PoGo GUI per mappare i peptidi da esperimenti di spettrometria di massa proteomica con informazioni associate su genomi di riferimento e visualizzarli.