Name: Una strategia di arricchimento spin-tip per lanalisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Scopri la cromatografia di affinità metallica con titanio bifunzionale per l'arricchimento simultaneo di N-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani. Questo metodo migliora la scoperta di biomarcatori per diabete e cancro.

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Questa ricerca è stata supportata in parte da sovvenzioni del NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 e R21AG065728) e della Juvenile Diabetes Research Foundation (1-PNF-2016-250-S-B e SRA-2016-168-S-B). I dati qui presentati sono stati anche in parte ottenuti grazie al supporto di un premio NIH/NCATS UL1TR002373 attraverso l'Istituto per la ricerca clinica e traslazionale dell'Università del Wisconsin. Gli strumenti Orbitrap sono stati acquistati attraverso il supporto di una sovvenzione per strumenti condivisi NIH (NIH-NCRR S10RR029531) e dell'Ufficio del Vice Cancelliere per la ricerca e l'istruzione universitaria presso l'Università del Wisconsin-Madison. Vorremmo anche riconoscere il generoso sostegno dell'Organizzazione per la donazione di organi e tessuti dell'Università del Wisconsin che ha fornito pancreas umano per la ricerca e l'aiuto di Dan Tremmel, Dr. Sara D. Sackett e Prof. Jon Odorico per aver fornito i campioni al nostro laboratorio. Il nostro team di ricerca desidera ringraziare in modo speciale le famiglie che hanno donato tessuti per questo studio. L.L. riconosce la sovvenzione NIH S10OD025084, una sovvenzione pilota per il cancro al pancreas del Carbone Cancer Center dell'Università del Wisconsin (233-AAI9632), nonché una Vilas Distinguished Achievement Professorship e la Charles Melbourne Johnson Distinguished Chair Professorship con finanziamenti forniti dalla Wisconsin Alumni Research Foundation e dalla University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

È stato ottenuto il consenso per l'uso dei tessuti pancreatici per la ricerca dai parenti più prossimi del defunto ed è stata ottenuta un'autorizzazione da parte dell'Università del Wisconsin-Madison Health Sciences Institutional Review Board. La supervisione dell'IRB non è richiesta perché non coinvolge soggetti umani come riconosciuto da 45 CFR 46.102(f).
ATTENZIONE: Prestare attenzione quando si maneggiano i reagenti utilizzati in questo protocollo, che includono acidi (formico, acetico, trifluoroacetico), basi (idrossido di ammonio) e criogeni (azoto liquido). Leggere le schede di dati di sicurezza dei reagenti utilizzati per acquisire familiarità con i pericoli associati e le precauzioni necessarie. Le concentrazioni indicate con percentuali sono volume/volume totale (v/v) e sono diluite con acqua.
1. Crio-polverizzazione dei tessuti, lisi ed estrazione di proteine
<ol><li>Riempire un dewar con azoto liquido. Pre-raffreddare le parti del polverizzatore tissutale che verranno a contatto con i tessuti pancreatici, vale a dire la camera, il polverizzatore e il cucchiaio di recupero in un contenitore di polistirolo.</li>
	<li>Trasferire i pezzi di tessuto congelato nel portacampioni pre-refrigerato e aggiungere un cucchiaio di azoto liquido al tessuto.</li>
	<li>Posizionare il polverizzatore nella camera e colpirlo usando un martello da cinque a dieci volte per schiacciare il campione. Rimuovere il polverizzatore dalla camera e raschiare via la polvere e i pezzi di tessuto aderenti.</li>
	<li>Aggiungere un cucchiaio di azoto liquido alla camera se i tessuti iniziano a sciogliersi. Ripetere il processo di polverizzazione fino a quando il campione è una polvere fine senza grossi pezzi di tessuto. Porzionare i campioni in aliquote da circa 100 mg in provette pre-refrigerate.</li>
	<li>Preparare un tampone di lisi contenente il 4% di sodio dodecil solfato (SDS), 150 mM NaCl e 25 mM Tris (pH = 7,4). Sciogliere una compressa ciascuna di inibitore della proteasi e della fosfatasi in 500 μL di acqua per una scorta di 20x di ciascuno. Aggiungere il volume richiesto di 20x stock di ciascun inibitore al tampone di lisi per una concentrazione finale di 1x.</li>
	<li>Aggiungere 600 μL di tampone di lisi per 100 mg di tessuto al tubo e incubare a 95 °C in un blocco riscaldante per 10 minuti con agitazione a 800 giri/min. Rimuovere i campioni dal blocco riscaldante e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sonicare i campioni a 60 W di energia (20 kHz) per 45 s utilizzando impulsi da 15 s con un riposo di 30 s in mezzo. Pellet i campioni a 3.000 x g per 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere il surnatante a un solvente per precipitazione 5x, 300 μL di tampone di lisi a 1,5 mL di solvente per precipitazione, contenente il 50% di acetone, il 49,9% di etanolo e lo 0,1% di acido acetico. Raffreddare durante la notte a -20 °C.</li>
	<li>Pelletttare nuovamente i campioni a 3.000 x g per 15 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Lavare il pellet rompendo con una spatola e mescolando con la stessa quantità di solvente per precipitazione. Pellet di nuovo, ripetendo la fase di lavaggio 2x.</li>
	<li>Pellet il campione a 16.000 x g per 15 min a 4 °C. Asciugare all'aria il pellet campione in una cappa aspirante per 15 minuti e conservare a -80 °C fino al momento di procedere.</li>
</ol>2. Digestione e dissalazione delle proteine
<ol><li>Sospendere il pellet proteico in 300 μL di tampone digestivo appena prodotto contenente 50 mM di bicarbonato di trietilammonio (TEAB) e 8 M di urea.</li>
	<li>Stimare la concentrazione proteica della soluzione utilizzando un saggio proteico secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Alla proteina nella soluzione, aggiungere il ditiotreitolo (DTT) a una concentrazione finale di 5 mM, mescolare e ridurre a temperatura ambiente per 1 ora. Quindi, aggiungere iodoacetammide (IAA) a una concentrazione finale di 15 mM, mescolare e alchilare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Spegnere l'alchilazione ripetendo l'aggiunta di DTT nello stesso volume di prima e mescolare.</li>
	<li>Aggiungere LysC/tripsina a 1:100 rapporto enzima/proteina e incubare a 37 °C per 4 ore. Quindi, aggiungere 50 mM TEAB per diluire l'urea 8 M utilizzata per < 1 M. Aggiungere tripsina a 1:100 rapporto enzima/proteina e incubare a 37 °C durante la notte.</li>
	<li>Spegnere la digestione con l'aggiunta di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,3% v/v. Per ogni 1 mg di proteina di partenza, somministrare una cartuccia dissalazione (1 cc, 10 mg) con 1 mL di acetonitrile (ACN) e 3x con 1 mL di TFA allo 0,1%.</li>
	<li>Caricare la miscela digerita sulla cartuccia di desalinizzazione. Lavare la miscela 3x utilizzando 1 mL di TFA allo 0,1%. Se l'eluizione è lenta, applicare una pressione positiva ma evitare una portata > una goccia al secondo.</li>
	<li>Peptidi eluiti utilizzando 1 mL di soluzione di acido formico al 60% di ACN e 0,1% di acido formico (FA). Essiccare i peptidi eluiti a circa 35 °C utilizzando un concentratore di vuoto centrifugo fino a quando il solvente non è completamente evaporato.</li>
	<li>Sospendere i peptidi in 300 μL di acqua e stimare le concentrazioni di peptidi utilizzando un test peptidico secondo il protocollo del produttore. Porzionare i peptidi in aliquote da 500 μg e asciugare completamente.</li>
</ol>3. Arricchimento ERLIC N-glicopeptide
NOTA: le velocità e i tempi esatti della centrifuga possono variare in base ai campioni e devono essere ottimizzati. In generale, 300 x g per 2 min è appropriato per il condizionamento e il lavaggio del materiale e 100 x g per 5 min per l'eluizione.
<ol><li>Pesare circa 3 mg di cotone idrofilo e imballarlo in una punta di pipetta vuota da 200 μL (spin-tip; vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Trasferire un forte materiale di arricchimento a scambio anionico in un tubo e aggiungere 200 μL di TFA allo 0,1% per materiale da 10 mg. Per l'arricchimento di 500 μg di peptidi, utilizzare 15 mg del materiale. Attivare il materiale agitando per 15 min.</li>
	<li>Utilizzando un adattatore per tubi, posizionare la punta di rotazione su un tubo da 2 ml e aggiungere abbastanza liquame alla punta per 15 mg di materiale. Rimuovere il liquido ruotando in una centrifuga da banco.</li>
	<li>Condizionare il materiale centrifugando 3x con 200 μL di ACN. Ripetere il condizionamento triplicato utilizzando 100 mM di acetato di ammonio (NH4Ac), 1% TFA e 80% ACN/0,1% TFA (buffer di carico).</li>
	<li>Sospendere campioni di peptidi da 500 μg in circa 200 μL di buffer di carico e fluire attraverso la punta di spin. Ricaricare il flusso passante 2 volte per garantire l'associazione completa.</li>
	<li>Lavare il materiale centrifugando 5x utilizzando 200 μL di 80% ACN/0,1% TFA, e poi 2x utilizzando 200 μL di 80% ACN/0,1% FA.</li>
	<li>Eluire i peptidi centrifugando con 200 μL di ciascuno dei seguenti: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 mM KH2PO4, 10% ACN (E4).</li>
	<li>Lavare il materiale centrifugando 2x con 200 μL di 80% ACN/5% NH4OH. Eluire i peptidi rimanenti con 200 μL del 10% NH4OH (E5).</li>
	<li>Asciugare completamente tutte le eluizioni utilizzando un concentratore di vuoto centrifugo a circa 35 °C.</li>
	<li>Eseguire la desalinizzazione dell'eluizione di base (E5) utilizzando una punta di dissalazione secondo il protocollo del produttore.</li>
	<li>Asciugare l'eluizione dalla punta di dissalazione utilizzando un concentratore di vuoto centrifugo a circa 35 °C fino alla completezza.</li>
</ol>4. Arricchimento fosfopeptide Ti(IV)-IMAC
NOTA: le velocità e i tempi esatti della centrifuga possono variare in base ai campioni e devono essere ottimizzati. In generale, 300 x g per 2 min è appropriato per il condizionamento e il lavaggio del materiale e 100 x g per 5 min per l'eluizione.
<ol><li>Pesare circa 3 mg di cotone idrofilo e imballarlo in una punta della pipetta vuota da 200 μL (spin-tip).</li>
	<li>Trasferire il materiale di arricchimento fosfopeptidico Ti-IMAC in un tubo e aggiungere 200 μL di TFA allo 0,1% per materiale da 10 mg. Per l'arricchimento di peptidi da 500 μg, utilizzare 10 mg di materiale.</li>
	<li>Utilizzando un adattatore per tubi, posizionare la punta di rotazione su un tubo da 2 ml e aggiungere abbastanza liquame alla punta per 10 mg di materiale. Rimuovere il liquido ruotando in una centrifuga da banco.</li>
	<li>Condizionare il materiale con 200 μL di 40% ACN/3% TFA utilizzando le stesse impostazioni della centrifuga sopra descritte. Sospendere i campioni di peptidi in 200 μL di 40% ACN/3% TFA e fluire attraverso la punta di spin. Ricaricare il flow-through due volte per garantire un binding più completo.</li>
	<li>Lavare il materiale centrifugando con 200 μL di soluzione al 50% di ACN, 6% TFA e 200 mM di NaCl, seguito dal lavaggio 2x in 200 μL di soluzione al 30% di ACN e 0,1% di TFA.</li>
	<li>Peptidi eluiti con 200 μL del 10% NH4OH. Asciugare completamente l'eluizione sotto vuoto. Eseguire la desalinizzazione utilizzando una punta di dissalazione secondo il protocollo del produttore. Asciugare l'eluizione dalla punta di dissalazione sotto vuoto alla completezza.</li>
</ol>5. Arricchimento simultaneo Ti(IV) a doppia funzionalità
NOTA: le velocità e i tempi esatti della centrifuga possono variare in base ai campioni e devono essere ottimizzati. In generale, 300 x g per 2 min è appropriato per il condizionamento e il lavaggio del materiale e 100 x g per 5 min per l'eluizione.
<ol><li>Pesare circa 3 mg di cotone idrofilo e imballarlo in una punta vuota.</li>
	<li>Trasferire circa 1 g di materiale Ti(IV)-IMAC in un tubo. Aggiungere lo 0,1% di TFA a una concentrazione nota di materiale, ad esempio 20 mg/200 μL (il materiale può essere conservato in questa sospensione a 4 °C).</li>
	<li>Per l'arricchimento da peptidi da 500 μg, aggiungere abbastanza liquame a una punta di spin per trasferire 20 mg di materiale. Lavare la punta di centrifugazione con 200 μL di TFA allo 0,1%.</li>
	<li>Risospesare i campioni in 200 μL di solvente di carico/lavaggio (80% ACN e 3% TFA) e fluire attraverso la punta di centrifuga. Ricaricare il flusso passante 2x.</li>
	<li>Lavare la punta di centrifuga 6x centrifugando con 200 μL di solvente di carico/lavaggio. Lavare la punta di centrifuga con 200 μL di soluzione all'80% di ACN/0,1% FA.</li>
	<li>Eluire i peptidi con 200 μL di ciascuno dei seguenti: 60% ACN/0,1% FA (E1) e 40% ACN/0,1% FA (E2). Analizzare ogni eluizione separatamente.</li>
	<li>Eluire i peptidi con 200 μL di ciascuno dei seguenti: 20% ACN/ 0,1% FA e 0,1% FA. Combinare le due eluizioni e analizzare come un unico campione (E3).</li>
	<li>Eluire i peptidi con 200 μL di ciascuno dei seguenti: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 mM NaCl; e 30% ACN/0,1% TFA. Combinare queste eluizioni e analizzarle come una (E4) dopo la dissalazione utilizzando una punta imballata.</li>
	<li>Condizionare il materiale al pH di base utilizzando 200 μL di 90% ACN/2,5% NH4OH per 3x. Scartare questi lavaggi.</li>
	<li>Eluire i peptidi con 200 μL di ciascuno dei seguenti: 60% ACN/10% NH4OH (E5) e 40% ACN/10% NH4OH (E6). Analizzare queste eluizioni separatamente dopo la dissalazione utilizzando una punta imballata.</li>
	<li>Eluire i peptidi con 200 μL di ciascuno dei seguenti: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; e 10% NH4OH. Combinare queste eluizioni e analizzarle come una (E7) dopo la dissalazione utilizzando una punta imballata.</li>
	<li>Asciugare completamente tutte le eluizioni sotto vuoto.</li>
</ol>6. Cromatografia liquida a fase inversa a nano-flusso-spettrometria di massa (nRPLC-MS)
NOTA: i metodi di acquisizione e analisi dei dati MS sono diversi e pertanto solo una pipeline LC-MS suggerita (e i parametri associati) è descritta qui nei passaggi seguenti. I campioni generati utilizzando le fasi di preparazione e arricchimento del campione precedentemente delineate possono essere analizzati utilizzando altre configurazioni strumentali, incluso l'utilizzo di colonne cromatografiche disponibili in commercio, data una qualità dei dati sufficiente.
<ol><li>Tirare e imballare un capillare lungo 15 cm (diametro interno di 75 μm) utilizzando materiale C18 come descritto in19. Preparare la fase mobile A (0,1% FA in acqua) e la fase mobile B (0,1% FA in ACN).</li>
	<li>Ricostituire campioni peptidici arricchiti in 15 μL di fase B mobile al 3%. Caricare 2 μL del campione (~ 13% volume del campione) direttamente sulla colonna. Analizzare ogni campione in duplicato tecnico.</li>
	<li>Peptidi eluti utilizzando un gradiente dal 3% al 30% di fase B mobile per 90 minuti ad una portata di 0,3 μL/min. Lavare la colonna utilizzando il 75% B per 8 min seguito dal 95% B per 8 min, terminando il metodo con equilibratura al 3% B per 12 min.</li>
	<li>Azionare lo spettrometro di massa in modalità ioni positivi utilizzando l'acquisizione data-dipendente dei primi 20 picchi con i seguenti parametri: tensione di spruzzatura 2 kV; Rilevamento MS1 in LC/MS da 400-2.000 m/z a risoluzione 120.000, target di controllo automatico del guadagno (AGC) 2E5, tempo massimo di iniezione di 100 ms, obiettivo RF al 30%, isolamento quadrupolo con finestra da 1,6 m/z , per stati di carica 2-8 e indeterminato ed esclusione dinamica di 30 s; Rilevamento di MS2 nel LC/MS utilizzando la frammentazione HCD a gradini al 22%, 30% e 38%, massa fissa di prima massa 120 m/z a risoluzione 30.000, target AGC 5E4 e requisito di intensità minima 2.5E4.</li>
</ol>7. Analisi dei dati MS
NOTA: qui viene presentata una pipeline di analisi dei dati che utilizza due software diversi per analizzare lo stesso set di dati. La fosforilazione e la glicosilazione possono essere ricercate contemporaneamente utilizzando un singolo software anziché due software separati come descritto qui, anche se in generale, il tempo di ricerca del software è proporzionale allo spazio di ricerca, cioè al numero di PTM considerati. Per questo motivo, due diversi software vengono utilizzati in parallelo alla ricerca di glicopeptidi e fosfopeptidi.
<ol><li>Elaborare i file di dati grezzi utilizzando il software appropriato (vedere Tabella dei materiali).<ol>
<li>Cerca spettri nel database umano UniProt (o specie specifico appropriato). Impostare la carbamidometilazione di Cys come modifica fissa. Impostate il numero massimo di scissioni enzimatiche mancate come due.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nei file di dati grezzi, utilizzando un software commerciale (vedi Tabella dei materiali), cerca i glicopeptidi da analizzare20. Utilizzare una tolleranza di massa del precursore di 10 ppm e una tolleranza di massa del frammento di 0,01 Da con una lunghezza minima del peptide di quattro residui.<ol>
<li>Ricerca utilizzando il database N-glycan incorporato nel software espanso con i tipici glicani mannosio-6-fosfato (M6P), inclusi HexNAc (2) Hex (4-9) Phospho (1-2), HexNAc (3-4) Hex (4-9) Phospho (1-2), HexNAc (2) Hex (3-4) Phospho (1) e HexNAc (3) Hex (3-4) Phospho (1).</li>
		<li>Impostare N-glicosilazione come modifica comune. Impostare le modifiche totali massime per corrispondenza spettrale peptidica (PSM) come una comune e due rare.</li>
		<li>Impostare le seguenti modifiche variabili: ossidazione di Met (raro), deamidazione ad Asn e Gln (raro) e fosforilazione a Ser, Thr e Tyr (comune). Impostare i seguenti filtri di identificazione: score cut-off > 150, |log prob| > 1 e il punteggio delta mod > 10.</li>
		<li>Esporta e analizza i risultati della ricerca nelle schede Proteine e Gruppo peptidico.</li>
		<li>Esaminare manualmente le identificazioni contenenti glicani M6P per la presenza dello ione ossonio PhosphoHex (243 m/z) negli spettri MS/MS e rimuovere le identificazioni false positive, che non contengono questo ione diagnostico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nei file di dati grezzi, utilizzando un software open source (vedi Tabella dei materiali), cerca i fosfopeptidi da analizzare21. Utilizzare una tolleranza peptidica di prima ricerca di 20 ppm e una tolleranza peptidica di ricerca principale di 4,5 ppm.<ol>
<li>Impostare il numero massimo di modifiche per peptide su 5. Impostare il PSM e il tasso di falsa scoperta proteica (FDR) all'1% e la lunghezza minima del peptide a 7 residui.</li>
		<li>Impostare modifiche variabili come ossidazione a Met, acetilazione proteica N-terminale e fosforilazione a Ser, Thr e Tyr. Analizzare i risultati della ricerca utilizzando i file modificationSpecificPeptides.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare il numero di identificazioni di PTM a livello di proteina, peptide e sito di modifica.</li>
</ol>

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<li>Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+post-translational+modification+crosstalk+with+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129(2021).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

La strategia Ti(IV)-IMAC dual-funzionale è utile per l'analisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi dallo stesso campione in un unico flusso di lavoro di preparazione del campione. I metodi basati su ERLIC hanno anche dimostrato di eseguire l'arricchimento simultaneo dei PTM. Entrambe le strategie sono state utilizzate in precedenza per una copertura profonda nelle analisi PTM14,18. Adattando il metodo dual Ti per ridurre il tempo di incubazione del campio...

Le modificazioni post-traduzionali delle proteine (PTM) svolgono un ruolo importante nella modulazione delle strutture proteiche e di conseguenza delle loro funzioni e dei processi biologici a valle. La diversità del proteoma umano aumenta esponenzialmente a causa della variabilità combinatoria offerta da vari PTM. Diverse varianti di proteine dalle loro sequenze canoniche come previsto dal genoma sono conosciute come proteoforme e molte proteoforme derivano da PTM1. Lo studio della diversità proteoforme nella salute e nella malattia è diventato un'area di ricerca di grande interesse negli ultimi anni 2,3.
Lo studio delle proteoforme e più specificamente dei PTM con grande profondità è diventato più facile attraverso lo sviluppo di metodi di proteomica basati sulla spettrometria di massa (MS). Utilizzando la SM, gli analiti sono ionizzati, frammentati e identificati in base alla m/z dei frammenti. I metodi di arricchimento sono spesso necessari a causa della bassa abbondanza relativa di PTM rispetto alle forme non modificate di proteine. Sebbene l'analisi delle proteine intatte e dei loro PTM, chiamate analisi top-down, siano diventate più di routine, la digestione enzimatica delle proteine e l'analisi dei loro peptidi componenti nelle analisi bottom-up è ancora la via più utilizzata per l'analisi PTM. I due PTM più studiati, e i due PTM più comuni in vivo, sono la glicosilazione e la fosforilazione4. Questi due PTM svolgono un ruolo importante nella segnalazione e nel riconoscimento cellulare e quindi sono importanti modifiche da caratterizzare nella ricerca sulle malattie.
Le proprietà chimiche di vari PTM spesso forniscono percorsi verso l'arricchimento di questi PTM a livello di proteine e peptidi prima dell'analisi. La glicosilazione è un PTM idrofilo dovuto all'abbondanza di gruppi ossidrilici su ciascun monosaccaride. Questa proprietà può essere utilizzata per arricchire i glicopeptidi nella cromatografia di interazione idrofila (HILIC), che può separare più glicopeptidi idrofili dai peptidi idrofobici non modificati5. La fosforilazione aggiunge la porzione di fosfato, che è caricata negativamente tranne che a pH acido. A causa di questa carica, vari cationi metallici, incluso il titanio, possono essere utilizzati per attirare e legare i fosfopeptidi mentre le specie non fosforilate vengono lavate via. Questo è il principio della cromatografia di affinità del metallo immobilizzato (IMAC). Ulteriori discussioni su queste e altre strategie di arricchimento per la glicosilazione e la fosforilazione possono essere trovate in recenti recensioni 6,7.
Quantità relativamente grandi di materiale peptidico di partenza (0,5 mg o più) sono spesso necessarie per i protocolli di arricchimento a causa della bassa stechiometria dei PTM sui peptidi. In scenari in cui questa quantità di campione potrebbe non essere facilmente ottenibile, come la biopsia del nucleo tumorale o le analisi del liquido cerebrospinale, è utile utilizzare flussi di lavoro facili che si traducono nella massima informazione biomolecolare. Recenti strategie sviluppate dal nostro laboratorio e da altri hanno evidenziato l'analisi simultanea e parallela della glicosilazione e della fosforilazione utilizzando lo stesso flusso di lavoro di arricchimento PTM 8,9,10,11,12. Sebbene le proprietà chimiche di questi due PTM possano differire, questi PTM possono essere analizzati in più fasi a causa delle innovative tecniche di separazione e dei materiali utilizzati. Ad esempio, la cromatografia di interazione elettrostatica repulsione-idrofila (ERLIC) sovrappone separazioni basate su interazioni idrofile tra analiti e fase mobile con interazioni carica-carica tra analiti e materiale di fase stazionaria 13,14,15,16. A pH acido, l'attrazione dei peptidi fosforilati nella fase stazionaria può migliorare la loro ritenzione e separazione dai peptidi non modificati. Il materiale costituito da Ti(IV) immobilizzato su microsfere idrofile può essere utilizzato per l'eluizione a base di HILIC e IMAC per separare i fosfopeptidi e i glicopeptidi neutri, acidi e mannosio-6-fosforilati17,18. Questa strategia è nota come Ti(IV)-IMAC a doppia funzionalità. L'utilizzo di queste strategie per arricchire più PTM in un unico flusso di lavoro può rendere più accessibili le analisi delle potenziali interazioni crosstalk PTM. Inoltre, la quantità totale del campione e i requisiti di tempo sono inferiori ai metodi di arricchimento convenzionali se eseguiti in parallelo (ad esempio, HILIC e IMAC su aliquote di campione separate).
Per dimostrare la strategia ti(IV)-IMAC dual-funzionale per l'analisi simultanea della glicosilazione proteica e della fosforilazione, l'abbiamo applicata per analizzare i tessuti pancreatici umani post-mortem. Il pancreas produce sia enzimi digestivi che ormoni regolatori, tra cui insulina e glucagone. La funzione pancreatica è compromessa nella malattia pancreatica. Nel diabete, la regolazione della glicemia è influenzata, portando a livelli più elevati di glucosio nel sangue. Nella pancreatite, l'infiammazione deriva dall'autodigestione dell'organo3. I cambiamenti nei profili PTM, tra cui la glicosilazione e la fosforilazione, possono provocare, come spesso accade, in altre malattie.
Qui, descriviamo un protocollo per un metodo di arricchimento simultaneo basato su spin-tip, basato su una strategia Ti(IV)-IMAC a doppia funzionalità, per N-glicopeptidi e fosfopeptidi derivati da proteine estratte dal tessuto pancreatico. Il protocollo include l'estrazione e la digestione delle proteine, l'arricchimento, la raccolta dei dati MS e l'elaborazione dei dati, come si può vedere nella Figura 1. I dati rappresentativi di questo studio sono disponibili tramite ProteomeXchange Consortium con identificatore PXD033065.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63735/63735fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro per l'analisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani. I tessuti vengono prima crio-polverizzati in una polvere fine prima dell'estrazione delle proteine utilizzando il detergente sodio dodecil solfato (SDS). Le proteine vengono quindi sottoposte a digestione enzimatica. I peptidi risultanti vengono aliquotati prima dell'arricchimento utilizzando Ti(IV)-IMAC dual-funzionale. I dati grezzi vengono raccolti utilizzando la cromatografia liquida a fase inversa su scala nanometrica-spettrometria di massa (nRPLC-MS) e vengono analizzati utilizzando un software di ricerca di database. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63735/63735fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo protocollo ha lo scopo di rendere le analisi PTM più accessibili e di consentire un'analisi più diffusa di più PTM nello stesso flusso di lavoro. Questo protocollo può essere applicato ad altre matrici biologiche complesse, tra cui cellule e biofluidi.

<table><tbody><tr><td>Acido acetico, glaciale (ACS certificato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetone (ACS certificato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio (cristallino/certificato ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio (certificato ACS Plus)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669-212</td><td></td></tr><tr><td>Software Byonic</td><td>Protein Metrics</td><td>n/a</td><td>Software commerciale utilizzato per l'analisi glicoproteomica (https://proteinmetrics.com/byos/)</td></tr><tr><td>C18 Materiale BEH</td><td>Acque</td><td>186002353</td><td>Materiale rimosso dalla colonna e utilizzato per impacchettare nano capillari (tirato per integrare la punta utilizzata direttamente in linea con l'ingresso dello strumento)</td></tr><tr><td>CAE-Ti-IMAC, 100%</td><td>J& K Scientific</td><td>2749380-1G</td><td>Materiale utilizzato per il Ti(IV)-IMAC a doppia funzione; può essere utilizzato anche per l'arricchimento convenzionale di IMAC/fosfopeptide</td></tr><tr><td>convenzionale Kit Cellcrusher Cellcrusher</td><td></td><td>n/a</td><td>Utilizzato per macinare campioni di tessuto in polvere prima dell'estrazione</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R Microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-205</td><td>Per centrifugazione</td></tr> <tr><td>a temperatura controllataCompresse da cocktail con inibitore della proteasi</td><td>Sigma</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>DTT, grado molecolare (DL-ditiotreitolo)</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td>Agente riducente delle proteine</td></tr><tr><td>Etanolo, 200 proof (100%), USP</td><td>Fisher</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Miscelatore a vortice analogico</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione (2 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Modello 120 Dismembratore sonico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Per la lisi dei campioni utilizzando</td></tr><tr><td>l'acido formico ad ultrasuoni, 99,0+%, Optima LC/MS Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in silice fusa (75 &mu; m diametro interno, 360 &mu; Polymicro</td> <td>Technologies LLC</td><td>100 m TSP075375</td><td>Per colonne tirate e impaccate interne con emettitore integrato</td></tr><tr><td>Acido fluoridrico (48 % in peso in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339261-100ML</td><td>Utilizzato per l'apertura dell'emettitore della colonna capillare tirata</td></tr><tr><td>Iodoacetammide, BioUltra</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td>Reagente riducente delle proteine</td></tr><tr>Software<td>MaxQuant</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Software gratuito utilizzato per l'analisi fosfoproteomica (https://www.maxquant.org/)</td></tr><tr><td>Agitatore multi-termico con riscaldamento e raffreddamento</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td>Blocco riscaldante</td></tr><tr><td>Oasis HLB 1 cc Vac Cartuccia, 10 mg di assorbente per cartuccia, 30 &; m, 100/pk</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td>Desalinizzazione di cartucce su larga scala per digestati triptici (capacità di carico fino a circa 1 mg ciascuna)</td></tr><tr><td>Puntali per pipette OMIX C18, 100 &; Punta a L, 10 - 100 &mu; Volume di eluizione L, 1 x 96 puntali</td><td>Agilent</td><td>A57003100</td><td>Puntale per pipette confezionate su scala ridotta per la desalinizzazione per eluizioni di arricchimento</td></tr><tr><td>P-2000 Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000/F</td><td>Per l'estrazione di colonne nano-capillari per compresse di inibitori della</td></tr><tr><td>fosfatasi</td> LC-MS <td>PhosSTOP Sigma</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>PolySAX LP (12 &mu; m, dimensione dei pori 300 &Aring;)</td><td>PolyLC</td><td>BMSX1203</td><td>Materiale per cromatografia a scambio anionico forte utilizzato per l'arricchimento di glicopeptidi ERLIC/convenzionali</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico (cristallino/certificato ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Cella di iniezione a pressione con piastra di agitazione magnetica integrata</td><td>Next Advance</td><td>PC77-MAG</td><td>Per l'imballaggio di colonne nano-capillari con fase stazionaria fino al limite</td></tr> <tr><td>di 2500 psiSoftware Proteome Discoverer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Software commerciale per l'analisi proteomica (con database integrato, ricerca di nodi) e la visualizzazione dei dati (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)</td></tr><tr><td>Concentratore sottovuoto SpeedVac SC110 Modello SC110-120</td><td>Savant</td><td>n/a</td><td>Concentratore centrifugo sottovuoto per l'essiccazione di campioni (sotto calore)</td></tr><tr><td>Soluzione SDS, Soluzione di dodecil solfato di sodio al 10%, Biologia molecolare/Elettroforesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2436200</td><td></td></tr><tr><td>Grado di sequenziamento Tripsina modificata</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (cristallino/certificato ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>TopTip, Vuoto, 10-200 & micro; L, Confezione da 96</td><td>Glygen Corporation</td><td>TT2EMT.96</td><td>Puntale per pipetta vuoto con foro di dimensioni micron utilizzato che può essere utilizzato per confezionare materiali cromatografici per arricchimenti, in bundle con adattatori per provette Tampone</td></tr><tr><td>bicarbonato di trietilammonio (TEAB, 1 M, pH 8,5 (volatile))</td>Acido trifluoroacetico <td>Sigma</td><td>90360-100ML</td><td></td></tr>, <tr><td>grado di reagente, 99%</td><td>Fisher Scientific</td><td>60-017-61</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (cristalli bianchi o polvere cristallina/biologia molecolare)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/Lys-C Mix, grado di massa</td><td>Promega</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>urea (certificato ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-500</td><td></td></tr><tr><td>acqua, Optima LC/MS grado</td><td>Fisher Scientific</td><td>W64</td><td></td></tr></tbody></table>

una strategia di arricchimento spin-tip per l'analisi simultanea di n-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani

A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues

La spettrometria di massa può fornire una copertura approfondita delle modifiche post-traduzionali (PTM), sebbene l'arricchimento di queste modifiche da matrici biologiche complesse sia spesso necessario a causa della loro bassa stechiometria rispetto agli analiti non modificati. La maggior parte dei flussi di lavoro di arricchimento dei PTM sui peptidi nei flussi di lavoro di proteomica bottom-up, in cui le proteine vengono digerite enzimaticamente prima che i peptidi risultanti vengano analizzati, arricchiscono solo un tipo di modifica. È l'intero complemento di PTM, tuttavia, che porta a funzioni biologiche, e l'arricchimento di un singolo tipo di PTM può perdere tale diafonia di PTM. PTM crosstalk è stato osservato tra glicosilazione proteica e fosforilazione, i due PTM più comuni nelle proteine umane e anche i due PTM più studiati utilizzando flussi di lavoro di spettrometria di massa. Utilizzando la strategia di arricchimento simultaneo qui descritta, entrambi i PTM sono arricchiti da tessuto pancreatico umano post-mortem, una matrice biologica complessa. La cromatografia a simmetria metallica immobilizzata Ti(IV) a doppia funzionalità viene utilizzata per separare contemporaneamente varie forme di glicosilazione e fosforilazione in frazioni multiple in un comodo metodo basato sulla punta di spin, consentendo analisi a valle delle potenziali interazioni crosstalk PTM. Questo flusso di lavoro di arricchimento per glico- e fosfopeptidi può essere applicato a vari tipi di campioni per ottenere una profilazione profonda di più PTM e identificare potenziali molecole bersaglio per studi futuri.

I dati rappresentativi della spettrometria di massa, inclusi i file raw e i risultati della ricerca, sono stati depositati presso il Consorzio ProteomeXchange tramite il repository partner PRIDE con l'identificatore del set di dati PXD03306522.
In questo lavoro, sono state analizzate le repliche di iniezione duplicate per ogni eluizione di arricchimento. Le identificazioni effettuate da entrambe le repliche tecniche sono state raccolte in ultima analisi. A caus...

Le modifiche post-traduzionali (PTM) modificano le strutture e le funzioni delle proteine. I metodi per l'arricchimento simultaneo di più tipi di PTM possono massimizzare la copertura nelle analisi. Presentiamo un protocollo che utilizza cromatografia di affinità metallica immobilizzata Ti(IV) a doppia funzionalità seguita da spettrometria di massa per l'arricchimento e l'analisi simultanei della proteina N-glicosilazione e fosforilazione nei tessuti pancreatici.

Una strategia di arricchimento spin-tip per l'analisi simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi da tessuti pancreatici umani

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological ...

La strategia di cromatografia a doppia funzionalità dell'affinità del metallo immobilizzato in titanio può arricchire sia N-glicopeptidi che fosfopeptidi nello stesso flusso di lavoro, aumentando le informazioni biomolecolari dalla stessa analisi. Il vantaggio principale di questo arricchimento sono due meccanismi di separazione, che consentono la separazione simultanea di N-glicopeptidi e fosfopeptidi in frazioni separate per l'analisi della spettrometria di massa a valle. L'utilizzo di questo metodo di arricchimento può migliorare il rilevamento della glicosilazione e della fosforilazione in campioni biologici complessi come i tessuti pancreatici verso la scoperta di biomarcatori di malattia come nel diabete e nel cancro.Poiché questo metodo si basa su punte di centrifugazione e centrifugazione, è importante controllare la velocità di centrifugazione e assicurarsi che i campioni siano privi di particolato per evitare qualsiasi intasamento. Per iniziare, pre-raffreddare le parti del polverizzatore tissutale che verranno a contatto con i tessuti pancreatici, vale a dire la camera, il polverizzatore e il cucchiaio di recupero, insieme a eventuali spatole, in un contenitore di polistirolo. Quindi, trasferire i pezzi di tessuto nel supporto del campione pre-refrigerato e aggiungere un azoto liquido al tessuto fino a quando non sono congelati.Dopo aver posizionato il polverizzatore nella camera, colpirlo usando un martello da cinque a dieci volte per schiacciare il campione, quindi rimuovere il polverizzatore dalla camera e raschiare via la polvere di tessuto aderente e pezzi. Quindi, aggiungere un cucchiaio di azoto liquido alla camera se i tessuti iniziano a sciogliersi e ripetere il processo di polverizzazione fino a ottenere una polvere fine e porzionare i campioni in aliquote di circa 100 milligrammi in tubi pre-refrigerati. Dopo aver preparato il tampone di lisi, sciogliere una compressa ciascuna di proteasi e inibitore della fosfatasi in 500 microlitri di acqua, per una scorta di 20 volte la concentrazione finale desiderata, e aggiungere il volume richiesto di stock di ciascun inibitore al tampone di lisi per raggiungere le concentrazioni finali dell'inibitore.Dopo aver aggiunto 600 microlitri di tampone di lisi al tubo, incubare a 95 gradi Celsius nel blocco riscaldante per 10 minuti con agitazione a 800 RPM, quindi rimuovere i campioni dal blocco riscaldante e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Successivamente, sonicare i campioni a 60 Watt di energia per 45 secondi, utilizzando impulsi di 15 secondi con un riposo di 30 secondi nel mezzo, e pellet i campioni a 3000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere il surnatante a cinque volte il suo volume di solvente per precipitazione.Ad esempio, 300 microlitri di tampone di lisi a 1,5 millilitri di solvente per precipitazione contenente il 50% di acetone, il 49,9% di etanolo e lo 0,1% di acido acetico, quindi raffreddare durante la notte a 80 gradi Celsius. Pellet i campioni di nuovo a 3000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, e rimuovere il surnatante, quindi lavare il pellet rompendo con una spatola e mescolare con la stessa quantità di solvente per precipitazione. Dopo la centrifugazione, asciugare all'aria il pellet campione in una cappa aspirante per 15 minuti e conservare a 80 gradi Celsius fino al momento di procedere.In primo luogo, sospendere nuovamente il pellet proteico in 300 microlitri di tampone di digestione appena prodotto contenente 50 millimolari tampone trietilammonio bicarbonato e otto urea molare. Alla proteina in soluzione, aggiungere il ditiotreitolo a una concentrazione finale di cinque millimolari, mescolare e ridurre a temperatura ambiente per un'ora, quindi aggiungere iodoacetamide a una concentrazione finale a 15 millimolare. Mescolare e alchilare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.Quindi, aggiungere Lys-C / Tripsina a 1 a 100 rapporto enzima-proteina e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore per quattro ore, quindi aggiungere 50 millimolmonio bicarbonato tampone per diluire l'urea otto molare utilizzata a meno di un molare. Dopo aver aggiunto tripsina a 1 a 100 rapporto enzima-proteina, incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore durante la notte, successivamente spegnere la digestione con l'aggiunta di acido trifluoroacetico. Per ogni milligrammo di proteina di partenza, caricare una cartuccia di desalinizzazione con un millilitro di acetonitrile e tre volte con un millilitro di acido trifluoroacetico allo 0,1%, quindi caricare la miscela digerita sulla cartuccia di dissalazione e lavare la miscela tre volte usando un millilitro di acido trifluoroacetico allo 0,1%.Successivamente, eluire i peptidi usando un millilitro di soluzione di acetonitrile al 60% e acido formico allo 0,1%, quindi asciugare i peptidi eluiti a circa 35 gradi Celsius usando un concentratore di vuoto centrifugo fino a quando il solvente non è completamente evaporato. Dopo aver risospendeto i peptidi in acqua, stimare le concentrazioni di peptidi utilizzando un test peptidico secondo il protocollo del produttore, quindi porzionare i peptidi in aliquote da 500 microgrammi e asciugare completamente. Pesare circa tre milligrammi di cotone idrofilo e imballarlo in una punta di centrifuga vuota.Dopo aver trasferito un grammo di materiale per cromatografia di affinità metallica immobilizzata in titanio in un tubo, aggiungere lo 0,1% di acido trifluoroacetico a una concentrazione nota di materiale. Dopo aver aggiunto abbastanza liquame a una punta di centrifuga per trasferire 20 milligrammi di materiale, lavare la punta di centrifugazione centrifugando con 200 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1%. Sospendere nuovamente i campioni in 200 microlitri di solvente di carico/lavaggio e scorrere attraverso la punta di centrifuga.Dopo aver lavato la punta di centrifugazione mediante centrifugazione con solvente di carico/lavaggio, lavare la punta di centrifuga con 200 microlitri di soluzione di acido formico all'80% di acetonitrile 0,1, quindi eluire i peptidi con 200 microlitri di E1 ed E2 e analizzare ogni eluizione separatamente. Ripetere il processo di eluizione utilizzando solventi E3 ed E4 e combinare le frazioni di eluizione appropriate prima dell'analisi a valle. Prima di eseguire le eluizioni a pH di base, condizionare il materiale tre volte utilizzando 200 microlitri di acetonitrile al 90% in idrossido di ammonio al 2,5%, quindi eluire i peptidi con 200 microlitri di solventi E5 ed E6 e analizzare queste eluizioni separatamente dopo la dissalazione utilizzando una punta imballata.Quindi, eluire i peptidi con 200 microlitri di diverse concentrazioni di acetonitrile e idrossido di ammonio. Successivamente, combinare queste eluizioni e analizzare come un unico campione, E7, dopo la dissalazione con una punta imballata. Spettri MS/MS annotati ad alta confidenza da peptidi N-glicosilati e fosforilati sono stati ottenuti con una ricca frammentazione dei precursori, aumentando la fiducia nell'identificazione, come assegnato dal software di ricerca del database.Le identificazioni peptidiche sono state trovate da campioni arricchiti utilizzando il metodo a doppia funzionalità della cromatografia a cromatografia a simmetria metallica immobilizzata in titanio su ciascuna frazione di eluizione. La maggior parte dei glicopeptidi eluisce nelle prime quattro frazioni, mentre la maggior parte dei fosfopeptidi eluisce nelle ultime tre frazioni, diminuendo le potenziali interferenze nella ionizzazione. I risultati della glicoproteomica del metodo dual titanium sono stati confrontati con un arricchimento solo glicopeptide di Ehrlich, dimostrando che le proporzioni di ciascun tipo di glicano dopo il binning in sei categorie in base alla loro composizione, sono simili tra entrambi i metodi.I risultati della fosfoproteomica del metodo dual titanium sono stati confrontati con un convenzionale arricchimento con cromatografia a cromatografia con affinità metallica immobilizzata solo con fosfopeptidi o utilizzando entrambi i metodi. La maggior parte degli amminoacidi fosforilati sono stati identificati come serina e treonina, con circa l'1% di tirosina fosforilata. Costruire correttamente la punta di rotazione è importante per garantire un'eluizione regolare.Inserire saldamente il cotone nella punta, in modo che il materiale di arricchimento possa essere imballato sopra il cotone. Abbiamo utilizzato il metodo IMAC in titanio a doppio funzionalità per la caratterizzazione simultanea della glicosilazione e della fosforilazione nella maggior parte dei tessuti e della proteina spike SARS-CoV-2.

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