Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

L'obiettivo generale di questo esperimento di saggio di legatura di prossimità è quello di visualizzare e quantificare la formazione di complessi proteici di risposta al danno al DNA e di riparazione in seguito all'induzione di danni al DNA in colture cellulari in sospensione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella riparazione dei danni al DNA, come l'organizzazione e la regolazione spazio-temporale e il modo in cui i diversi percorsi di riparazione rispondono a diversi tipi di danno al DNA. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è relativamente semplice, richiede un basso numero di cellule e non richiede un'elaborazione estesa, che può interrompere o alterare le interazioni proteina-proteina.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla riparazione del DNA, sulla formazione di complessi proteici in cellule in sospensione di coltura, può anche essere applicato in cellule aderenti in coltura, tessuti congelati o inclusi in paraffina e persino animali interi. La linea cellulare linfoblastica acuta a cellule b umana BCR abile-positiva, BV-173, viene utilizzata in questo studio e coltivata in IMDM con integratori a 37 gradi Celsius in un'atmosfera del 5% di CO2. Piastra le cellule a due volte da 10 al sesto per millilitro in una piastra a sei pozzetti a cinque millilitri per pozzetto.

Per arrestare le cellule nella fase G1 del ciclo cellulare, aggiungere cinque micromolari di metansolfonato di ammonio a ciascun pozzetto e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera del 5% di CO2. Il giorno seguente, aggiungere cinque micromolari di un inibitore ATM a ciascuno dei due pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatore per 30 minuti. Successivamente, indurre il danno al DNA aggiungendo 50 nanogrammi per millilitro di NCS a uno dei pozzetti che è stato pretrattato con l'inibitore ATM e a un altro pozzetto che non è stato pretrattato.

Incubare per due ore. Preparare 1XPBS più il 10% di BSA sovrapponendo cinque grammi di frazione-5 BSA sopra 50 millilitri di 1XPBS in un becher e lasciarlo riposare a temperatura ambiente senza agitare o mescolare fino a quando il BSA non si sarà sciolto. Filtrare lentamente la soluzione PBS plus 10%BSA attraverso un filtro da 0,22 micrometri e tenere in ghiaccio.

Raccogliere le cellule trasferendo il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da 15 millilitri. Lavare le celle due volte con 1XBPS ghiacciato. Dopo aver contato le cellule, risospendere due volte da 10 a una sesta cellula per millilitro in 1XBPS più 10% BSA.

Mantieni le celle sul ghiaccio. Preparare i vetrini per microscopia per questa procedura lucidandoli accuratamente con un panno privo di lanugine e sgrassandoli mettendo un etanolo al 96% in un barattolo Coplin per cinque minuti. Lasciare asciugare i vetrini all'aria per 10 minuti.

Assemblare i vetrini per microscopia negli imbuti citologici cytospin con un'area di sei millilitri. Prerivestire i vetrini pipettando 50 microlitri di 1XPBS più il 10% di BSA in ciascun imbuto e centrifugare per un minuto a 500 giri/min. Ad ogni imbuto, aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare e centrifugare a 500 giri/min per cinque minuti.

Smontare con cura gli imbuti e fare attenzione a non toccare le macchie sulle diapositive. Usa un bloccante liquido per penna Pap con una punta di cinque millimetri per disegnare un cerchio attorno a ogni punto. Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione di fissazione PFA al 4% in ogni punto.

E incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavare le cellule con 1XPBS in un barattolo Coplin a temperatura ambiente con una leggera agitazione. Lavare tre volte in questo modo per cinque minuti ogni volta.

Asciugare i vetrini attorno alle macchie con un fazzoletto privo di lanugine e rimuovere quanto più liquido possibile dalle macchie inclinando il vetrino e asciugando con un fazzoletto privo di lanugine. Aggiungere 50 microlitri di Triton X allo 0,25% in 1XPBS in ogni punto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitare. Lavare i vetrini in 50-60 millilitri di TBS-T in un barattolo Coplin a temperatura ambiente agitando delicatamente.

Tre volte per cinque minuti ogni volta. Prima del blocco, picchiettare TBS-T e asciugare i vetrini intorno ai punti con un fazzoletto privo di lanugine. Rimuovi quanto più liquido possibile dal punto.

Agitare brevemente la soluzione bloccante e poi aggiungere una goccia di circa 40 microlitri in ogni punto. Collocare i vetrini in una camera umidificata preriscaldata e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Prepara i cocktail di anticorpi.

Vorticare e quindi pipettare il diluente per anticorpi commerciali in ciascuna provetta per microfuge. Aggiungere l'anticorpo anti-ATM di capra a 1:1000. E l'anticorpo anti-fosfosserina-15 p53 del coniglio a 1:100.

Per gli esperimenti di controllo di singoli anticorpi, preparare diluizioni anticorpali contenenti solo l'anticorpo anti-ATM di capra e solo l'anticorpo anti-fosfosserina-15 p53 di coniglio. Al termine dell'incubazione di un'ora, picchiettare la soluzione bloccante, ma fare attenzione a non lasciare che le cellule si secchino. Aggiungere 30 microlitri di ciascuna diluizione del cocktail di anticorpi e incubare in una camera umidificata a quattro gradi Celsius per una notte.

Il giorno successivo, lavare i vetrini con 1X NC2 tampone di lavaggio A in un barattolo Coplin a temperatura ambiente agitando delicatamente due volte per cinque minuti ogni volta. Dopo che i vetrini sono stati lavati due volte con il tampone di lavaggio, A picchiettare il tampone di lavaggio dai vetrini e aggiungere 30 microlitri della miscela della sonda per il saggio di legatura di prossimità in ciascun punto. Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per un'ora.

Lavare i vetrini con 50-60 millilitri di tampone di lavaggio A in un barattolo Coplin a temperatura ambiente agitando delicatamente. Successivamente, preparare la soluzione di ligasi di legatura su ghiaccio aggiungendo un microlitro di ligasi a 39 microlitri di soluzione di legatura per ogni punto. Aggiungere 40 microlitri della soluzione di ligasi di legatura in ogni punto.

Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per 30 minuti. Lavare i vetrini con il tampone di lavaggio A in un barattolo Coplin a temperatura ambiente agitando delicatamente. Preparare la miscela di polimerasi di amplificazione con ghiaccio.

Per prima cosa diluire la soluzione madre di amplificazione da uno a cinque in acqua. E aggiungi 0,5 microlitri di polimerasi a 39,5 microlitri di soluzione di amplificazione 1X per ogni spot. Picchiettare il tampone di lavaggio e aggiungere 40 microlitri di miscela di polimerasi di amplificazione per punto.

Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per 100 minuti. Al termine dell'incubazione di 100 minuti, picchiettare la miscela di polimerasi di amplificazione e lavare i vetrini con 1X NC2 tampone di lavaggio B in un barattolo di Coplin. A temperatura ambiente con leggera agitazione due volte per 10 minuti ciascuna.

Successivamente, lavare i vetrini nel tampone di lavaggio 0,01x B per un minuto. Picchiettare il tampone di lavaggio B in eccesso e asciugare i vetrini intorno ai punti con un fazzoletto privo di lanugine. Rimuovi quanto più liquido possibile dal punto.

Preparare DAPI contenente un mezzo di montaggio che non sovrasfiori i nuclei diluendo DAPI contenente il mezzo di montaggio 1:5 in un mezzo di montaggio senza DAPI. Aggiungere da 25 a 30 microlitri di DAPI diluito contenente il mezzo di montaggio a un vetrino coprioggetti da 24 millimetri per 24 millimetri. Raccogliere il vetrino coprioggetti con il vetrino e applicare una leggera pressione per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria intrappolate.

Sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie e attendere almeno 15 minuti prima dell'imaging. Infine, visualizzare e analizzare i vetrini utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. Il saggio di legatura di prossimità è stato utilizzato per studiare l'interazione tra ATM e fosfoserina 15 p53 in BV 173 cellule umane BCR-able positive arrestate nella fase G1.

A differenza delle cellule che non sono state trattate con NCS per indurre danni al DNA, la maggior parte delle cellule trattate con NCS aveva segnali puntati esclusivamente nel nucleo con una media di sette segnali per cellula. Ciò indica che l'induzione del danno al DNA provoca l'interazione tra ATM e fosfoserina 15 p53. Il pre-trattamento delle cellule con uno specifico inibitore della ATM chinasi prima dell'induzione del danno al DNA riduce il numero di segnali a una media di due segnali per cellula, confermando che la fosforilazione di p53 al residuo di serina 15 dipendeva dall'attività della ATM chinasi.

Gli esperimenti di controllo con un singolo anticorpo in cui è stato emesso l'anticorpo anti ATM o l'anticorpo anti fosfoserina 15 p53 non hanno prodotto alcun segnale come previsto. Questa figura presenta la quantificazione e l'analisi statistica dei risultati che dimostrano e confermano la specificità della tecnica del saggio di legatura di prossimità su preparazioni di cytospin di colture cellulari in sospensione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore dopo un'incubazione notturna con un anticorpo primario se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di titolare attentamente l'anticorpo mediante colorazione in immunofluorescenza delle cellule di interesse prima di eseguire il saggio di legatura di prossimità. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in biologia cellulare per esplorare le interazioni proteiche transitorie che sono difficili da valutare utilizzando metodi standard come le immunoprecipitazioni e l'imaging basato su FRET che spesso si traduce in artefatti tecnici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il saggio di legatura di prossimità su colture cellulari in sospensione per visualizzare e quantificare l'interazione proteina-proteina in situ.