Name: Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Scopri come rilevare e visualizzare complessi proteici indotti da danni al DNA nelle cellule in sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità (PLA). Questo metodo permette di quantificare le interazioni tra proteine di riparazione.

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La ricerca nel laboratorio di Guikema è finanziata dal programma Innovative Research Incentives dell&#39;Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (convalida VIDI 016126355) e dal progetto &quot;Stichting Kinderen Kankervrij &#39;KiKA (progetto 252).

1. Trattamento delle cellule e dell&#39;induzione del danno del DNA <ol><li> Coltivare la linfoblastica acuta linfoblastica BV173 o SUP-B15 umana in IMDM integrata con 20% FCS, 50 μM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina a 37 ° C in atmosfera di 5% CO 2 . Contare le cellule e la piastra a 2 x 10 6 cellule / mL in piatti a 6 pozzetti, a 5 mL / pozzetto. NOTA: Opzionalmente, le linee cellulari di sospensione di diversa origine possono essere utilizzate. </li><li> Per arrestare le cellule BCR-ABL + B-ALL nella fase G1 del ciclo cellulare, aggiungere 5 μM di metanesolfonato imatinib (STI571) e incubare per una notte. <ol><li> Facoltativamente, ignorate questo passaggio quando si studiano le interazioni proteico-proteiche durante tutto il ciclo cellulare o nei tipi di cellule negativi BCR-ABL. </li></ol></li><li> Indurre il danno del DNA aggiungendo alla cultura 50 ng / ml di neocarzinostatina (NCS) e incubare per 2 ore. <ol><li> In alternativa,Indurre il danno del DNA irraggiando le cellule utilizzando una sorgente radioattiva [ 137 Cs] a 0,5 Gy / min, ad una dose di 5 Gy. Dopo irradiazione, lasciare la cella recuperare per 2 ore a 37 ° C in atmosfera di 5% CO 2 . </li></ol></li><li> Facoltativamente, per valutare il coinvolgimento dell&#39;attività di ATM-chinasi in risposta al danneggiamento del DNA, aggiungere 5 μM di inibitore ATM kinasi KU55933 prima dell&#39;aggiunta di NCS o del trattamento di irradiazione. </li><li> Preparare 1x PBS + 10% BSA stratificando 5 g di frazione-V BSA sopra 50 ml di 1x PBS in un bicchiere o Erlenmeyer e lasciar sedere a RT finché BSA non si scioglie. Non scuotere né agitare perché questo provocherà una schiuma estensiva. Lentamente filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm e tenerlo su ghiaccio. </li><li> Celle di raccolta e lavare due volte con 1x PBS a ghiaccio freddo. Contare le cellule e risospendere a 2 x 10 6 / mL in 1x PBS + 10% BSA. Mantenere le cellule sul ghiaccio. </li></ol> 2. Cytocentrifugazione, fissazione e permeabilizzazione <ol><li> Preparare laSoluzione 4% di paraformaldeide in 1x PBS fresco. Aggiungere 2 g di PFA a 50 ml di 1x PBS e incubare in un bagno d&#39;acqua agitante a 55 ° C fino a quando la soluzione è chiara. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm e conservare a RT fino all&#39;uso. NOTA: Facoltativamente, il fissatore di PFA al 4% può essere conservato congelato a -20 ° C. Dopo il congelamento, scongelare solo una volta per l&#39;uso. Altrimenti, la soluzione al 4% di PFA in PBS può essere acquistata direttamente. </li><li> Lucidare accuratamente le esposizioni a microscopia da 76 mm x 26 mm con tessuto privo di lanugine e sgrassarle collocandolo nel 96% di etanolo in un vaso Coplin per 5 min. Lasciare che la microscopia scivoli in aria per 10 minuti. </li><li> Assemblare le diapositive di microscopia nelle celle di citospina / citologia con una superficie di 6 mm. Le pastiglie di pre-strato pipettano 50 μl di 1x PBS + 10% BSA in ogni imbuto e centrifugano per 1 min a 500 giri / min. </li><li> Aggiungere 100 μL della sospensione cellulare (pari a 0,2 x 106 cellule) ad ogni imbuto e centrifugare per 5 minuti a 500 giri / min. Per ogni combinazione di anticorpi, alleSono necessari preparati 4 (esperimento a doppio anticorpo, due controlli monocomponenti, nessun controllo degli anticorpi). </li><li> Smontare con cura gli imbuti e assicurarsi di non toccare le macchie. Procedere immediatamente alla fissazione del campione. <ol><li> Facoltativamente, lasciare che le diapositive siano asciugate all&#39;aria per almeno 30 minuti. Dopo essiccazione ad aria, avvolgere le diapositive individualmente in fogli di alluminio e conservare a -20 ° C fino all&#39;uso. Quando si utilizzano preparati congelati, assicurarsi di scongelare le diapositive avvolte in un tovagliolo di carta per evitare una condensa estesa sulle diapositive. </li></ol></li><li> Disegnare un cerchio (diametro approssimativo 15-20 mm) attorno al punto usando un bloccante liquido a penna PAP (punta da 5 mm). </li><li> Aggiungere 50 μl di soluzione di fissazione del 4% di PFA ad ogni punto e incubare per 30 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule 3 volte per 5 min con 1x PBS in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera. </li><li> Asciugare le diapositive intorno ai punti con un tessuto privo di lanugine e rimuovere il più liquido dal punto più possibile utilizzando un piAnimale domestico senza toccare il punto, o inclinando la diapositiva. Aggiungere 50 μl di 0,25% Triton-X in 1x PBS a ciascun punto e incubare per 10 minuti a RT senza agitazione. </li><li> Lavare le diapositive 3 volte per 5 min in ~ 50-60 mL di 0,05% di Tween-20 in TBS (TBS-T) in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera. 10 diapositive possono essere elaborate simultaneamente in questo modo. </li></ol> 3. Blocco e incubazione primaria dell&#39;anticorpo <ol><li> Toccare TBS-T e asciugare le diapositive attorno ai punti con un tessuto privo di lanugine. Rimuovere il più liquido dal punto possibile utilizzando un pipetta senza toccare il punto, o inclinando la slitta. Poco vorticate la soluzione di blocco e aggiungete una goccia (~ 40 μL) ad ogni punto. Incubare per 1 ora a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata. </li><li> Preparare il cocktail anticorpale mescolando il capra anti-ATM a 1: 1,000 e il coniglio anti-fosforo-Ser15-p53 a 1: 100 in diluente anticorpale commerciale, diluente anticorpo vortex prima dell&#39;uso. Per esperimento di controlloTs, preparare le diluizioni degli anticorpi contenenti solo il capra-anti-ATM e solo l&#39;anticorpo coniglio-anti-fosforo-Ser15-p53 (controlli monocomponenti). </li><li> Toccare la soluzione di blocco, ma fate attenzione a non lasciare le cellule asciutte prima di aggiungere le diluizioni degli anticorpi. Aggiungere 30 μL di ciascuna diluizione del cocktail anticorpale e incubare in una camera umidificata per una notte a 4 ° C. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio in situ e il tampone di lavaggio B dissolvendo il contenuto di un sacchetto di miscela di Buffer A e Buffer B in un volume finale di 1.000 mL di acqua ciascuno. <ol><li> In alternativa, preparare il tampone di lavaggio A dissolvendo 8,8 g di NaCl, 1,2 g di Tris-base e 0,5 ml di Tween-20 in 800 ml di acqua. Regolare il pH a 7,4 utilizzando HCl e aggiungere ad un volume finale di 1000 mL. </li><li> In alternativa, preparare il bucato di lavaggio B sciogliendo 5,84 g di NaCl, 4,24 di Tris-base e 26,0 g di Tris-HCl in 500 ml di acqua. Regolare il pH a 7,5 con HCl. Aggiungere acqua a un volume finale di 1.000 mL. </li><li> FiltroEntrambe le soluzioni attraverso un filtro da 0,22 μm. </li></ol></li><li> Lavare le diapositive 2 volte per 5 min con 1 tampone di lavaggio in situ in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera. </li></ol> 4. Prove PLA, Ligation e Amplification <ol><li> Preparare sonde PLA diluendo il MINUS anti-capra PLUS e anti-coniglio MINUS entrambi 1: 5 nel diluente anticorpale commerciale. Toccare il tampone di lavaggio 1x in situ dai diapositive e aggiungere 30 μL della miscela di sonde PLA ad ogni punto. Incubare 1 h a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata. NOTA: Qualsiasi combinazione di anticorpi secondari PLUS e MINUS PLA possono essere utilizzati (anti-mouse, anti-coniglio, anti-capra) a condizione che gli anticorpi primari applicati siano sollevati in diverse specie e la combinazione delle sonde PLA Contengono una sonda PLUS e una sonda MINUS. </li><li> Lavare le diapositive 2 volte per 5 min con ~ 50-60 mL di tampone di lavaggio in situ 1 in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera./ Li&gt; <li> Preparare la soluzione Ligation-Ligase su ghiaccio aggiungendo 1 μL di Ligase a 39 μL di soluzione di legame e aggiungere 40 μL di soluzione di Ligation-Ligase a ciascun punto. Incubare 30 minuti a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata. </li><li> Lavare le diapositive 2 volte per 5 min con ~ 50-60 mL di tampone di lavaggio in situ 1 in un vaso di Coplin a RT con agitazione leggera. </li><li> Preparare la miscela Amplification-Polymerase sul ghiaccio diluendo la soluzione di magazzino Amplification 1: 5 in acqua. Quindi aggiungere 0,5 μl di polimerasi a 39,5 μL di soluzione di amplificazione 1x per ogni punto. NOTA: I reagenti di amplificazione sono sensibili alla luce e devono essere protetti contro l&#39;esposizione diretta alla luce. Il reagente di amplificazione è disponibile in quattro diversi colori (ROSSO: eccitazione 594 nm, emissione 624 nm, FarRED: eccitazione 644 nm, emissione 669 nm, ORANGE: eccitazione 554 nm, emissione 576 nm, VERDE: eccitazione 501 nm, emissione 523 nm) Assicurarsi che la configurazione microscopia disponibile sia sLe proprietà di eccitazione e filtri per immagini di questi colori. </li><li> Toccare il tampone di lavaggio 1x in situ e aggiungere 40 μL di miscela di amplificazione-polimerasi per punto. Incubare per 100 min a 37 ° C in una camera umidificata pre-riscaldata. </li></ol> 5. Montaggio e Imaging <ol><li> Preparare il bucato B di lavaggio in situ 0,01x, aggiungendo 1 ml di 1x Tampone di lavaggio B a 99 ml di acqua. </li><li> Toccare la miscela Amplification-Polymerase e lavare le diapositive 2 volte per 10 min con 1 tampone di lavaggio in situ B in un vaso Coplin a RT con agitazione leggera. </li><li> Lavare le diapositive 1 min in tampone di lavaggio 0,01x. </li><li> Toccare l&#39;eccesso di lavaggio B di 0.01x e asciugare le diapositive attorno ai punti con un tessuto privo di lanugine. Rimuovere il più liquido dal punto possibile utilizzando un pipetta senza toccare il punto, o inclinando la slitta. </li><li> Diluire il supporto di montaggio contenente DAPI 1: 5 in mezzo di montaggio senza DAPI per evitare la sovraesposizione dei nuclei. </li><li> Aggiungere 25-30 μL di supporto 1: 5 di supporto contenente DAPI a una copertura di 24 mm x 24 mm e raccogliere il coperchio con il vetrino, applicare una leggera pressione per assicurare che non ci siano bolle d&#39;aria intrappolate. Sigillare la copertura con unghie e attendere almeno 15 minuti prima dell&#39;immagine. </li><li> Analizzare le diapositive utilizzando un microscopio a fluorescenza (confocale). <ol><li> Conta il numero di segnali PLA punta per cellula in almeno 4 campi immagine acquisiti (obiettivo 20x, contando almeno 20 celle per condizione o combinazione di anticorpi, basata su un calcolo di potenza utilizzando una media prevista di 7 ± 5 segnali nelle cellule trattate, E 2 ± 2 segnali nelle cellule non trattate, con una probabilità di un errore di tipo I di 0,05 e una potenza dell&#39;80%, come riportato in precedenza 15 ). NOTA: La migliore risoluzione è ottenuta mediante l&#39;acquisizione di una Z-stack e la deconvoluzione utilizzando pacchetti software ( ad esempio ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). Il segnaleDeve essere facilmente riconoscibile all&#39;interno del perimetro nucleare, come definito dalla colorazione DAPI. </li><li> Non contare segnali che appaiono chiaramente al di fuori dei nuclei. Tipicamente, il trattamento NCS o l&#39;irraggiamento γ provocano circa 5-10 segnali PLA phosho-p53 / ATM per cellula. I controlli &quot;singolo anticorpo&quot; possono dare un segnale di fondo, ma questo non dovrebbe superare i segnali di PLA per 1 su ogni 20 cellule. </li><li> Per scopi di pubblicazione e presentazione, catturare immagini utilizzando un obiettivo di immersione 40X o 63X. Le diapositive possono essere conservate a 4 ° C e devono essere protette da esposizione alla luce. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

In questa relazione, è dimostrato che PLA può essere utilizzato per determinare e visualizzare l&#39;interazione specifica tra le proteine ​​nelle colture di cellule di sospensione. Da notare, il protocollo descritto qui non è limitato allo studio dei complessi di riparazione del DNA ma si applica anche per visualizzare e quantificare altre interazioni proteine-proteine ​​nelle colture cellulari di sospensione. Si è dimostrato che l&#39;ATM kinasi interagisce con p53 fosforilato nelle cellule BCR-ABL + B-ALL arrestate d...

Il danno del DNA innesca una serie altamente regolamentata di eventi che coinvolgono le interazioni proteico-proteiche e le modificazioni post-traslazionali che garantiscono una riparazione efficiente e rapida del DNA, salvaguardando così l&#39;integrità genomica 1 . In genere, la riparazione del DNA viene studiata in cellule esposte a radiazioni ionizzanti monitorando la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) mediante microscopia a fluorescenza (confocale). Molte protezioni del DNA e proteine ​​che danno i danni del DNA formano IRIFs, che rappresentano complessi proteici che nucleate nei siti di cromatin che sostengono il danno del DNA 2 , 3 . L&#39;ubicazione e la risoluzione degli IRIF nel corso del tempo danno un&#39;importante conoscenza dell&#39;organizzazione spaziale della riparazione del DNA e possono indicare il coinvolgimento di diversi percorsi di riparazione del DNA. La natura del danno del DNA e la fase del ciclo cellulare in cui il danno è raggiunto determina quale percorso di riparazione del DNA è attivato. fo<html> R, in cellule attivamente impegnate nella replicazione del DNA (fase S), la ricombinazione omologa (HR) è il percorso di riparazione dominante del DNA, mentre nelle cellule nella fase G1 o G2 / M del ciclo cellulare, Predominano il percorso di riparazione homologous end-joining (NHEJ). Uno degli eventi più iniziali che segue il danno del DNA è l&#39;attivazione delle proteine ​​della telangiectasia-mutato (ATM) di Ataxia Telangiectasia-Mutated (ATM), che è prevalentemente attiva nelle fasi G1 e G2 / M del ciclo cellulare e regola NHEJ, E Ataxia Telangiectasia e Rad3-related protein (ATR), che agisce in fase S attivando HR. Entrambi ATM e ATR sono cinasi molto pleiotropici che fossicole molte proteine ​​che sono coinvolte nella riparazione del DNA, nella morte cellulare e nella sopravvivenza 4 . Entrambe le chinasi sono state dimostrate di fosforilazione e attivazione della proteina tumor-suppressor p53 a seguito dell&#39;esposizione a stress genotossico, indicando che queste chinasi sono mediatori a monte di un asse di segnalazione suppressivo del tumore pivotal&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 . La formazione e la composizione degli IRIF è tipicamente valutata determinando la co-localizzazione di diverse proteine ​​usando la colorazione immunofluorescenza a due colori e la microscopia, tuttavia non tutte le proteine ​​che fanno parte dei complessi proteici di riparazione formano IRIF che limita l&#39;applicabilità di questo approccio. Inoltre, la microscopia di immunofluorescenza (confocale) è limitata dalle proprietà di diffrazione della luce, con una risoluzione spaziale piuttosto scarsa di circa 200-300 nm, superando le dimensioni delle strutture subcellulari più basse, il che proibisce essenzialmente l&#39;interrogazione diretta delle interazioni protein-proteine ​​a Il livello molecolare. Come tale, la co-localizzazione dei modelli di colorazione delle immunofluorescenza rilevata dalla microscopia a fluorescenza (confocale) non è necessariamente indicativa per le interazioni proteiche-proteiche dirette. Recentemente, sono state sviluppate nuove tecnologie super-risoluzione, come ad esempio strutture struzionali tridimensionali(3D-SIM) 7 , che è stato utilizzato con successo per studiare la formazione di IRBF 53BP1 e BRCA1 a dettagli di nano scala, rivelando le caratteristiche di distribuzione spaziale di queste proteine ​​che non sono state rilevate dalla microscopia a scansione laser a confocale 8 . Molti altri metodi possono essere utilizzati per rilevare interazioni protein-proteine in vivo , quali co-immunoprecipitazione, metodi di abbattimento e approcci di screening a due hibridi di lievito. Tuttavia, queste tecniche sono piuttosto ingombranti, richiedono grandi quantità di cellule o proteine ​​o coinvolgono un&#39;eccessiva espressione delle proteine, che introduce artefatti sperimentali. Più di recente è stata sviluppata una nuova tecnica che consente la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni proteiche-proteiche in situ ( cioè nelle cellule e nei tessuti), chiamata Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrGli anticorpi secondari che riconoscono due proteine ​​di interesse sono rilevati da anticorpi secondari che sono coniugati a oligonucleotidi (cosiddette sonde PLA). Se i due diversi anticorpi secondari sono sufficientemente stretti a causa delle interazioni tra le proteine ​​riconosciute dagli anticorpi primari, gli ioligonucleotidi coniugati si ibridano e possono essere legati per formare un substrato DNA circolare chiuso. Questo substrato circolare viene successivamente amplificato mediante amplificazione a circuito circolare e visualizzata con oligonucleotidi complementari con fluorochrome. Utilizzando PLA, la localizzazione subcellulare dell&#39;interazione proteico-proteica viene mantenuta quando il prodotto di amplificazione del cerchio di laminazione a fluorescenza è rimasto collegato alle sonde PLA. La risoluzione di questo saggio è &lt;50 nm, basata sulla constatazione che il diametro di un anticorpo è di circa 7-10 nm 11 . L&#39;amplificazione del cerchio rotante può avvenire solo nel caso in cui due paia di anticorpi (primario + seconDary) interagiscono fisicamente all&#39;interno del perimetro definito dalla loro dimensione (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). La fase di amplificazione del segnale aumenta la sensibilità del test PLA e consente la rilevazione delle interazioni di proteine ​​appena espresse. PLA genera segnali di punta, simili a foci simili, che possono essere quantificati su base cellulare per cui è possibile valutare la variazione intra-cellulare e inter-cellulare nelle interazioni proteico-proteine. La formazione e la composizione dei complessi di riparazione e IRIF sono principalmente studiati in linee cellulari aderenti come la linea cellulare U2OS osteosarcoma ossea umana, la linea cellulare HEK293 embrionale umana e la linea cellulare epiteliale RPE-pigment retinica, Crescente e facile da trasfettare. Le colture di cellule di sospensione, come quelle lineari di linfoidi e mieloidi, vengono utilizzate meno frequentemente, poiché queste sono meno suscettibili alla trasfezione e generalmente non si adattano a coverlips, richiedendo quindi ulteriori / alternative stEps per l&#39;imaging. La risoluzione dei danni del DNA è però molto rilevante nel contesto delle malignità linfoidi e mieloide, in quanto la risposta dei danni al DNA è spesso influenzata dalle aberrazioni genomiche (driver) in questi tumori, svolgendo un ruolo fondamentale nella trasformazione maligna di linfoidi e mieloidi normali ( Progenitori) le cellule 12 , 13 , 14 . Questo protocollo descrive come il PLA possa essere utilizzato per valutare e quantificare le interazioni proteico-proteiche dopo l&#39;induzione del danno del DNA nelle colture di cellule di sospensione. Qui, PLA viene eseguita per determinare e visualizzare le interazioni tra ATM e p53 sul danno del DNA nelle cellule di leucemia delle cellule umane B che sono indotte a subire un arresto del ciclo cellulare in fase G1. Da notare, il protocollo qui presentato non è limitato allo studio di interazioni ATM e p53 nelle cellule di leucemia arrestate da G1, ma può anche essere utilizzato per visualizzare altri interazioni proteico-proteicoIn vari tipi di cellule e colture di cellule di sospensione.

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare BV173</td><td>DSMZ</td><td>AC-20</td><td>BCR-ABL+ Linea cellulare B-ALL</td></tr><tr><td>Linea cellulare SUP-B15</td><td>DSMZ</td><td>ACC-389</td><td>Linea cellulare BCR-ABL+ B-ALL</td></tr><tr><td>Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>lotto #: 064M3396</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco (Life Tecnologie)</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>imatinib metansulfonato</td><td>LC Laboratories</td><td>I-5508</td><td>Sciogliere in DMSO, preparare 10 mM di soluzione madre</td></tr><tr><td>neocarzinostatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N9162</td><td>Mutageno/teratogeno, maneggiare con cura</td></tr><tr><td>KU55933</td><td>Selleckchem</td><td>S1092</td><td>Sciogliere in DMSO, preparare 5 mM di soluzione madre</td></tr><tr><td>Starfrost Vetrini per microscopia</td><td>Waldemar Knittel</td><td>VA11200 003FKB</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen bloccante</td><td>liquido Sigma Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin imbuto</td><td>Q Path Labonord SAS</td><td>003411324</td><td></td></tr><tr><td>Duolink In Situ Red Starter Kit Capra/Coniglio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DUO92105</td><td>Disponibile per diverse specie/combinazioni, disponibile anche in FarRED, Orange e Green</td></tr><tr><td>goat-anti-ATM</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-136A</td><td>PLA-grade; abbiamo utilizzato con successo il lotto #A300-136A-1 nei nostri studi</td></tr><tr><td>rabbit-anti-phospho-Ser15-p53</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9284</td><td>Abbiamo utilizzato con successo il lotto #9284-4 nei nostri studi</td></tr><tr><td>il mezzo di montaggio antifading Vectashield con DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mezzo di montaggio antisbiadimento</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeide in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Disponibile anche da vari altri fornitori</td></tr></tbody></table>

rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a dna nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

La risposta al danno del DNA orchestra la riparazione delle lesioni del DNA che si verificano spontaneamente, sono causate da stress genotossico o appaiono nel contesto di interruzioni del DNA programmate nei linfociti. Tra le prime che sono attivate dopo l&#39;induzione del danno del DNA, sono state individuate le chinasi mutanti (ATM) di Ataxia-Telangiectasia mutata (ATM), kinasi ATM- e Rad3-correlata (ATR) e la subunità catalitica della proteina-chinasi dipendente dal DNA (DNA-PKcs) Regolatori centrali di una rete che controlla la riparazione del DNA, l&#39;apoptosi e la sopravvivenza cellulare. Come parte di un percorso che sopprime il tumore, ATM e ATR attivano la p53 attraverso la fosforilazione, regolando così l&#39;attività trascrizionale della p53. Il danno del DNA provoca anche la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) che rappresentano complessi di sensori di danni del DNA e proteine ​​di riparazione che si accumulano nei siti di danni del DNA, visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. La co-localizzazione delle proteine ​​in IRIF, tuttavia, non implica necessariamente dLe interazioni proteiche proteiche, in quanto la risoluzione della microscopia a fluorescenza è limitata. In locazione Proximity Ligation Assay (PLA) è una tecnica innovativa che consente la visualizzazione diretta delle interazioni proteico-proteiche in cellule e tessuti con specificità e sensibilità senza precedenti. Questa tecnica si basa sulla prossimità spaziale di anticorpi specifici legati alle proteine ​​di interesse. Quando le proteine ​​interrogate sono all&#39;interno di ~ 40 nm una reazione di amplificazione viene innescato da oligonucleotidi che sono coniugati agli anticorpi e il prodotto di amplificazione è visualizzato mediante etichettatura fluorescente, dando un segnale che corrisponde alla localizzazione subcellulare delle proteine ​​interagenti. Utilizzando l&#39;interazione funzionale stabilita tra ATM e p53, è qui dimostrato come il PLA possa essere utilizzato nelle colture di cellule di sospensione per studiare le interazioni dirette tra le proteine ​​che costituiscono parte integrante della risposta del danno del DNA.

La fosforilazione del p53 al residuo Ser15 è risultata dipendente dall&#39;attività di ATM kinasi 16 . Per dimostrare e confermare la specificità della tecnica PLA sulle preparazioni citospiniche di colture di cellule di sospensione, si è dimostrato che l&#39;induzione del danno del DNA mediante trattamento a 2 ore di NCS di cellule BCR-ABL + B-ALL arrestate nella fase G1 del ciclo cellulare Ha determinato l&#39;interazione specifica tra ATM e fosfo-Ser15-p53, com...

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento basato sul saggio di legazione per prossimità è visualizzare e quantificare la formazione di complessi proteici coinvolti nella risposta e riparazione del danno al DNA a seguito dell'induzione di lesioni del DNA in colture cellulari in sospensione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione del danno al DNA, come l'organizzazione spaziotemporale e la regolazione dei meccanismi di riparazione, e il modo in cui diversi percorsi di riparazione rispondono a tipi differenti di danno al DNA. I principali vantaggi di questa tecnica sono la relativa semplicità, il ridotto numero di cellule richiesto e l'assenza di passaggi di elaborazione complessi, che potrebbero alterare o interrompere le interazioni proteina-proteina.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul riparo del DNA e sulla formazione di complessi proteici in cellule in sospensione coltivate, può essere applicato anche a cellule aderenti coltivate, tessuti congelati o inclusi in paraffina e persino su animali interi. Nello studio viene utilizzata la linea cellulare umana di leucemia linfoblastica B positiva per BCR, BV-173, coltivata in IMDM con integratori a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di 5%CO2. Pianificare le cellule a due volte 10 alla sesta per millilitro in una piastra a sei pozzetti con cinque millilitri per pozzetto.Per arrestare le cellule nella fase G1 del ciclo cellulare, aggiungere cinque micromolar di metansolfonato di ammonio in ciascun pozzetto e incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di 5% CO₂. Il giorno successivo, aggiungere cinque micromolar di un inibitore dell'ATM in ciascuno di due pozzetti e reinserire la piastra nell'incubatore per 30 minuti. Successivamente, indurre il danno al DNA aggiungendo 50 nanogrammi per millilitro di NCS a uno dei pozzetti pretrattati con l'inibitore dell'ATM e a un altro pozzetto non pretrattato.Incubare per due ore. Preparare 1X PBS con 10% di BSA stratificando cinque grammi di BSA frazione 5 sulla sommità di 50 millilitri di 1X PBS in un becher e lasciare a temperatura ambiente senza agitare o mescolare fino a quando la BSA si sarà completamente disciolta. Filtrare lentamente la soluzione di PBS con 10% di BSA attraverso un filtro da 0,22 micrometri e mantenere sul ghiaccio.Raccogliere le cellule trasferendo il contenuto di ogni pozzetto in una provetta da 15 millilitri. Lavare le cellule due volte con 1XBPS freddo di ghiaccio. Dopo aver contato le cellule, risospendere a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro in 1XBPS più 10% BSA.Mantenere le cellule sul ghiaccio. Preparare i vetrini per microscopia lucida lucidandoli accuratamente con tessuto senza lanugine e sgrassandoli immergendoli in un barattolo di Coplin contenente etanolo al 96% per cinque minuti. Lasciare asciugare i vetrini all'aria per 10 minuti.Assemblare i vetrini da microscopia nei beccucci citospin per citologia con una capacità di sei millilitri. Rivestire preventivamente i vetrini pipettando 50 microlitri di PBS 1X più 10% BSA in ciascun beccuccio e centrifugare per un minuto a 500 giri al minuto. Aggiungere a ciascun beccuccio 100 microlitri della sospensione cellulare e centrifugare a 500 giri al minuto per cinque minuti.Smontare con attenzione i becher e fare attenzione a non toccare le gocce sui vetrini. Utilizzare un bloccante liquido con penna Pap dotata di punta da cinque millimetri per tracciare un cerchio intorno a ciascuna goccia. Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione fissante al 4% di PFA su ogni goccia.E incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavare le cellule con PBS 1X in un barattolo Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata. Lavare tre volte in questo modo per cinque minuti ogni volta.Asciugare le diapositive intorno ai punti con un tessuto senza lanugine e rimuovere il più liquido possibile dai punti inclinando la diapositiva e asciugando con un tessuto senza lanugine. Aggiungere 50 microlitri di Triton X 0,25% in PBS 1X a ciascun punto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Lavare le diapositive in 50-60 millilitri di TBS-T in un barattolo Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata.Tre volte per cinque minuti ciascuna. Prima del bloccaggio, eliminare il TBS-T tamponando e asciugare le vetrine intorno alle macchie con un tessuto senza pelucchi. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di liquido dalla macchia.Vortexare brevemente la soluzione di blocco, quindi aggiungere una goccia di circa 40 microlitri su ogni spot. Posizionare i vetrini in una camera umidificata preriscaldata e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Preparare i cocktail di anticorpi.Vortexare e quindi pipettare il diluente per anticorpi commerciale in ogni provetta microcentrifuga. Aggiungere l'anticorpo caprino anti-ATM in diluizione 1:1000 e l'anticorpo coniglio anti-fosfoserina-15 p53 in diluizione 1:100.Per esperimenti di controllo con singolo anticorpo, preparare diluizioni di anticorpo contenenti esclusivamente l'anticorpo caprino anti-ATM e l'anticorpo coniglio anti-fosfoserina-15 p53. Al termine dell'incubazione di un'ora, rimuovere con delicatezza la soluzione di blocco, avendo cura di non far asciugare le cellule. Aggiungere 30 microlitri di ciascuna diluizione del cocktail di anticorpi e incubare in una camera umidificata a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno seguente, lavare i vetrini con tampone di lavaggio A 1X NC2 in un barattolo di Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata due volte per cinque minuti ciascuna. Dopo aver lavato i vetrini due volte con il tampone di lavaggio A, rimuovere delicatamente il tampone dai vetrini e aggiungere 30 microlitri della miscela di sonde per il saggio di legatura in prossimità su ogni spot. Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per un'ora.Lavare i vetrini con 50-60 millilitri di tampone di lavaggio A in un barattolo Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata. Successivamente, preparare la soluzione di ligasi per la ligazione sul ghiaccio aggiungendo un microlitro di ligasi a 39 microlitri di soluzione di ligazione per ogni spot. Aggiungere 40 microlitri della soluzione di ligasi per la ligazione a ogni spot.Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per 30 minuti. Lavare i vetrini con tampone di lavaggio A in un barattolo di Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata. Preparare la miscela di polimerasi per l'amplificazione sul ghiaccio.Prima diluire la soluzione madre di amplificazione da uno a cinque in acqua. Aggiungere 0,5 microlitri di polimerasi a 39,5 microlitri di soluzione di amplificazione 1X per ogni punto. Rimuovere delicatamente il tampone di lavaggio e aggiungere 40 microlitri di miscela di polimerasi per l'amplificazione per ogni punto.Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per 100 minuti. Al termine dell'incubazione di 100 minuti, rimuovere delicatamente la miscela di polimerasi di amplificazione e lavare i vetrini con tampone di lavaggio NC2 1X soluzione B in un barattolo Coplin. Effettuare due lavaggi a temperatura ambiente con agitazione delicata, per 10 minuti ciascuno.Successivamente, lavare i vetrini nel buffer di lavaggio B 0,01x per un minuto. Rimuovere il buffer di lavaggio B in eccesso e asciugare i vetrini intorno alle macchie con un tessuto senza pelucchi. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di liquido dalle macchie.Preparare un mezzo di montaggio contenente DAPI che non causi una colorazione eccessiva dei nuclei, diluendo il mezzo di montaggio contenente DAPI in rapporto 1:5 con mezzo di montaggio senza DAPI. Aggiungere da 25 a 30 microlitri del mezzo di montaggio diluito contenente DAPI su un coprivetrino di 24 millimetri per 24 millimetri. Prelevare il coprivetrino con il vetrino e applicare una leggera pressione per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria intrappolate.Sigillare il vetrino con lo smalto per unghie e attendere almeno 15 minuti prima dell'acquisizione delle immagini. Infine, acquisire e analizzare i preparati utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. Il saggio di legatura per prossimità è stato utilizzato per studiare l'interazione tra ATM e fosfoserina 15 p53 in cellule umane BV 173 positive per BCR-abl arrestate nella fase G1.A differenza delle cellule che non sono state trattate con NCS per indurre danni al DNA, la maggior parte delle cellule trattate con NCS ha mostrato segnali puntiformi esclusivamente nel nucleo, con una media di sette segnali per cellula. Ciò indica che l'induzione di danni al DNA determina l'interazione tra ATM e p53 fosforilata sul residuo serina 15. Il pretrattamento delle cellule con un inibitore specifico della chinasi ATM prima dell'induzione del danno al DNA riduce il numero di segnali a una media di due segnali per cellula, confermando che la fosforilazione della p53 sul residuo serina 15 dipende dall'attività della chinasi ATM.Gli esperimenti di controllo con singolo anticorpo, in cui era omesso o l'anticorpo anti ATM o l'anticorpo anti fosfoserina 15 p53, non hanno prodotto segnali, come previsto. Questa figura presenta la quantificazione e l'analisi statistica dei risultati, che dimostrano e confermano la specificità della tecnica del saggio di legatura per prossimità su preparati citospin di colture cellulari in sospensione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore dopo un'incubazione notturna con un anticorpo primario, se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di titolare attentamente l'anticorpo mediante colorazione immunofluorescente delle cellule di interesse prima di effettuare il saggio di ligazione in prossimità. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in biologia cellulare per esplorare interazioni transitorie tra proteine che risultano difficili da valutare utilizzando metodi standard come immunoprecipitazioni e imaging basato su FRET, i quali spesso generano artefatti tecnici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il saggio di ligazione in prossimità su colture cellulari in sospensione per visualizzare e quantificare interazioni tra proteine in situ.

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Rilevamento delle interazioni proteina-proteina nelle larve di Drosophila utilizzando un saggio di legatura di prossimità

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Rilevamento di In Situ Complessi proteina-proteina del Drosophila Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

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Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

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Un'analisi semplice, rapida e quantitativa per riparazione di misura di legami incrociati della DNA-proteina su plasmidi Transfected nelle cellule di mammifero

Qui, vi mostriamo come utilizzare un dosaggio di legatura di prossimità (PLA) per visualizzare MST1/MST2 eterodimerizzazione in celle fisse con alta sensibilità.

Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura

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Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

I saggi di acquisizione D-loop (DLC) e D-loop extension (DLE) utilizzano il principio della legatura di prossimità insieme alla PCR quantitativa per quantificare la formazione di D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto nel sito di una rottura inducibile a doppio filamento in Saccharomyces cerevisiae.

Individuazione di intermedi di ricombinazione omologhi tramite legatura di prossimità e PCR quantitativa in Saccharomyces cerevisiae

Qui, presentiamo un protocollo semplice e rapido per il rilevamento dell'interazione proteica nei siti di danno al DNA.

Saggio del ligando di prossimità per localizzare le proteine nei siti di danno al DNA

Scopri come rilevare e visualizzare complessi proteici indotti da danni al DNA nelle cellule in sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità (PLA). Questo metodo permette di quantificare le interazioni tra proteine di riparazione.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità (Video) | JoVE Journal

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

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