Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

L'obiettivo generale di questo esperimento basato sul saggio di legazione per prossimità è visualizzare e quantificare la formazione di complessi proteici coinvolti nella risposta e riparazione del danno al DNA a seguito dell'induzione di lesioni del DNA in colture cellulari in sospensione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della riparazione del danno al DNA, come l'organizzazione spaziotemporale e la regolazione dei meccanismi di riparazione, e il modo in cui diversi percorsi di riparazione rispondono a tipi differenti di danno al DNA. I principali vantaggi di questa tecnica sono la relativa semplicità, il ridotto numero di cellule richiesto e l'assenza di passaggi di elaborazione complessi, che potrebbero alterare o interrompere le interazioni proteina-proteina.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul riparo del DNA e sulla formazione di complessi proteici in cellule in sospensione coltivate, può essere applicato anche a cellule aderenti coltivate, tessuti congelati o inclusi in paraffina e persino su animali interi. Nello studio viene utilizzata la linea cellulare umana di leucemia linfoblastica B positiva per BCR, BV-173, coltivata in IMDM con integratori a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di 5%CO2. Pianificare le cellule a due volte 10 alla sesta per millilitro in una piastra a sei pozzetti con cinque millilitri per pozzetto.

Per arrestare le cellule nella fase G1 del ciclo cellulare, aggiungere cinque micromolar di metansolfonato di ammonio in ciascun pozzetto e incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di 5% CO₂. Il giorno successivo, aggiungere cinque micromolar di un inibitore dell'ATM in ciascuno di due pozzetti e reinserire la piastra nell'incubatore per 30 minuti. Successivamente, indurre il danno al DNA aggiungendo 50 nanogrammi per millilitro di NCS a uno dei pozzetti pretrattati con l'inibitore dell'ATM e a un altro pozzetto non pretrattato.

Incubare per due ore. Preparare 1X PBS con 10% di BSA stratificando cinque grammi di BSA frazione 5 sulla sommità di 50 millilitri di 1X PBS in un becher e lasciare a temperatura ambiente senza agitare o mescolare fino a quando la BSA si sarà completamente disciolta. Filtrare lentamente la soluzione di PBS con 10% di BSA attraverso un filtro da 0,22 micrometri e mantenere sul ghiaccio.

Raccogliere le cellule trasferendo il contenuto di ogni pozzetto in una provetta da 15 millilitri. Lavare le cellule due volte con 1XBPS freddo di ghiaccio. Dopo aver contato le cellule, risospendere a due volte 10 alla sesta cellule per millilitro in 1XBPS più 10% BSA.

Mantenere le cellule sul ghiaccio. Preparare i vetrini per microscopia lucida lucidandoli accuratamente con tessuto senza lanugine e sgrassandoli immergendoli in un barattolo di Coplin contenente etanolo al 96% per cinque minuti. Lasciare asciugare i vetrini all'aria per 10 minuti.

Assemblare i vetrini da microscopia nei beccucci citospin per citologia con una capacità di sei millilitri. Rivestire preventivamente i vetrini pipettando 50 microlitri di PBS 1X più 10% BSA in ciascun beccuccio e centrifugare per un minuto a 500 giri al minuto. Aggiungere a ciascun beccuccio 100 microlitri della sospensione cellulare e centrifugare a 500 giri al minuto per cinque minuti.

Smontare con attenzione i becher e fare attenzione a non toccare le gocce sui vetrini. Utilizzare un bloccante liquido con penna Pap dotata di punta da cinque millimetri per tracciare un cerchio intorno a ciascuna goccia. Quindi aggiungere 50 microlitri di soluzione fissante al 4% di PFA su ogni goccia.

E incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, lavare le cellule con PBS 1X in un barattolo Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata. Lavare tre volte in questo modo per cinque minuti ogni volta.

Asciugare le diapositive intorno ai punti con un tessuto senza lanugine e rimuovere il più liquido possibile dai punti inclinando la diapositiva e asciugando con un tessuto senza lanugine. Aggiungere 50 microlitri di Triton X 0,25% in PBS 1X a ciascun punto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Lavare le diapositive in 50-60 millilitri di TBS-T in un barattolo Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata.

Tre volte per cinque minuti ciascuna. Prima del bloccaggio, eliminare il TBS-T tamponando e asciugare le vetrine intorno alle macchie con un tessuto senza pelucchi. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di liquido dalla macchia.

Vortexare brevemente la soluzione di blocco, quindi aggiungere una goccia di circa 40 microlitri su ogni spot. Posizionare i vetrini in una camera umidificata preriscaldata e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Preparare i cocktail di anticorpi.

Vortexare e quindi pipettare il diluente per anticorpi commerciale in ogni provetta microcentrifuga. Aggiungere l'anticorpo caprino anti-ATM in diluizione 1:1000 e l'anticorpo coniglio anti-fosfoserina-15 p53 in diluizione 1:100.

Per esperimenti di controllo con singolo anticorpo, preparare diluizioni di anticorpo contenenti esclusivamente l'anticorpo caprino anti-ATM e l'anticorpo coniglio anti-fosfoserina-15 p53. Al termine dell'incubazione di un'ora, rimuovere con delicatezza la soluzione di blocco, avendo cura di non far asciugare le cellule. Aggiungere 30 microlitri di ciascuna diluizione del cocktail di anticorpi e incubare in una camera umidificata a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, lavare i vetrini con tampone di lavaggio A 1X NC2 in un barattolo di Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata due volte per cinque minuti ciascuna. Dopo aver lavato i vetrini due volte con il tampone di lavaggio A, rimuovere delicatamente il tampone dai vetrini e aggiungere 30 microlitri della miscela di sonde per il saggio di legatura in prossimità su ogni spot. Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per un'ora.

Lavare i vetrini con 50-60 millilitri di tampone di lavaggio A in un barattolo Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata. Successivamente, preparare la soluzione di ligasi per la ligazione sul ghiaccio aggiungendo un microlitro di ligasi a 39 microlitri di soluzione di ligazione per ogni spot. Aggiungere 40 microlitri della soluzione di ligasi per la ligazione a ogni spot.

Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per 30 minuti. Lavare i vetrini con tampone di lavaggio A in un barattolo di Coplin a temperatura ambiente con agitazione delicata. Preparare la miscela di polimerasi per l'amplificazione sul ghiaccio.

Prima diluire la soluzione madre di amplificazione da uno a cinque in acqua. Aggiungere 0,5 microlitri di polimerasi a 39,5 microlitri di soluzione di amplificazione 1X per ogni punto. Rimuovere delicatamente il tampone di lavaggio e aggiungere 40 microlitri di miscela di polimerasi per l'amplificazione per ogni punto.

Incubare a 37 gradi Celsius in una camera umidificata preriscaldata per 100 minuti. Al termine dell'incubazione di 100 minuti, rimuovere delicatamente la miscela di polimerasi di amplificazione e lavare i vetrini con tampone di lavaggio NC2 1X soluzione B in un barattolo Coplin. Effettuare due lavaggi a temperatura ambiente con agitazione delicata, per 10 minuti ciascuno.

Successivamente, lavare i vetrini nel buffer di lavaggio B 0,01x per un minuto. Rimuovere il buffer di lavaggio B in eccesso e asciugare i vetrini intorno alle macchie con un tessuto senza pelucchi. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di liquido dalle macchie.

Preparare un mezzo di montaggio contenente DAPI che non causi una colorazione eccessiva dei nuclei, diluendo il mezzo di montaggio contenente DAPI in rapporto 1:5 con mezzo di montaggio senza DAPI. Aggiungere da 25 a 30 microlitri del mezzo di montaggio diluito contenente DAPI su un coprivetrino di 24 millimetri per 24 millimetri. Prelevare il coprivetrino con il vetrino e applicare una leggera pressione per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria intrappolate.

Sigillare il vetrino con lo smalto per unghie e attendere almeno 15 minuti prima dell'acquisizione delle immagini. Infine, acquisire e analizzare i preparati utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. Il saggio di legatura per prossimità è stato utilizzato per studiare l'interazione tra ATM e fosfoserina 15 p53 in cellule umane BV 173 positive per BCR-abl arrestate nella fase G1.

A differenza delle cellule che non sono state trattate con NCS per indurre danni al DNA, la maggior parte delle cellule trattate con NCS ha mostrato segnali puntiformi esclusivamente nel nucleo, con una media di sette segnali per cellula. Ciò indica che l'induzione di danni al DNA determina l'interazione tra ATM e p53 fosforilata sul residuo serina 15. Il pretrattamento delle cellule con un inibitore specifico della chinasi ATM prima dell'induzione del danno al DNA riduce il numero di segnali a una media di due segnali per cellula, confermando che la fosforilazione della p53 sul residuo serina 15 dipende dall'attività della chinasi ATM.

Gli esperimenti di controllo con singolo anticorpo, in cui era omesso o l'anticorpo anti ATM o l'anticorpo anti fosfoserina 15 p53, non hanno prodotto segnali, come previsto. Questa figura presenta la quantificazione e l'analisi statistica dei risultati, che dimostrano e confermano la specificità della tecnica del saggio di legatura per prossimità su preparati citospin di colture cellulari in sospensione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa cinque ore dopo un'incubazione notturna con un anticorpo primario, se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di titolare attentamente l'anticorpo mediante colorazione immunofluorescente delle cellule di interesse prima di effettuare il saggio di ligazione in prossimità. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in biologia cellulare per esplorare interazioni transitorie tra proteine che risultano difficili da valutare utilizzando metodi standard come immunoprecipitazioni e imaging basato su FRET, i quali spesso generano artefatti tecnici. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il saggio di ligazione in prossimità su colture cellulari in sospensione per visualizzare e quantificare interazioni tra proteine in situ.