Generazione del primo cuore campo-come progenitori cardiaci e ventricolare-come cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti umane

Il vantaggio principale di questa semplice tecnica è quello di generare progenitori cardiaci e cardiomiociti di origine e sottotipi definiti del campo cardiaco. A loro volta, le cellule risultanti possono essere utilizzate per un'ampia gamma di applicazioni di ricerca, tra cui la biologia dello sviluppo di base, la terapia cellulare proof-of-concept e gli studi di modellazione delle malattie cardiache. A dimostrare la procedura saranno Sean Spiering e Michael Yu del mio laboratorio.

Per iniziare, rivestire un numero sufficiente di pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 50 microlitri di reagente di rivestimento per accogliere le successive fasi di semina cellulare e infezione virale, quindi aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione a un pozzetto nella piastra a sei pozzetti per staccare le cellule staminali pluripotenti seminate. Quindi, utilizzare una pipetta sterile per trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga di plastica da 15 millilitri. Nella provetta, aggiungere cinque millilitri di PBS contenente calcio e magnesio per neutralizzare il reagente di dissociazione.

Quindi centrifugare le celle a 200 volte g per tre minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e quindi muovere delicatamente il tubo per rimuovere il pellet. Quindi sciogliere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura delle cellule staminali.

Quindi, utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare il numero di celle. Una volta effettuato il conteggio, seminare 20.000 cellule vitali in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente 50 microlitri di terreno di cellule staminali integrato con un inibitore della via RHO/ROCK a due micromolari. Dopo 24 ore, monitorare l'attacco cellulare, quindi sostituire il terreno con 100 microlitri di terreno di coltura di cellule staminali un'ora prima dell'infezione lentivirale.

Quindi, scongelare il lentivirus Id1 con ghiaccio, quindi aggiungere tre microlitri di lentivirus purificato per pozzetto. Dopo aver aggiunto il lentivirus, trasferire nuovamente la piastra nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. 24 ore dopo l'infezione virale, aggiungere 100 microlitri di terreno di cellule staminali fresche alle cellule infette.

Dopo 48 ore, sostituire il terreno contenente il virus con 200 microlitri di terreno di cellule staminali fresche integrate con un microgrammo per millilitro di puromicina. Ogni giorno, continua a cambiare il terreno con 200 microlitri di terreno di coltura con cellule staminali integrati con un microgrammo per millilitro di puromicina. Iniziare il processo di differenziazione il giorno 0 sostituendo il terreno di coltura staminale con 1,5 millilitri di terreno di induzione con Activina A in una piastra a 12 pozzetti.

24 ore dopo l'inizio della differenziazione, sostituire il terreno con due millilitri di terreno di induzione senza Activina A.Il terzo giorno, sostituire con due millilitri di terreno di induzione senza Activina A.Il quinto giorno, aspirare l'intero terreno dal pozzetto contenente i CP FHF-L, quindi aggiungere immediatamente un millilitro di reagente di dissociazione contenente enzima caldo nel pozzetto, quindi incubare la piastra di coltura a 37 gradi Celsius. Dopo un minuto, agitare la piastra all'interno dell'incubatrice e rimuoverla dall'incubatrice dopo due minuti, quindi aggiungere un millilitro di terreno contenente siero fetale bovino al 10% nel pozzetto. Staccare le cellule dalla piastra pipettandole delicatamente verso l'alto e verso il basso.

Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e sottoporla a centrifugazione. Dopo la centrifugazione, sciogliere il pellet cellulare in due millilitri di reagente di crioconservazione, quindi contare il numero di cellule. Quindi trasferire le cellule nelle fiale di crioconservazione e lasciare le fiale nel dispositivo di raffreddamento.

Quindi trasferire il dispositivo a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Dopo 24 ore, trasferire le fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Poco prima di scongelare i CP FHF-L, rivestire i pozzetti della piastra a 12 pozzetti con due millilitri di reagente di rivestimento.

Quindi trasferisci i CP FHF-L vecchi di cinque giorni dall'azoto liquido in un contenitore di ghiaccio secco. Dal ghiaccio secco, trasferire la fiala a bagnomaria a 37 gradi Celsius per due minuti per garantire il completo scongelamento. Dopo che le cellule sono completamente scongelate, trasferirle in una provetta da centrifuga, quindi pipettare 10 gocce di terreno cardiogeno preriscaldato ogni 30 secondi nella soluzione cellulare.

Continua ad aggiungere il mezzo cardiogeno fino a quando il rapporto tra crioconservazione e medio cardiogeno raggiunge uno a tre. Successivamente sottoporre le cellule a centrifugazione. Dopo la centrifugazione rimuovere il surnatante e muovere con cautela la provetta, quindi sciogliere il pellet cellulare in un mezzo cardiogeno integrato con un inibitore della via RHO/ROCk a due micromolari.

Diluire ulteriormente la sospensione cellulare con terreno cardiogeno per ottenere la concentrazione cellulare desiderata. Quindi seminare le cellule sulla piastra di coltura contenente due millilitri di terreno cardiogeno. Lasciare la piastra nella cappa di coltura tissutale per 20 minuti prima di trasferirla nell'incubatore.

Monitorare l'attacco cellulare al sesto giorno di differenziazione. Il settimo giorno, aspirare metà del terreno cardiogeno e sostituirlo con un terreno fresco. Da qui in poi, sostituire il 50% del mezzo cardiogeno a giorni alterni, quindi, al 15° giorno, quantificare la differenziazione cardiaca.

Qui il livello di espressione dell'mRNA di Id1 è quantificato nelle linee cellulari hESC e hPSC. Per la differenziazione vengono utilizzate solo linee hPSC che esprimono l'mRNA di Id1 a livelli superiori a 0,005 volte GAPDH. Qui sono mostrate immagini in campo chiaro post-differenziazione di hPSC ottimali, sub-confluenti e sovra-confluenti al giorno 0.

Dopo un'ulteriore differenziazione, la confluenza cellulare raggiunge il 75% dopo 24 ore. Al giorno 3, le cellule in fase di differenziazione formano un cluster e, entro il giorno 5, le cellule rimangono in cluster strettamente connessi con morfologia omogenea. Al giorno 6, i CP FHF-L coprono oltre il 90% della superficie dei pozzi.

Infatti, entro il 12° giorno, i cardiomiociti iniziano a battere e mostrano contrazioni cardiache. Più avanti nel processo di differenziazione, c'è un aumento dei livelli di espressione dell'mRNA di MYL2 e IRX4 dopo il giorno 15. Entrambe le proteine rappresentano marcatori ventricolari-specifici all'interno dei cardiomiociti.

Qui la traccia del potenziale d'azione rappresenta le rapide velocità di corsa verso l'alto e verso il basso, nonché il plateau ventricolare. Questi tassi erano caratteristici dei cardiomiociti di tipo ventricolare al giorno 25 di differenziazione. In sintesi, ci vogliono circa due settimane per generare cellule staminali pluripotenti umane sovraesprimenti Id1, poi ci vogliono circa cinque giorni per generare i primi progenitori simili al campo cardiaco e circa 10 giorni per generare cardiomiociti simili al ventricolo battente.