Name: Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Scopri come isolare e trapiantare precursori di interneuroni da regioni cerebrali di cuccioli di topo neonati per studiare la maturazione neuronale. Questo metodo permette di analizzare l'adattamento cellulare in nuovi ambienti cerebrali.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (K99MH104595) e il programma di ricerca intramurale NICHD a T.J.P. Ringraziamo Gord Fishell, nel cui laboratorio questo approccio originalmente è stato stabilito.

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<li>Alvarez-Dolado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+inhibition+modified+by+embryonic+neural+precursors+grafted+into+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain.</a> J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).</li>
<li>Baraban, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+seizures+by+transplantation+of+cortical+GABAergic+interneuron+precursors+into+Kv1.1+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).</li>
<li>De la Cruz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+progenitors+attenuate+the+power+of+acute+focal+ictal+discharges%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges.</a> Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).</li>
<li>Gilani, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+precursor+transplants+in+adult+hippocampus+reverse+psychosis-relevant+features+in+a+mouse+model+of+hippocampal+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).</li>
<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un aspetto critico di questo protocollo è massimizzare le possibilità di sopravvivenza delle cellule. Garantire che i tessuti e le cellule siano sempre in ghiaccio freddo carboxygenated sACSF è necessario promuovere la sopravvivenza delle cellule. Ciò richiede una strategia di dissociazione per ridurre al minimo la lunghezza del tempo che le cellule spendono in varie soluzione e all'esterno dell'ambiente di cervello e di dissezione efficiente. A seconda del numero di regioni del cervello essere sezionato e trapiantato, p...

La funzione corticale appropriata richiede un equilibrio tra neuroni di proiezione eccitatori e inibitori GABAergici, una popolazione estremamente eterogenea con morfologie distinte, proprietà elettrofisiologiche, connettività e neurochimici marcatori. Sviluppo anormale e funzione di interneuroni (e sottogruppi specifici Interneurone) è stato collegato a pathobiology di disturbi psichiatrici come la schizofrenia, autismo ed epilessia1,2,3. Inoltre, molti geni implicati in questi disordini del cervello sono fortemente arricchiti in interneuroni giovane4. Così, una maggiore comprensione dei meccanismi che regolano la maturazione e la determinazione di destino Interneurone è necessaria per comprendere lo sviluppo normale e potenziali eziologie delle numerose malattie del cervello.
Interneuroni del forebrain nascono principalmente da due strutture embrionali transitorie, le eminenze gangliare mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente). Queste cellule postmitotic (precursori Interneurone) quindi subire una fase prolungata migrazione tangenziale per disperdere tutto il telencefalo dove si integrano in una vasta gamma di circuiti. Interneuroni MGE-derivati sono costituiti da tre sottogruppi in gran parte non sovrapposte, neurochemically definiti: veloce chiodare interneuroni parvalbumina (PV+), non-fast chiodare interneuroni della somatostatina (SST+) e tardi chiodare un neurone nitrico interneuroni ossido di sintetasi (nNOS+) che costituiscono le cellule hippocampal di neurogliaform ed edera. Numerosi laboratori hanno identificato parecchi meccanismi all'interno di MGE che regolano le decisioni iniziali destino in PV+ o SST + interneuroni, compresi gradienti spaziali di morfogeni, data di nascita dei precursori Interneurone e la modalità di divisione neurogena 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. è stato proposto che interneuroni inizialmente differenziano in 'Cardinale classi' e poi progressivamente maturano in 'definitive classi' come essi interagiscono con il loro ambiente11. La prova recente indica che alcuni sottotipi di Interneurone maturo possono essere geneticamente hardwired come queste cellule diventano postmitotic in eminenze gangliare, che indica che presto definiti programmi genetici intrinseci possono svolgere un ruolo più importante rispetto al passato apprezzata12,13. Tuttavia, la questione chiave di come l'intrinseci programmi genetici interagiscono con stimoli ambientali alla differenziazione di unità in sottotipi distinti Interneurone rimane in gran parte inesplorata.
Numerosi studi sono trapiantate cellule embrionali MGE direttamente in una varietà di regioni del cervello, con i risultati di consenso che innestano le cellule maturo e il rilascio di GABA per inibire generalmente il locale circuiti endogeni14,15, 16,17,18,19. Queste promettenti osservazioni hanno generato notevole interesse nell'utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hIPSC)-derivato interneuroni per trattare una varietà di malattie del cervello. Tuttavia, molto pochi di questi studi valutare se queste cellule innestate maturano in tipi previsti di interneuroni maturi, un componente critico quando uno pensa di approcci traslazionali.
Per affrontare come ambiente influenza la Interneurone differenziazione e maturazione, una strategia è stata ideata per trapiantare precursori immaturi Interneurone in nuovi ambienti di cervello al fine di esaminare se innestate interneuroni adottano funzionalità dell'host ambiente o conservano le caratteristiche del donatore ambiente20. MGE trapianti non sono adatti per affrontare questa domanda perché il MGE contiene una popolazione mista di Interneurone e cellule di proiezione GABAergici che disperdono nel corso di numerose regioni di cervello21. Senza sapere dove queste cellule MGE avrebbero migrato, uno non può pienamente valutare come questi trapianti sono colpiti dall'ambiente del cervello. Raccogliendo i precursori Interneurone timepoints postnatale precoce, questo problema è aggirato con l'ottenimento di cellule immature che hanno completato la loro migrazione e raggiunto la loro destinazione regione del cervello, ma hanno un'interazione minima con l'ambiente. Focalizzando l'attenzione sulle specifiche caratteristiche di interneuroni che sono differenzialmente espressi tra regioni distinte del cervello, si può quindi determinare come l'ambiente host cambia proprietà Interneurone. L'approccio generale descritto in questo protocollo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi investigatore che vuole esaminare come i giovani neuroni si comportano quando ha sfidato in un nuovo ambiente.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Matrici cerebrali</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Necessario solo se si raccoglie lo striato</td></tr><tr><td>Punta fine Dumont Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microdissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore manuale con supporto</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 5 ml a fondo tondo in plastica</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 60 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Filtri DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Tripano blu</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

homochronic trapianto di precursori interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Maturazione e la determinazione di destino neuronale richiede un gioco intricato tra programmi genetici e segnali ambientali. Tuttavia, districare i ruoli di intrinseca vs estrinseche meccanismi che regolano questo processo di differenziazione è un enigma per tutti i neurobiologi inerente allo sviluppo. Questo problema è amplificato per interneuroni GABAergici, una popolazione incredibilmente eterogenee delle cellule che è nato da strutture embrionali transitorie e sottoposti a una prolungata fase migratoria per disperdere tutto il telencefalo. Per esplorare come i diversi ambienti di cervello influenzano interneurone destino e maturazione, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta dei precursori Interneurone immaturo fluorescente contrassegnati da regioni specifiche del cervello in topi neonati (P0-P2). A questa età, migrazione Interneurone è quasi completa e queste cellule risiedono nei loro ambienti di riposo finale con relativamente poca integrazione sinaptica. Dopo il prelievo delle soluzioni di singola cellula tramite citometria a flusso, questi precursori Interneurone sono trapiantati in P0-P2 wildtype postnatali cuccioli. Eseguendo entrambi omotope (per esempio, corteccia di corteccia) o eterotopica (ad es., corteccia di ippocampo) trapianti, si può valutare come impegnativo immaturi interneuroni in nuovi ambienti di cervello colpisce il loro destino, la maturazione e l'integrazione di circuito. Cervelli possono essere raccolte in topi adulti e analizzati con una vasta gamma di analisi posthoc su cellule innestate, compreso immunohistochemical, elettrofisiologici e transcriptional profiling. Questo approccio generale fornisce gli investigatori con una strategia di test come distinti ambienti di cervello possono influenzare numerosi aspetti dello sviluppo del neurone e identificare se caratteristiche specifiche di un neurone sono principalmente guidate da programmi genetici hardwired o stimoli ambientali.

Questo protocollo viene illustrato come raccogliere regioni specifiche del cervello dal cervello postnatale precoce (Figura 1-2), raccogliere dissociazioni singola cella dei precursori Interneurone e trapianto di queste cellule in varie regioni del cervello in ingenuo WT cuccioli postnatali (Figura 3). Per l'analisi posthoc, cervelli che hanno ricevuto gli innesti Interneurone precursore sono state raccolte tra P...

Sfidando i neuroni giovani in nuove regioni del cervello possa rivelare importanti intuizioni come l'ambiente scolpisce maturazione e destino neuronale. Questo protocollo descrive una procedura per raccogliere precursori Interneurone da regioni specifiche del cervello e trapiantarli o homotopically o heterotopically nel cervello dei cuccioli postnatali.

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere i precursori degli interneuroni da regioni cerebrali distinte in cuccioli di topo postnatale e trapiantare queste cellule in riceventi di pari età per valutare come i cambiamenti ambientali influenzano il destino e la maturazione degli interneuroni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dello sviluppo su come i programmi genetici intrinseci e i segnali ambientali interagiscono per scolpire il destino delle cellule neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le alterazioni del destino e della maturazione dei precursori degli interneuroni possono essere analizzate dopo il loro trasferimento adottivo in un nuovo ambiente cerebrale.La dimostrazione visiva delle fasi di raccolta e innesto delle cellule è fondamentale perché piccoli errori nella tecnica possono portare a esperimenti di trapianto inefficienti e infruttuosi. Per iniziare, posiziona una lama di rasoio attraverso il lobo frontale anteriore di un cervello di cucciolo postnatale del primo giorno e ulteriori lame di rasoio nelle fessure appena dietro la prima lama di rasoio per generare due fette di 0,5 m

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JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Weber, R. Z., et al. Trapianto intracerebrale e tracciamento della bioluminescenza in vivo di cellule progenitrici neurali umane nel cervello di topo. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra il trapianto stereotassico di cellule progenitrici neurali umane (NPC) geneticamente modificate nel cervello del topo. I ricercatori iniettano NPC che esprimono luciferasi e proteine fluorescenti, consentendo l'imaging in bioluminescenza in vivo e la microscopia a fluorescenza post-mortem per studiare...

Trapianto di cellule progenitrici neurali umane nel cervello di topo

Questo video presenta un metodo per generare precursori di interneuroni corticali da cellule staminali embrionali di topo. Il protocollo prevede la coltura delle cellule staminali in terreni contenenti specifici inibitori di piccole molecole, che facilitano la proliferazione e l'aggregazione delle cellule staminali in corpi embrioidi (EB). Successivamente, gli EB vengono dissociati con enzimi e piastrati su pozzetti su piastre di coltura rivestite con proteine di adesione per promuovere la loro...

Generazione di precursori corticali di interneuroni da cellule staminali embrionali di topo

Fonte: Quattrocolo, G., et al. Trapianto omocronico di precursori di interneuroni in cervelli di topo postnatale precoce. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra il trapianto di cellule precursori degli interneuroni nel cervello di topo neonatale utilizzando un approccio omotopico o eterotopico. La procedura prevede l'ottenimento di un cucciolo ricevente anestetizzato, l'identificazione della regione cerebrale bersaglio e l'iniezione di una sospensione di cellule precursori derivate da un...

Trapianto di cellule precursori dell'interneurone nel cervello di un cucciolo di topo

Fonte: Gonzalez-Ramos, A., et. al., Trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topo postnatale precoce per mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di cellule precursori di interneuroni di derivazione umana nell'ippocampo di un cucciolo di topo geneticamente modificato con interneuroni inibitori ridotti, con l'obiettivo di ripristinare l'equilibrio eccitatorio-inibitorio.

Trapianto di cellule precursori di interneuroni di derivazione umana nell'ippocampo del cucciolo di topo

Fonte: Denaxa, M., el al., Trapianto di progenitori interneuronali corticali chemiogeneticamente modificati in cervelli di topo postnatali precoci. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per iniettare un vettore plasmidico che trasporta il gene di interesse nei progenitori degli interneuroni in una fetta di cervello embrionale, seguita dall'elettroporazione per l'ingresso nel plasmide e l'espressione genica. Questi progenitori modificati possono essere successivamente utilizzati...

Trasferimento genico assistito da elettroporazione incorporato in agarosio nei progenitori degli interneuroni corticali di topo

Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di corticale Interneurone progenitori e precursori post-mitotici Interneurone da cellule staminali embrionali di topo usando un metodo modificato embryoid corpo-a-monostrato. Questi progenitori/precursori possono essere usati in vitro o fluorescente ordinati e trapiantate nel neocortex neonatale per lo studio della determinazione di destino o usati in applicazioni terapeutiche.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

Qui presentiamo un protocollo, progettato per utilizzare strumenti chemiogenetici per manipolare l'attività dei progenitori interneuroni corticali trapiantati nella corteccia dei primi topi postnatali.

Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

Il trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti umane generati dalla programmazione neuronale potrebbe essere un potenziale approccio terapeutico per i disturbi dello sviluppo neurologico. Questo protocollo descrive la generazione e il trapianto di precursori neuronali GABAergici derivati da cellule staminali umane nel cervello di topi neonatali, consentendo l'indagine a lungo termine dei neuroni innestati e la valutazione del loro potenziale terapeutico.

Trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topo postnatale precoce per mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico

Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre

Scopri come isolare e trapiantare precursori di interneuroni da regioni cerebrali di cuccioli di topo neonati per studiare la maturazione neuronale. Questo metodo permette di analizzare l'adattamento cellulare in nuovi ambienti cerebrali.

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

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