Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere i precursori degli interneuroni da regioni cerebrali distinte in cuccioli di topo postnatale e trapiantare queste cellule in riceventi di pari età per valutare come i cambiamenti ambientali influenzano il destino e la maturazione degli interneuroni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dello sviluppo su come i programmi genetici intrinseci e i segnali ambientali interagiscono per scolpire il destino delle cellule neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le alterazioni del destino e della maturazione dei precursori degli interneuroni possono essere analizzate dopo il loro trasferimento adottivo in un nuovo ambiente cerebrale.

La dimostrazione visiva delle fasi di raccolta e innesto delle cellule è fondamentale perché piccoli errori nella tecnica possono portare a esperimenti di trapianto inefficienti e infruttuosi. Per iniziare, posiziona una lama di rasoio attraverso il lobo frontale anteriore di un cervello di cucciolo postnatale del primo giorno e ulteriori lame di rasoio nelle fessure appena dietro la prima lama di rasoio per generare due fette di 0,5 millimetri. Trasferire le fette striatali in una capsula di Petri con saccarosio a bolle di liquido cerebrospinale artificiale o sACSF e mettere il tessuto cerebrale rimanente in una capsula di Petri con sACSF su ghiaccio.

Metti le fette sotto un microscopio da dissezione e usa una pinza per pizzicare lo striato da entrambi gli emisferi, posizionando i pezzi striatali in un tubo da 50 millilitri di sACSF sul ghiaccio mentre vengono raccolti. Se il cervello è stato prelevato da un topo reporter fluorescente, utilizzare la microscopia a fluorescenza per distinguere il segnale striatale td-pomodoro dal segnale fluorescente più forte del globo pallido. Per rimuovere l'ippocampo, utilizzare una pinza per emisectare il cervello lungo la linea mediana e posizionare un emisfero sotto un microscopio da dissezione sulla superficie mediale verso l'alto.

Usa una pinza per rimuovere il tessuto cerebrale ventrale e identificare l'ippocampo a forma di salsiccia che si estende sull'accesso anteroposteriore lungo il lato dorsale e ventricolare della corteccia. Inserire le punte della pinza davanti all'ippocampo anteriore e far avanzare la pinza posteriormente mentre si pizzica lungo il bordo corticale dell'ippocampo per separare delicatamente l'ippocampo dalla corteccia. Posizionare il tessuto isolato in una provetta da 50 millilitri di sACSF su ghiaccio e ripetere il prelievo dell'ippocampo per l'emisfero controlaterale.

Quindi posiziona la corteccia emisectata con il lato mediale rivolto verso il basso e usa il forcipe per rimuovere le porzioni più dorsali, ventrali, anteriori e posteriori della corteccia. Trasferire il restante quadrato di corteccia mediale in una provetta da 50 millilitri di sACSF su ghiaccio. Dopo aver rimosso il cervello, fissare il lato ventrale del cervello verso il basso attraverso il cervelletto e la corteccia anteriore o i bulbi olfattivi.

Usando una pinza curva, separa delicatamente la corteccia posteriore dall'ippocampo sottostante e dagli altri tessuti in ciascun emisfero. E sbucciare la corteccia dorsale in avanti per esporre le strutture sottostanti. Usa una pinza per pizzicare l'ippocampo in un emisfero sulla linea mediana e rimuovi l'ippocampo staccandolo lateralmente dal cervello.

Posiziona l'ippocampo in una provetta da 50 millilitri di sACSF su ghiaccio e raccogli l'ippocampo controlaterale allo stesso modo. Quindi, raschiare delicatamente i bordi dello striato per allentarlo dal tessuto circostante. Pizzica delicatamente sotto lo striato per raccogliere il tessuto striatale.

Dopo aver prelevato la corteccia da entrambi gli emisferi, come precedentemente dimostrato, trasferire lo striato sotto un cannocchiale da dissezione fluorescente. Usa il forcipe per rimuovere qualsiasi tessuto globus pallidus positivo al pomodoro td-tomato rosso vivo da ogni striato. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, trasferire il tessuto in una provetta a fondo tondo da cinque millimetri e sostituire il sACSF in ciascuna provetta di raccolta con due millilitri di soluzione di pronasi-sACSF appena preparata per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente con movimenti occasionali.

Al termine dell'incubazione, sostituire accuratamente la pronasi-sACSF con uno o due millilitri di soluzione di ricostituzione e dissociare meccanicamente i tessuti con tubi di Pasteur lucidati a fuoco. Quando il tessuto è torbido e non sono visibili pezzi di tessuto, filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro da 50 micron in nuove provette a fondo tondo da cinque millilitri per rimuovere eventuali grumi di cellule prima della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Dopo aver ricevuto le cellule dalla citometria a flusso, trasferire le sospensioni cellulari in provette coniche da 1,5 millilitri per la centrifugazione.

Dopo la centrifugazione, aspirare tutti i microlitri di surnatante da ciascuna provetta tranne gli ultimi 20 microlitri e ricostituire i pellet per il conteggio. Se necessario, diluire la soluzione cellulare con sACSF a una concentrazione da una a tre volte da 10 a 5 cellule per microlitro. Caricare una micropipetta a punta fine con olio minerale.

Collegare la micropipetta a un iniettore di nanolitri e fissare l'apparecchio per l'iniezione di nanolitri a un manipolatore collegato a una base magnetica. Mentre il primo cucciolo viene anestetizzato con ghiaccio, pipettare più volte la soluzione cellulare per garantire una distribuzione cellulare omogenea. Espellere l'olio minerale e riempire completamente la pipetta con la sospensione a cella singola.

Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, posizionare il cucciolo su un coperchio per piastre di Petri con la testa appoggiata su stucco adesivo, in modo che la parte superiore della testa sia relativamente piatta. Copri la testa con un pezzo di nastro adesivo da laboratorio con un foro diamantato, tirando il nastro teso fino a quando la pelle non è tesa in modo che la testa sia saldamente fissata e la lambda sia visibile attraverso il foro. Spostare il cucciolo fissato sotto l'iniettore di nanolitri e abbassare la micropipetta in modo che la punta sia direttamente sopra lambda.

Osservare le coordinate X, Y sul manipolatore e regolare le manopole del manipolatore fino a quando la micropipetta non è posizionata alle coordinate appropriate lungo gli assi mediale, laterale e anteroposteriore della testa. Abbassare la micropipetta fino a quando la punta crea una piccola concavità sulla pelle e ruotare la manopola del manipolatore dell'asse z con decisione ma delicatamente per guidare la micropipetta attraverso la pelle e il cranio nel cervello. Ritrarre leggermente la micropipetta fino a quando la punta non è circondata da un cono di pelle a forma di tenda.

E visualizza le coordinate lungo l'asse z. Quindi abbassare la micropipetta alla profondità sperimentale appropriata e iniettare le cellule. Attendere 15 secondi dopo la somministrazione delle cellule prima di ritrarre la micropipetta e ripetere l'iniezione in una seconda posizione, se lo si desidera.

Posiziona il cucciolo su un termoforo e monitoralo fino al completo recupero prima di trasferirlo di nuovo nella gabbia di casa. Le cellule trapiantate migrano in tutte le regioni cerebrali bersaglio con tassi di sopravvivenza cellulare variabili che vanno da decine a diverse migliaia. Le cellule innestate si localizzano all'interno delle regioni appropriate con molte cellule che mostrano morfologie interneuronali e marcatori neurochimici interneuronali ben caratterizzati.

Le cellule del donatore sopravvivono e maturano anche quando vengono innestate in nuovi ambienti con trapianti eterotopici. L'analisi elettrofisiologica delle cellule trapiantate rivela proprietà fisiologiche simili a quelle di un adulto e modelli di attivazione distinti, rappresentativi di sottotipi di interneuroni ben definiti, suggerendo che gli interneuroni innestati sono in grado di maturare correttamente nell'ambiente ospite. Le cellule trapiantate mostrano anche correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee.

La registrazione da cellule piramidali adiacenti agli interneuroni trapiantati che esprimono la canalrodopsina-2 rivela correnti GABAergiche postsinaptiche che sono evocate dalla luce blu in queste cellule piramidali endogene. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le cellule sul ghiaccio e triturare delicatamente le cellule con una pipetta Pasteur per ridurre al minimo la morte cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento di singole cellule, sulle cellule innestate per definire in modo più completo il modo in cui i cambiamenti ambientali influenzano il trascrittoma di una cellula.

Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare i precursori degli interneuroni da diverse regioni del cervello di cuccioli neonati e trapiantare queste cellule in varie regioni del cervello di cuccioli postnatali di pari età.