Name: Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Scopri come isolare e trapiantare precursori di interneuroni da regioni cerebrali di cuccioli di topo neonati per studiare la maturazione neuronale. Questo metodo permette di analizzare l'adattamento cellulare in nuovi ambienti cerebrali.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (K99MH104595) e il programma di ricerca intramurale NICHD a T.J.P. Ringraziamo Gord Fishell, nel cui laboratorio questo approccio originalmente è stato stabilito.

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<li>Larimer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+Ganglionic+Eminence+Precursor+Transplants+Disperse+and+Integrate+as+Lineage-Specific+Interneurons+but+Do+Not+Induce+Cortical+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity.</a> Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).</li>
<li>Martinez-Cerdeno, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+MGE+precursor+cells+grafted+into+adult+rat+striatum+integrate+and+ameliorate+motor+symptoms+in+6-OHDA-lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).</li>
<li>Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+Transplantations+Reveal+Environmental+Influences+on+Interneuron+Diversity+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation.</a> Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).</li>
<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un aspetto critico di questo protocollo è massimizzare le possibilità di sopravvivenza delle cellule. Garantire che i tessuti e le cellule siano sempre in ghiaccio freddo carboxygenated sACSF è necessario promuovere la sopravvivenza delle cellule. Ciò richiede una strategia di dissociazione per ridurre al minimo la lunghezza del tempo che le cellule spendono in varie soluzione e all'esterno dell'ambiente di cervello e di dissezione efficiente. A seconda del numero di regioni del cervello essere sezionato e trapiantato, p...

La funzione corticale appropriata richiede un equilibrio tra neuroni di proiezione eccitatori e inibitori GABAergici, una popolazione estremamente eterogenea con morfologie distinte, proprietà elettrofisiologiche, connettività e neurochimici marcatori. Sviluppo anormale e funzione di interneuroni (e sottogruppi specifici Interneurone) è stato collegato a pathobiology di disturbi psichiatrici come la schizofrenia, autismo ed epilessia1,2,3. Inoltre, molti geni implicati in questi disordini del cervello sono fortemente arricchiti in interneuroni giovane4. Così, una maggiore comprensione dei meccanismi che regolano la maturazione e la determinazione di destino Interneurone è necessaria per comprendere lo sviluppo normale e potenziali eziologie delle numerose malattie del cervello.
Interneuroni del forebrain nascono principalmente da due strutture embrionali transitorie, le eminenze gangliare mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente). Queste cellule postmitotic (precursori Interneurone) quindi subire una fase prolungata migrazione tangenziale per disperdere tutto il telencefalo dove si integrano in una vasta gamma di circuiti. Interneuroni MGE-derivati sono costituiti da tre sottogruppi in gran parte non sovrapposte, neurochemically definiti: veloce chiodare interneuroni parvalbumina (PV+), non-fast chiodare interneuroni della somatostatina (SST+) e tardi chiodare un neurone nitrico interneuroni ossido di sintetasi (nNOS+) che costituiscono le cellule hippocampal di neurogliaform ed edera. Numerosi laboratori hanno identificato parecchi meccanismi all'interno di MGE che regolano le decisioni iniziali destino in PV+ o SST + interneuroni, compresi gradienti spaziali di morfogeni, data di nascita dei precursori Interneurone e la modalità di divisione neurogena 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. è stato proposto che interneuroni inizialmente differenziano in 'Cardinale classi' e poi progressivamente maturano in 'definitive classi' come essi interagiscono con il loro ambiente11. La prova recente indica che alcuni sottotipi di Interneurone maturo possono essere geneticamente hardwired come queste cellule diventano postmitotic in eminenze gangliare, che indica che presto definiti programmi genetici intrinseci possono svolgere un ruolo più importante rispetto al passato apprezzata12,13. Tuttavia, la questione chiave di come l'intrinseci programmi genetici interagiscono con stimoli ambientali alla differenziazione di unità in sottotipi distinti Interneurone rimane in gran parte inesplorata.
Numerosi studi sono trapiantate cellule embrionali MGE direttamente in una varietà di regioni del cervello, con i risultati di consenso che innestano le cellule maturo e il rilascio di GABA per inibire generalmente il locale circuiti endogeni14,15, 16,17,18,19. Queste promettenti osservazioni hanno generato notevole interesse nell'utilizzo di cellule staminali umane pluripotenti indotte (hIPSC)-derivato interneuroni per trattare una varietà di malattie del cervello. Tuttavia, molto pochi di questi studi valutare se queste cellule innestate maturano in tipi previsti di interneuroni maturi, un componente critico quando uno pensa di approcci traslazionali.
Per affrontare come ambiente influenza la Interneurone differenziazione e maturazione, una strategia è stata ideata per trapiantare precursori immaturi Interneurone in nuovi ambienti di cervello al fine di esaminare se innestate interneuroni adottano funzionalità dell'host ambiente o conservano le caratteristiche del donatore ambiente20. MGE trapianti non sono adatti per affrontare questa domanda perché il MGE contiene una popolazione mista di Interneurone e cellule di proiezione GABAergici che disperdono nel corso di numerose regioni di cervello21. Senza sapere dove queste cellule MGE avrebbero migrato, uno non può pienamente valutare come questi trapianti sono colpiti dall'ambiente del cervello. Raccogliendo i precursori Interneurone timepoints postnatale precoce, questo problema è aggirato con l'ottenimento di cellule immature che hanno completato la loro migrazione e raggiunto la loro destinazione regione del cervello, ma hanno un'interazione minima con l'ambiente. Focalizzando l'attenzione sulle specifiche caratteristiche di interneuroni che sono differenzialmente espressi tra regioni distinte del cervello, si può quindi determinare come l'ambiente host cambia proprietà Interneurone. L'approccio generale descritto in questo protocollo dovrebbe essere applicabile a qualsiasi investigatore che vuole esaminare come i giovani neuroni si comportano quando ha sfidato in un nuovo ambiente.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Matrici cerebrali</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>Necessario solo se si raccoglie lo striato</td></tr><tr><td>Punta fine Dumont Pinze</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per microdissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore manuale con supporto</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 5 ml a fondo tondo in plastica</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 60 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 100 mm</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Filtri DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Tripano blu</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

homochronic trapianto di precursori interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Maturazione e la determinazione di destino neuronale richiede un gioco intricato tra programmi genetici e segnali ambientali. Tuttavia, districare i ruoli di intrinseca vs estrinseche meccanismi che regolano questo processo di differenziazione è un enigma per tutti i neurobiologi inerente allo sviluppo. Questo problema è amplificato per interneuroni GABAergici, una popolazione incredibilmente eterogenee delle cellule che è nato da strutture embrionali transitorie e sottoposti a una prolungata fase migratoria per disperdere tutto il telencefalo. Per esplorare come i diversi ambienti di cervello influenzano interneurone destino e maturazione, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta dei precursori Interneurone immaturo fluorescente contrassegnati da regioni specifiche del cervello in topi neonati (P0-P2). A questa età, migrazione Interneurone è quasi completa e queste cellule risiedono nei loro ambienti di riposo finale con relativamente poca integrazione sinaptica. Dopo il prelievo delle soluzioni di singola cellula tramite citometria a flusso, questi precursori Interneurone sono trapiantati in P0-P2 wildtype postnatali cuccioli. Eseguendo entrambi omotope (per esempio, corteccia di corteccia) o eterotopica (ad es., corteccia di ippocampo) trapianti, si può valutare come impegnativo immaturi interneuroni in nuovi ambienti di cervello colpisce il loro destino, la maturazione e l'integrazione di circuito. Cervelli possono essere raccolte in topi adulti e analizzati con una vasta gamma di analisi posthoc su cellule innestate, compreso immunohistochemical, elettrofisiologici e transcriptional profiling. Questo approccio generale fornisce gli investigatori con una strategia di test come distinti ambienti di cervello possono influenzare numerosi aspetti dello sviluppo del neurone e identificare se caratteristiche specifiche di un neurone sono principalmente guidate da programmi genetici hardwired o stimoli ambientali.

Questo protocollo viene illustrato come raccogliere regioni specifiche del cervello dal cervello postnatale precoce (Figura 1-2), raccogliere dissociazioni singola cella dei precursori Interneurone e trapianto di queste cellule in varie regioni del cervello in ingenuo WT cuccioli postnatali (Figura 3). Per l'analisi posthoc, cervelli che hanno ricevuto gli innesti Interneurone precursore sono state raccolte tra P...

Sfidando i neuroni giovani in nuove regioni del cervello possa rivelare importanti intuizioni come l'ambiente scolpisce maturazione e destino neuronale. Questo protocollo descrive una procedura per raccogliere precursori Interneurone da regioni specifiche del cervello e trapiantarli o homotopically o heterotopically nel cervello dei cuccioli postnatali.

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere i precursori degli interneuroni da regioni cerebrali distinte in cuccioli di topo postnatale e trapiantare queste cellule in riceventi di pari età per valutare come i cambiamenti ambientali influenzano il destino e la maturazione degli interneuroni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dello sviluppo su come i programmi genetici intrinseci e i segnali ambientali interagiscono per scolpire il destino delle cellule neurali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le alterazioni del destino e della maturazione dei precursori degli interneuroni possono essere analizzate dopo il loro trasferimento adottivo in un nuovo ambiente cerebrale.La dimostrazione visiva delle fasi di raccolta e innesto delle cellule è fondamentale perché piccoli errori nella tecnica possono portare a esperimenti di trapianto inefficienti e infruttuosi. Per iniziare, posiziona una lama di rasoio attraverso il lobo frontale anteriore di un cervello di cucciolo postnatale del primo giorno e ulteriori lame di rasoio nelle fessure appena dietro la prima lama di rasoio per generare due fette di 0,5 millimetri. Trasferire le fette striatali in una capsula di Petri con saccarosio a bolle di liquido cerebrospinale artificiale o sACSF e mettere il tessuto cerebrale rimanente in una capsula di Petri con sACSF su ghiaccio.Metti le fette sotto un microscopio da dissezione e usa una pinza per pizzicare lo striato da entrambi gli emisferi, posizionando i pezzi striatali in un tubo da 50 millilitri di sACSF sul ghiaccio mentre vengono raccolti. Se il cervello è stato prelevato da un topo reporter fluorescente, utilizzare la microscopia a fluorescenza per distinguere il segnale striatale td-pomodoro dal segnale fluorescente più forte del globo pallido. Per rimuovere l'ippocampo, utilizzare una pinza per emisectare il cervello lungo la linea mediana e posizionare un emisfero sotto un microscopio da dissezione sulla superficie mediale verso l'alto.Usa una pinza per rimuovere il tessuto cerebrale ventrale e identificare l'ippocampo a forma di salsiccia che si estende sull'accesso anteroposteriore lungo il lato dorsale e ventricolare della corteccia. Inserire le punte della pinza davanti all'ippocampo anteriore e far avanzare la pinza posteriormente mentre si pizzica lungo il bordo corticale dell'ippocampo per separare delicatamente l'ippocampo dalla corteccia. Posizionare il tessuto isolato in una provetta da 50 millilitri di sACSF su ghiaccio e ripetere il prelievo dell'ippocampo per l'emisfero controlaterale.Quindi posiziona la corteccia emisectata con il lato mediale rivolto verso il basso e usa il forcipe per rimuovere le porzioni più dorsali, ventrali, anteriori e posteriori della corteccia. Trasferire il restante quadrato di corteccia mediale in una provetta da 50 millilitri di sACSF su ghiaccio. Dopo aver rimosso il cervello, fissare il lato ventrale del cervello verso il basso attraverso il cervelletto e la corteccia anteriore o i bulbi olfattivi.Usando una pinza curva, separa delicatamente la corteccia posteriore dall'ippocampo sottostante e dagli altri tessuti in ciascun emisfero. E sbucciare la corteccia dorsale in avanti per esporre le strutture sottostanti. Usa una pinza per pizzicare l'ippocampo in un emisfero sulla linea mediana e rimuovi l'ippocampo staccandolo lateralmente dal cervello.Posiziona l'ippocampo in una provetta da 50 millilitri di sACSF su ghiaccio e raccogli l'ippocampo controlaterale allo stesso modo. Quindi, raschiare delicatamente i bordi dello striato per allentarlo dal tessuto circostante. Pizzica delicatamente sotto lo striato per raccogliere il tessuto striatale.Dopo aver prelevato la corteccia da entrambi gli emisferi, come precedentemente dimostrato, trasferire lo striato sotto un cannocchiale da dissezione fluorescente. Usa il forcipe per rimuovere qualsiasi tessuto globus pallidus positivo al pomodoro td-tomato rosso vivo da ogni striato. Quando tutti i tessuti sono stati raccolti, trasferire il tessuto in una provetta a fondo tondo da cinque millimetri e sostituire il sACSF in ciascuna provetta di raccolta con due millilitri di soluzione di pronasi-sACSF appena preparata per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente con movimenti occasionali.Al termine dell'incubazione, sostituire accuratamente la pronasi-sACSF con uno o due millilitri di soluzione di ricostituzione e dissociare meccanicamente i tessuti con tubi di Pasteur lucidati a fuoco. Quando il tessuto è torbido e non sono visibili pezzi di tessuto, filtrare la soluzione cellulare attraverso un filtro da 50 micron in nuove provette a fondo tondo da cinque millilitri per rimuovere eventuali grumi di cellule prima della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Dopo aver ricevuto le cellule dalla citometria a flusso, trasferire le sospensioni cellulari in provette coniche da 1,5 millilitri per la centrifugazione.Dopo la centrifugazione, aspirare tutti i microlitri di surnatante da ciascuna provetta tranne gli ultimi 20 microlitri e ricostituire i pellet per il conteggio. Se necessario, diluire la soluzione cellulare con sACSF a una concentrazione da una a tre volte da 10 a 5 cellule per microlitro. Caricare una micropipetta a punta fine con olio minerale.Collegare la micropipetta a un iniettore di nanolitri e fissare l'apparecchio per l'iniezione di nanolitri a un manipolatore collegato a una base magnetica. Mentre il primo cucciolo viene anestetizzato con ghiaccio, pipettare più volte la soluzione cellulare per garantire una distribuzione cellulare omogenea. Espellere l'olio minerale e riempire completamente la pipetta con la sospensione a cella singola.Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, posizionare il cucciolo su un coperchio per piastre di Petri con la testa appoggiata su stucco adesivo, in modo che la parte superiore della testa sia relativamente piatta. Copri la testa con un pezzo di nastro adesivo da laboratorio con un foro diamantato, tirando il nastro teso fino a quando la pelle non è tesa in modo che la testa sia saldamente fissata e la lambda sia visibile attraverso il foro. Spostare il cucciolo fissato sotto l'iniettore di nanolitri e abbassare la micropipetta in modo che la punta sia direttamente sopra lambda.Osservare le coordinate X, Y sul manipolatore e regolare le manopole del manipolatore fino a quando la micropipetta non è posizionata alle coordinate appropriate lungo gli assi mediale, laterale e anteroposteriore della testa. Abbassare la micropipetta fino a quando la punta crea una piccola concavità sulla pelle e ruotare la manopola del manipolatore dell'asse z con decisione ma delicatamente per guidare la micropipetta attraverso la pelle e il cranio nel cervello. Ritrarre leggermente la micropipetta fino a quando la punta non è circondata da un cono di pelle a forma di tenda.E visualizza le coordinate lungo l'asse z. Quindi abbassare la micropipetta alla profondità sperimentale appropriata e iniettare le cellule. Attendere 15 secondi dopo la somministrazione delle cellule prima di ritrarre la micropipetta e ripetere l'iniezione in una seconda posizione, se lo si desidera.Posiziona il cucciolo su un termoforo e monitoralo fino al completo recupero prima di trasferirlo di nuovo nella gabbia di casa. Le cellule trapiantate migrano in tutte le regioni cerebrali bersaglio con tassi di sopravvivenza cellulare variabili che vanno da decine a diverse migliaia. Le cellule innestate si localizzano all'interno delle regioni appropriate con molte cellule che mostrano morfologie interneuronali e marcatori neurochimici interneuronali ben caratterizzati.Le cellule del donatore sopravvivono e maturano anche quando vengono innestate in nuovi ambienti con trapianti eterotopici. L'analisi elettrofisiologica delle cellule trapiantate rivela proprietà fisiologiche simili a quelle di un adulto e modelli di attivazione distinti, rappresentativi di sottotipi di interneuroni ben definiti, suggerendo che gli interneuroni innestati sono in grado di maturare correttamente nell'ambiente ospite. Le cellule trapiantate mostrano anche correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee.La registrazione da cellule piramidali adiacenti agli interneuroni trapiantati che esprimono la canalrodopsina-2 rivela correnti GABAergiche postsinaptiche che sono evocate dalla luce blu in queste cellule piramidali endogene. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere le cellule sul ghiaccio e triturare delicatamente le cellule con una pipetta Pasteur per ridurre al minimo la morte cellulare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il sequenziamento di singole cellule, sulle cellule innestate per definire in modo più completo il modo in cui i cambiamenti ambientali influenzano il trascrittoma di una cellula.Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di isolare i precursori degli interneuroni da diverse regioni del cervello di cuccioli neonati e trapiantare queste cellule in varie regioni del cervello di cuccioli postnatali di pari età.

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Neuroscienze

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