Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre
1 agosto 2011
Un In vivo per testare la funzione del gene nel cervello postnatale è descritto. AAVs ricombinanti che esprimono Cre e / o di una proteina fluorescente vengono iniettate nel cervello di topo neonatale. L'inattivazione del gene mosaico e rada etichettatura neuronali siano raggiunti, consentono una rapida analisi della funzione del gene nei processi critici per lo sviluppo del circuito neurale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di manipolare la funzione genica durante il periodo postnatale dello sviluppo cerebrale. Ciò si ottiene selezionando e preparando prima i virus appropriati, caricandoli nella siringa e preparando l'attrezzatura per l'iniezione. Quindi il virus viene iniettato nel cervello dei cuccioli di topo appena nati e il passaggio finale consiste nel sacrificare gli animali e visualizzare le regioni iniettate.
In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la marcatura differenziale delle cellule di controllo e knockout attraverso la microscopia a immunofluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come il periodo dello sviluppo postnatale è geneticamente regolato. Per l'iniezione, una soluzione di virus adeno-associato disponibile in commercio può essere utilizzata a titolo completo, in genere da 10 a 12, copie del genoma per millilitro per manipolare un gran numero di cellule.
Se si desidera una diluizione rada o un'etichettatura, iniziare con una diluizione da uno a 10. Dopo aver scongelato il virus con ghiaccio, trasferire immediatamente il volume di pre-diluizione in una provetta sterile per PCR da 250 microlitri. Mantenere la diluizione in ghiaccio. Ora.
Preparare la pompa di iniezione selezionando una siringa appropriata e collegandola a un ago di caricamento. Successivamente, aspirare delicatamente la soluzione virale fino a quando non si vede una bolla d'aria molto piccola nella siringa e può essere utilizzato un colorante a caricamento inerte per facilitare questo passaggio. Ora fissa la siringa alla pompa con un fermo.
Quindi collegare delicatamente il tubo di collegamento tra la siringa e il supporto dell'ago. Assicurarsi che l'ago per iniezione sia a diretto contatto con il tubo di collegamento all'interno del supporto dell'ago. Ora, muovi lentamente la soluzione attraverso il tubo connettivo fino a quando una piccola goccia di soluzione è visibile sulla punta dell'ago.
Fissare con cura lo stantuffo accanto al blocco spintore con una staffa sulla pompa. Impostare la velocità di iniezione su otto microlitri al minuto e impostare il volume di iniezione su un valore compreso tra uno e due microlitri. Quindi regolare l'impostazione del diametro della siringa della pompa in modo che corrisponda al diametro della siringa che si sta utilizzando.
Infine, per proteggere i cuccioli durante la fase di recupero, impostate la piastra riscaldante a 38 gradi Celsius e copritela con un tovagliolo di carta. Utilizzando un protocollo approvato dall'IACUC, preparare i cuccioli di topo P zero o P uno per l'iniezione sottoponendoli ad anestesia fredda. Inumidisci alcuni tovaglioli di carta con acqua e mettili sul ghiaccio.
Quindi posizionare quattro o cinque cuccioli sul tovagliolo di carta ben separati. Piega i tovaglioli di carta sui cuccioli, posiziona delicatamente una piccola quantità di ghiaccio tritato sopra i tovaglioli di carta e incuba i cuccioli per circa cinque minuti. I cuccioli possono essere tenuti in sicurezza sul ghiaccio per un massimo di 15 minuti e hanno comunque un buon recupero.
Ora posiziona un cucciolo anestetizzato su un blocco di montaggio per un migliore accesso al sito di iniezione. La corteccia, ad esempio, è più facilmente accessibile sdraiando l'animale sulla pancia. Il cucciolo può essere fissato in posizione usando un cerotto, stabilizzare manualmente la testa del cucciolo e tirare forte la pelle per impedirgli di muoversi.
Quindi naviga tra i punti di riferimento anatomici del cranio come la sutura lambda e seleziona un punto di iniezione riproducibile con l'altra mano, inserisci delicatamente l'ago attraverso il cranio. Non spingere con forza se l'ago non penetra facilmente nel cranio. Invece, riposiziona l'ago e riprova delicatamente.
La profondità di iniezione varia leggermente tra i singoli animali e ceppi per la corteccia, da mezzo a un millimetro di profondità di solito funziona. Ora, inietta la soluzione virale facendo attivare la pompa a un collega per ridurre al minimo i movimenti della mano. Idealmente, si potrebbe utilizzare un pedale per avviare la pompa dopo l'iniezione.
Tieni l'ago in posizione per alcuni secondi, quindi mantieni la testa del cucciolo ferma senza intoppi. Far scorrere l'ago verso l'esterno. Ora, lascia che il cucciolo si riprenda per cinque-10 minuti sulla piastra calda coperta.
Durante questo periodo, continua a iniettare altri cuccioli. Quando i cuccioli hanno riacquistato il loro colore rosa e si muovono, strofinali delicatamente con una parte della loro lettiera domestica. Solo allora potranno essere restituiti alla madre.
Altrimenti, potrebbero essere trattati come cuccioli sconosciuti, che la madre molto probabilmente ucciderebbe dopo che i cuccioli sono stati restituiti alla madre. Pulire la configurazione di iniezione caricando completamente la siringa con acetone o etanolo al 70%. Se sono in uso componenti sensibili all'acetone come sano, acrate, adesivi, lavare la soluzione attraverso la configurazione di iniezione più volte utilizzando ogni volta una soluzione fresca.
Questo rimuoverà qualsiasi soluzione virale rimanente e precipiterà i solventi evaporeranno. Dopo aver risciacquato l'installazione, disinfettare l'area di lavoro della candeggina per lasciarla pronta per il prossimo sperimentatore. Mentore. Una tecnica di successo produce una robusta infezione neuronale nel sito di iniezione.
Le iniezioni in regioni specifiche come la corteccia e il collicolo superiore generano tipicamente infezioni locali con una diffusione minima alle regioni adiacenti. L'uso di una soluzione virale ad alto titolo rende più probabile l'infezione delle aree adiacenti come l'ippocampo, l'iniezione con una soluzione virale a basso titolo. Provoca un'infezione sparsa tipicamente vicino al sito di iniezione come l'iniezione cerebellare sulla linea mediana, il numero di cellule infette dovrebbe essere correlato a un titolo della soluzione virale iniettata.
Ad esempio, l'iniezione di una miscela di soluzioni ad alto titolo di due virus R AAV otto che esprimono diverse proteine fluorescenti nel cervelletto, infetta molte cellule kinji che sono marcate in modo differenziato. Al contrario, l'iniezione di una soluzione virale a basso titolo può provocare un'infezione sparsa per aiutare a visualizzare le singole cellule. I neuroni marcati in fluorescenza possono essere osservati direttamente nel tessuto vivo appena tagliato, oppure possono essere sottoposti a colorazione immunologica.
Ciò migliora i segnali fluorescenti endogeni per la successiva acquisizione di immagini mediante microscopia a campo largo o fluorescente confocale. Infine, RAAV 8 è in grado di infettare una varietà di tipi di neuroni nella corteccia con una forte marcatura dei processi fini Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti se eseguita correttamente.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo in vivo per testare la funzione genica durante lo sviluppo cerebrale postnatale utilizzando AAV ricombinanti. Iniettando questi virus nei cervelli di topi neonatali, i ricercatori possono ottenere l'inattivazione genica mosaica e l'etichettatura neuronale sparsa, facilitando l'analisi della funzione genica nello sviluppo dei circuiti neurali.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Funzione genica
- Sviluppo dei circuiti neurali
Sfondo
- Comprendere la funzione genica durante lo sviluppo cerebrale postnatale è cruciale.
- Gli AAV ricombinanti possono essere utilizzati per manipolare l'espressione genica.
- Questo metodo permette lo studio della regolazione genetica durante i periodi critici di sviluppo.
- La microscopia immunofluorescente può differenziare tra cellule di controllo e cellule knockout.
Obiettivo dello studio
- Manipolare la funzione genica nel periodo postnatale dello sviluppo cerebrale.
- Investigare come i fattori genetici regolano lo sviluppo neurale postnatale.
- Fornire informazioni sui meccanismi alla base della formazione dei circuiti neurali.
Metodi utilizzati
- Seleziona e preparazione di AAV ricombinanti appropriati.
- Iniezione di virus nei cervelli di cuccioli di topo neonatali.
- Microscopia immunofluorescente per l'imaging delle regioni iniettate.
- Analisi dell'etichettatura differenziale di cellule di controllo e knockout.
Risultati principali
- Inattivazione genica e etichettatura neuronale con successo ottenute.
- I risultati dimostrano la regolazione genetica dello sviluppo postnatale.
- Il metodo fornisce un quadro per la futura ricerca in neuroscienza.
- Le intuizioni acquisite possono informare la comprensione della dinamica dei circuiti neurali.
Conclusioni
- Questo metodo è efficace per studiare la funzione genica nel cervello in via di sviluppo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dello sviluppo dei circuiti neurali.
- La ricerca futura può basarsi su questo approccio per esplorare le influenze genetiche sul comportamento.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, scalable interrogation of gene function in postnatal brain development, addressing a critical gap in target validation for neurodevelopmental disorders. By bypassing embryonic lethality constraints, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in pathways relevant to autism and schizophrenia. The approach provides predictive confidence in target selection by linking genetic perturbation to circuit-level phenotypes in a physiologically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in postnatal neural circuits where many neurodevelopmental disorder genes exert their effects.
- Operational Value: Achieves mosaic gene inactivation and sparse labeling within days, avoiding months-long conditional mouse model generation.
- Scientific Value: Supports cell-autonomous functional analysis of genes implicated in axonal growth, dendritic tiling, and synapse refinement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable control and knockout cell populations via differential fluorescent labeling for side-by-side phenotypic assessment.
- Operational Value: Permits titration of viral titer to modulate infection density, enabling scalable sparse or dense labeling as needed for downstream assays.
- Scientific Value: Compatible with immunofluorescence and electrophysiology readouts, facilitating multimodal validation of target engagement and circuit impact.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models postnatal genetic perturbation in mice and rats, aligning with the developmental timing of human neuropsychiatric disorder onset.
- Operational Value: Extends to lentiviral delivery and shRNA/dominant-negative constructs, broadening target modulation toolkit for preclinical validation.
- Scientific Value: Enables study of gene function in critical processes like synapse formation, directly relevant to pathophysiological mechanisms in psychiatric disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing causal genetic evidence in postnatal neural circuits prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by deleting candidate genes in defined brain regions to assess phenotypic consequences on neural circuit maturation.
- Screening: Produces standardized, reproducible neuronal preparations with internal controls (labeled vs. unlabeled cells) for reliable compound effect measurement.
- Analytics: Generates quantitative imaging and electrophysiology readouts that enable statistical comparison of genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to circuit-level outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral delivery platform applicable across multiple gene targets and brain regions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking postnatal gene loss to specific circuit phenotypes.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation via viral delivery, improving reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly establishing genetic causality in disease-relevant postnatal windows.
- Portfolio Impact: De-risks target advancement by providing functional evidence in systems that model human neurodevelopmental timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and viral biosafety protocols.
- Dependent on access to purified recombinant AAV or lentiviral vectors and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of viral titer, injection volume, and anesthesia procedures for cross-study consistency.
- Adaptation to different brain regions or species may require optimization of injection coordinates and viral serotype tropism.
- Practical limitation: Efficacy depends on Cre recombinase efficiency and floxed allele availability, which may vary across targets.
