Name: Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri come manipolare la funzione genica durante lo sviluppo cerebrale postnatale nei topi mediante iniezione di virus AAV ricombinanti. Questo metodo consente l'inattivazione genica mosaicata e l'etichettatura neuronale sparsa per studiare la formazione dei circuiti neurali.

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Questo lavoro è finanziato da una sovvenzione RO1 dal NIH (NINDS).

1. Virus preparazione iniettabile <ol><li> rAAVs sono stati acquistati dal produttore raccomanda commerciale, ma possono anche essere prodotta nel proprio laboratorio proprio (vedi discussione sotto). La soluzione del virus è tipicamente prodotta in un titolo di ~ 1x10 12 copie per millilitro genoma (GC / ml) e può essere utilizzato a pieno titolo a manipolare un gran numero di cellule. In alternativa, possono essere diluiti per produrre il livello desiderato di etichettatura sparse. La diluizione appropriata deve essere determinata dall'utente, ma una diluizione 1:10 si raccomanda di iniziare. </li><li> Disgelo virus sul ghiaccio immediatamente prima dell'uso. Trasferire il desiderato pre-diluizione volume di soluzione antivirus in un piccolo (~ 250μl) tubo PCR. Diluire la soluzione antivirus con un volume adeguato di DPBS sterile in una cappa di coltura di tessuti. Conservare soluzione diluita virus sul ghiaccio fino a quando non è necessario. </li></ol> NOTA: la gestione di tutti i virus devono essere svolte secondo un protocollo di biosicurezza approvati dal vostro istituto 2. Siringa di carico e attrezzature di assemblaggio <ol><li> Collegare l'ago di carico alla siringa di vetro e di elaborare la soluzione virus dal tubo di PCR tirando delicatamente lo stantuffo. Tirare lo stantuffo fino a una bolla d'aria molto piccolo può essere visto nella siringa, questo indica che tutta la soluzione è nella siringa e non è lasciata in carico l'ago. In alternativa, una piccola quantità di colorante inerte può essere aggiunto alla soluzione per renderlo visibile. NOTA: Un piccolo tubo PCR dovrebbe essere usato come l'ago di carico non è in genere abbastanza a lungo per raggiungere il fondo della maggior parte degli altri tubi. </li><li> Rimuovere l'ago di carico e posizionare la siringa sul blocco siringa di una pompa a siringa, fissandolo con il fermo della siringa. </li><li> Inserire delicatamente un'estremità del tubo connettivo nella siringa, inserire l'altra estremità nella porta aghi. Inserire l'ago per l'iniezione nel supporto ago. La fine dell'ago iniezione deve rivolgersi direttamente alla fine della parte interna tubi connettivo del titolare ago. </li><li> Premere lentamente lo stantuffo per spingere manualmente la soluzione attraverso il tubo connettivo. Spingere fino a quando una piccola goccia di soluzione è visibile sulla punta dell'ago iniezione. </li><li> Con attenzione la posizione del pistone accanto al blocco spintore e fissarlo in posizione con la staffa blocco spintore. </li><li> Impostare i parametri di iniezione: velocità di iniezione deve essere di circa 8μl/min (~ 130nl / s), volume di iniezione è di solito 1-2ul, selezionare il diametro appropriata siringa per le dimensioni della siringa in uso (vedi il manuale di pompa a siringa per le linee guida). </li><li> Impostare il piano di cottura a ~ 38 ° C e coprire con un tovagliolo di carta o altro sottile barriera per proteggere i cuccioli durante la fase di recupero. </li></ol> 3. Procedura di iniezione e il recupero dei cuccioli <ol><li> Preparare P0 e P1 cuccioli di topo per iniezione sottoponendoli a freddo anestesia da un protocollo IACUC approvato. Inumidire un paio di asciugamani di carta con acqua e posto sul ghiaccio. Mettere il numero desiderato di cuccioli (4-5) sul tovagliolo di carta (tenerli ben separati) e delicatamente piegare i tovaglioli di carta sopra i cuccioli in modo che siano coperti da un tovagliolo di carta umido. Posizionare delicatamente una piccola quantità di ghiaccio tritato in cima alla tovaglioli di carta e incubare i cuccioli per circa 5 minuti. I cuccioli possono essere tenuti in ghiaccio per un massimo di 15 minuti e recuperare bene dopo. </li><li> Dopo che il cucciolo è sufficientemente anestetizzati, è posto su un blocco di montaggio (si usa un blocco di polistirolo che normalmente contiene 15ml tubi) e la posizione che per i migliori l'accesso al sito di iniezione. Per la corteccia è più facile gettare le piatta animale sul ventre, mentre per il cervelletto è utile per posizionare il cucciolo la testa oltre il bordo del blocco di fornire un migliore accesso alla parte posteriore del cranio. Il cucciolo può essere fissato in posizione con un cerotto, se lo si desidera. </li><li> Tenere il cucciolo la testa in posizione con una mano mentre l'ago viene inserito manualmente attraverso il cranio al sito desiderato con l'altra mano. E 'utile per tirare la pelle tesa per evitare che si sposti durante l'iniezione. Per la corteccia è utile per fare le iniezioni rispetto a un ben definito punto di riferimento anatomico, come ad esempio la sutura lambda del cranio, in quanto questo sarà di aiuto nella iniezioni futuro. Il cervelletto può essere visto attraverso il cranio, come una sottile striscia di tessuto che si trova direttamente al collicolo caudale. La profondità a cui l'ago deve essere inserito varia leggermente tra i singoli animali e le tensioni e può essere misurata con indicatori predeterminati sul ferro, ma per la corteccia e il cervelletto troviamo che una profondità di circa 0,5 - 1 mm dalla superficie sono generalmente sufficienti. La profondità di inserimento anche per altri siti devono essere determinati sperimentalmente da parte dell'utente finale. NOTA: L'ago deve facilmente penetrare il cranio, se non, non spingere troppo duro come questo può ferire l'animale. Riposizionare l'ago e delicatamente riprovare. </li><li> Iniettare la soluzione di virus. L'iniezione è iniziare aed premendo il pulsante START sulla pompa o deprimente un pedale, a seconda del modello di pressione iniettore utilizzato. In assenza di un pedale si raccomanda di avere un collega assistere premendo il pulsante per minimizzare i movimenti della mano inutili che possono influenzare l'iniezione. </li><li> Dopo il volume selezionato è stato iniettato, tenere l'ago in posizione per qualche secondo e poi rimuovere delicatamente l'ago facendolo scorrere fuori senza problemi. Accertarsi di tenere il cucciolo la testa in atto per minimizzare i movimenti estranei. Dal momento che le attrezzature di iniezione viene pulito e sterilizzato tra esperimenti con etanolo e la ferita è piccola, l'uso di antisettici non è necessaria. </li><li> Collocare il cucciolo sulla piastra coperta con la temperatura impostata a ~ 38 ° C per scaldarlo per il recupero, minuti al 5-10. Durante questo periodo si può continuare l'iniezione altri cuccioli. </li><li> Dopo che tutti i cuccioli hanno recuperato (dovrebbero essere rosa e in movimento) prendere una parte della biancheria da letto a casa e strofinare delicatamente i cuccioli con esso. Ritorno i cuccioli con la madre come un gruppo. </li></ol> NOTA: E 'molto importante assicurarsi che i cuccioli sono caldi e esposti a letto a casa prima del loro ritorno alla madre e di ritornare come gruppo. In caso contrario si potrebbero causare nella madre ferire o uccidere i cuccioli. 4. Attrezzature per la pulizia <ol><li> Dopo l'iniezione è completa e cuccioli sono stati restituiti alla loro madre, pulire il setup iniezione pienamente carico la siringa con acetone o etanolo al 70%. Lavare la soluzione attraverso l'iniezione tempi di setup diversi, usando la soluzione fresca ogni volta. Questo rimuoverà qualsiasi soluzione rimanente virus e precipita. L'acetone o etanolo poi evaporare. NOTA: L'acetone è preferito per la pulizia, ma se la vostra installazione utilizza qualsiasi acetone componenti sensibili, come adesivi cianoacrilati, quindi utilizzare etanolo al 70% per questi passaggi. </li><li> Disinfettare l'area di lavoro con i rifiuti candeggina ed eliminare in un apposito contenitore a rischio biologico. </li></ol> 5. Analisi <ol><li> Sacrificare gli animali all'età desiderato utilizzando un metodo IACUC eutanasia approvato. Fissazione perfusione è consigliato per aiutare nella visualizzazione dopo di neuroni infetti, soprattutto negli animali adulti. </li><li> Procedure di immunoistochimica standard può essere utilizzato per amplificare il segnale fluorescente. In breve, 100 micron galleggianti sezioni vibratome sono permeabilizzate con PBS +1% Triton X-100 e bloccato in PBS +1% Triton X-100 +10% siero di capra normale. Le sezioni sono incubate nel bloccare la soluzione con gli anticorpi primari notte a 4 ° C, seguita da ulteriori lavaggio e di blocco. Le sezioni sono poi incubate nel bloccare la soluzione con anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente, lavate accuratamente, montato su guide e coperti con mezzi di montaggio anti-sbiadimento. Criosezioni può essere utilizzato anche per visualizzare neuroni marcati, tuttavia la fluorescenza endogena potrebbero andare perse. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Una procedura di iniezione di successo produrrà infezione robusto dei neuroni nella regione del sito d'iniezione, senza danni ai tessuti osservabili o altri effetti nocivi sull'animale. Come illustrato nella figura 1, la diffusione della infezione può essere osservata in Cre-reporter topi (ROSA26R) 12 iniettata con rAAV8-Cre in siti anatomici diversi. Iniezioni in regioni specifiche, come la corteccia e collicolo superiore, tipicamente generano infezioni locali con diffusione minima nelle regioni adiacenti (Fig. 1A-B). Uso di una soluzione ad alta virus titolo rende l'infezione delle aree adiacenti, come l'ippocampo, più probabile (Fig. 1A). Iniezione con risultati soluzione a basso titolo nelle infezioni da virus sparse, che rimane di solito in prossimità del sito di iniezione, come mostrato nella iniezione cerebellare di rAAV8-Cre sulla linea mediana del topo giornalista ROSA26R (figura 1C-D). Abbiamo osservato nei topi ricombinazione giornalista ROSA26R entro 2 giorni dopo l'iniezione di rAAV8-Cre, suggerendo che l'infezione, ricombinazione, ed espressione di geni reporter possono verificarsi in modo relativamente rapido. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per studiare gli effetti della delezione del gene in un non-ROSA locus utilizzando un allele floxed condizionale, i cui risultati verranno pubblicati altrove. Il numero di cellule infette dovrebbero correlazione con il titolo della soluzione iniettata virale. Per esempio, l'iniezione di un mix di soluzioni di alto titolo di due rAAV8 virus che esprimono diverse proteine ​​fluorescenti nel cervelletto infetta molte cellule di Purkinje che sono etichettati in modo differenziale (Fig. 2A). Al contrario, iniettando una soluzione a basso titolo virus possono causare infezioni sparse per aiutare a visualizzare singole cellule (Fig. 2B). Neuroni fluorescente può essere osservata direttamente nel taglio fresco, tessuto vivo (Fig. 2B) o può essere sottoposto a immunostaining per migliorare i segnali endogeni fluorescenti per l'acquisizione di immagini più tardi da grande campo o confocal microscopia a fluorescenza (Fig. 2A, fig. 3A-C). Infine, rAAV8 è in grado di infettare una grande varietà di tipi di neuroni della corteccia con l'etichettatura dei processi di forte multa (Fig. 3A-C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: colorazione LacZ nel cervello di topi giornalista ROSA26R che sono stati iniettati con rAAV8 Cre-a P0 dimostra attività Cre e la posizione di infezione. <ol type="A"><li> Ampio campo di vista sagittale del cervello di un P14 che mostra alto titolo (1x10 12 GC / ml) iniezioni di corteccia e nel collicolo superiore. L'uso di virus ad alto titolo rende più probabile che le aree adiacenti saranno infettati. </li><li> Sezione sagittale del P14 corteccia iniettati con basso titolo (1x10 11 GC / ml) dimostra una infezione da virus locale con minore diffusione. </li><li> Una vista wholemount di un cervelletto P28 iniettato sulla linea mediana, con basso titolo (1x10 9 GC / ml) soluzione del virus indica che l'infezione è scarsa e rimane di solito in prossimità del sito di iniezione. </li><li> Sagittale della linea mediana del cervelletto in C). Si noti che le cellule di Purkinje in genere solo sono infettati da rAAV8. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: etichettatura cerebellare mediante iniezione con titoli ad alta e bassa di rAAV8 esprimono proteine ​​fluorescenti. <ol type="A"><li> Una sezione sagittale del P21cerebellum infettato con un mix di due virus che esprimono EGFP (verde) e DsRed (rosso). Un mix alto titolo di virus è stato utilizzato per infettare un gran numero di cellule di Purkinje. </li><li> Una cellula di Purkinje nel cervelletto vivere P14 titolo da infezione virale molto bassa ripreso immediatamente dopo la dissezione. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: etichettatura corticale da rAAV8-DsRed. Esempi della varietà di tipi di neuroni corticali in sezioni coronali di una corteccia P21 che è stato infettato da rAAV8-DsRed a P0.

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<li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo neonatale iniezione virale qui presentata fornisce un modo semplice e rapido per generare mosaici in vivo per lo studio dello sviluppo cerebrale postnatale. Il metodo si avvale di alleli floxed che sono attualmente disponibili e quelle che vengono effettuate tramite il gene targeting High Throughput progetto 6. Rispetto all&#39;uso di espressione transgenica di Cre, questo metodo fornisce un modo rapido per testare la funzione del gene in vari tipi di cellule, come topi portatori degli alle...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre, GFP-,-DsRed, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, ordine personalizzato </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard pompa 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (No porta a pedale) </td></tr><tr><td> Pigmento epitelio della retina Kit iniezione </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> RPE-KIT </td><td> Contiene connettivo tubi, aghi da iniezione (36G), e porta aghi </td></tr><tr><td> NanoFil siringa, 100μl </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Include ago riutilizzabili carico </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP anticorpi </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi DsRed </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldamento Block </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R del mouse </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione cre

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normali funzioni cerebrali si basa non solo sullo sviluppo embrionale in cui i principali percorsi neuronali sono stabiliti, ma anche sullo sviluppo postnatale, quando i circuiti neurali sono maturato e raffinato. Misregulation in questa fase può portare a disturbi neurologici e psichiatrici come l&#39;autismo e la schizofrenia 1,2. Molti geni sono stati studiati nel cervello prenatale e ha trovato cruciali per molti processi di sviluppo 3-5. Tuttavia, la loro funzione nel cervello postnatale è in gran parte sconosciuto, anche perché la loro cancellazione in topi spesso conduce a mortalità durante lo sviluppo neonatale, e in parte perché la loro richiesta nel primo sviluppo ostacola l&#39;analisi post-natale. Per superare questi ostacoli, floxed alleli di questi geni sono attualmente generati nei topi 6. Se combinato con alleli transgenici che esprimono Cre ricombinasi in tipi cellulari specifici, la cancellazione condizionale può essere raggiunto per studiare la funzione dei geni nel cervello postnatale. Tuttavia, questo metodo richiede alleli aggiuntivi e tempi supplementari (3-6 mesi) per generare i topi con genotipi del caso, limitando così l&#39;espansione della analisi genetica di larga scala nel cervello di topo. Qui mostriamo un approccio complementare che utilizza virale Cre-espresso per studiare questi alleli floxed rapidamente e sistematicamente nello sviluppo cerebrale postnatale. Iniettando ricombinante virus adeno-associati (rAAVs) 7,8 codifica Cre nel cervello neonatale, siamo in grado di eliminare il gene di interesse in diverse regioni del cervello. Controllando il titolo virale e coexpressing un marcatore fluorescente proteina, siamo in grado di raggiungere contemporaneamente l&#39;inattivazione del gene mosaico e sparse etichettatura neuronale. Questo metodo evita l&#39;esigenza di molti geni nello sviluppo iniziale, e ci permette di studiare la loro funzione autonoma delle cellule in molti processi critici nello sviluppo cerebrale postnatale, compresa la crescita assonale e dendritiche, ramificazione, e rivestimenti, come pure la formazione di sinapsi e raffinatezza. Questo metodo è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio proprio (risultati non pubblicati) e altri 8,9, e può essere esteso ad altri virus, come il lentivirus 9, così come l&#39;espressione di shRNA o dominante proteine ​​attive 10. Inoltre, combinando questa tecnica con elettrofisiologia così come recentemente sviluppato strumenti di imaging ottico 11, questo metodo fornisce una nuova strategia per studiare come i percorsi genetici influenzano lo sviluppo neurale del circuito e la funzione di topi e ratti.

Un<em&gt; In vivo</emMetodo&gt; per testare la funzione del gene nel cervello postnatale è descritto. AAVs ricombinanti che esprimono Cre e / o di una proteina fluorescente vengono iniettate nel cervello di topo neonatale. L&#39;inattivazione del gene mosaico e rada etichettatura neuronali siano raggiunti, consentono una rapida analisi della funzione del gene nei processi critici per lo sviluppo del circuito neurale.

Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre

Il normale funzionamento cerebrale dipende non solo dallo sviluppo embrionale, durante il quale vengono stabiliti i principali percorsi neuronali, ma anche dallo sviluppo postnatale, quando...

L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare la funzione genica durante il periodo postnatale dello sviluppo cerebrale. Questo viene ottenuto innanzitutto selezionando e preparando i virus appropriati, caricandoli nella siringa e predisponendo l'equipaggiamento per l'iniezione. Successivamente, il virus viene iniettato nei cervelli di topolini neonati e l'ultimo passaggio consiste nell'eutanasia degli animali e nell'acquisizione di immagini delle regioni iniettate.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un'etichettatura differenziale di cellule di controllo e cellule knockout mediante microscopia a fluorescenza immunologica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio in che modo il periodo dello sviluppo postnatale è regolato geneticamente. Per l'iniezione, si può utilizzare una soluzione virale adeno-associata disponibile in commercio ad alto titolo, tipicamente 10 alla 12a copia genomica per millilitro, al fine di manipolare un elevato numero di cellule.Se si desidera una diluizione scarsa o un'etichettatura, iniziare con una diluizione da uno a dieci. Dopo aver scongelato il virus su ghia

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Un metodo di tracciare neuroni sinapticamente collegate è descritto. Usiamo specificità TVA di una cella a monte per sondare se una popolazione di cellule riceve input sinaptico da tipi di cellule geneticamente definiti.

Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale.  Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Capitalizzando su una strategia genetica binaria, forniamo un protocollo dettagliato per il tracciamento dei circuiti neurali nei topi che esprimono traccianti transsinaptici complementari dopo la ricombinazione mediata da Cre. Poiché la produzione di traccianti cellulo-specifici è geneticamente codificata, il nostro approccio sperimentale è adatto per studiare la formazione e la maturazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del cervello embrionale murino con una risoluzione di una...

Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Viene presentato un protocollo per eseguire il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di singola cellula utilizzando l'analisi del mosaico con doppi marcatori (MADM). L'analisi clonale MADM fornisce un quadro quantitativo per misurare il comportamento proliferativo, l'output cellulare e la relazione di lignaggio dei singoli progenitori e delle loro cellule figlie.

Tracciamento del lignaggio e analisi clonale nello sviluppo della Corteccia cerebrale utilizzando l'analisi mosaica con doppi marcatori (MADM)

Il ruolo dei geni associati alle malattie recentemente scoperti nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici rimane oscuro. Un bilaterale modificato nella tecnica di elettroporazione utero consente il trasferimento genico in grandi popolazioni di neuroni e l'esame degli effetti causali dei cambiamenti di espressione genica sul comportamento sociale.

Una pipeline che utilizza l'elettroporazione bilaterale in utero per interrogare le influenze genetiche sul comportamento dei roditori

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, i neuroni e le cellule gliali hanno origine nella zona ventricolare che riveste il ventricolo e migrano verso la superficie del cervello. Molti geni sono coinvolti in questo processo. Questo protocollo introduce la tecnica per l'imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali.

Imaging time-lapse di neuroni in migrazione e progenitori gliali in fette di cervello embrionale di topo

Scopri come manipolare la funzione genica durante lo sviluppo cerebrale postnatale nei topi mediante iniezione di virus AAV ricombinanti. Questo metodo consente l'inattivazione genica mosaicata e l'etichettatura neuronale sparsa per studiare la formazione dei circuiti neurali.

Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre

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