Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di manipolare la funzione genica durante il periodo postnatale dello sviluppo cerebrale. Ciò si ottiene selezionando e preparando prima i virus appropriati, caricandoli nella siringa e preparando l'attrezzatura per l'iniezione. Quindi il virus viene iniettato nel cervello dei cuccioli di topo appena nati e il passaggio finale consiste nel sacrificare gli animali e visualizzare le regioni iniettate.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la marcatura differenziale delle cellule di controllo e knockout attraverso la microscopia a immunofluorescenza. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio come il periodo dello sviluppo postnatale è geneticamente regolato. Per l'iniezione, una soluzione di virus adeno-associato disponibile in commercio può essere utilizzata a titolo completo, in genere da 10 a 12, copie del genoma per millilitro per manipolare un gran numero di cellule.

Se si desidera una diluizione rada o un'etichettatura, iniziare con una diluizione da uno a 10. Dopo aver scongelato il virus con ghiaccio, trasferire immediatamente il volume di pre-diluizione in una provetta sterile per PCR da 250 microlitri. Mantenere la diluizione in ghiaccio. Ora.

Preparare la pompa di iniezione selezionando una siringa appropriata e collegandola a un ago di caricamento. Successivamente, aspirare delicatamente la soluzione virale fino a quando non si vede una bolla d'aria molto piccola nella siringa e può essere utilizzato un colorante a caricamento inerte per facilitare questo passaggio. Ora fissa la siringa alla pompa con un fermo.

Quindi collegare delicatamente il tubo di collegamento tra la siringa e il supporto dell'ago. Assicurarsi che l'ago per iniezione sia a diretto contatto con il tubo di collegamento all'interno del supporto dell'ago. Ora, muovi lentamente la soluzione attraverso il tubo connettivo fino a quando una piccola goccia di soluzione è visibile sulla punta dell'ago.

Fissare con cura lo stantuffo accanto al blocco spintore con una staffa sulla pompa. Impostare la velocità di iniezione su otto microlitri al minuto e impostare il volume di iniezione su un valore compreso tra uno e due microlitri. Quindi regolare l'impostazione del diametro della siringa della pompa in modo che corrisponda al diametro della siringa che si sta utilizzando.

Infine, per proteggere i cuccioli durante la fase di recupero, impostate la piastra riscaldante a 38 gradi Celsius e copritela con un tovagliolo di carta. Utilizzando un protocollo approvato dall'IACUC, preparare i cuccioli di topo P zero o P uno per l'iniezione sottoponendoli ad anestesia fredda. Inumidisci alcuni tovaglioli di carta con acqua e mettili sul ghiaccio.

Quindi posizionare quattro o cinque cuccioli sul tovagliolo di carta ben separati. Piega i tovaglioli di carta sui cuccioli, posiziona delicatamente una piccola quantità di ghiaccio tritato sopra i tovaglioli di carta e incuba i cuccioli per circa cinque minuti. I cuccioli possono essere tenuti in sicurezza sul ghiaccio per un massimo di 15 minuti e hanno comunque un buon recupero.

Ora posiziona un cucciolo anestetizzato su un blocco di montaggio per un migliore accesso al sito di iniezione. La corteccia, ad esempio, è più facilmente accessibile sdraiando l'animale sulla pancia. Il cucciolo può essere fissato in posizione usando un cerotto, stabilizzare manualmente la testa del cucciolo e tirare forte la pelle per impedirgli di muoversi.

Quindi naviga tra i punti di riferimento anatomici del cranio come la sutura lambda e seleziona un punto di iniezione riproducibile con l'altra mano, inserisci delicatamente l'ago attraverso il cranio. Non spingere con forza se l'ago non penetra facilmente nel cranio. Invece, riposiziona l'ago e riprova delicatamente.

La profondità di iniezione varia leggermente tra i singoli animali e ceppi per la corteccia, da mezzo a un millimetro di profondità di solito funziona. Ora, inietta la soluzione virale facendo attivare la pompa a un collega per ridurre al minimo i movimenti della mano. Idealmente, si potrebbe utilizzare un pedale per avviare la pompa dopo l'iniezione.

Tieni l'ago in posizione per alcuni secondi, quindi mantieni la testa del cucciolo ferma senza intoppi. Far scorrere l'ago verso l'esterno. Ora, lascia che il cucciolo si riprenda per cinque-10 minuti sulla piastra calda coperta.

Durante questo periodo, continua a iniettare altri cuccioli. Quando i cuccioli hanno riacquistato il loro colore rosa e si muovono, strofinali delicatamente con una parte della loro lettiera domestica. Solo allora potranno essere restituiti alla madre.

Altrimenti, potrebbero essere trattati come cuccioli sconosciuti, che la madre molto probabilmente ucciderebbe dopo che i cuccioli sono stati restituiti alla madre. Pulire la configurazione di iniezione caricando completamente la siringa con acetone o etanolo al 70%. Se sono in uso componenti sensibili all'acetone come sano, acrate, adesivi, lavare la soluzione attraverso la configurazione di iniezione più volte utilizzando ogni volta una soluzione fresca.

Questo rimuoverà qualsiasi soluzione virale rimanente e precipiterà i solventi evaporeranno. Dopo aver risciacquato l'installazione, disinfettare l'area di lavoro della candeggina per lasciarla pronta per il prossimo sperimentatore. Mentore. Una tecnica di successo produce una robusta infezione neuronale nel sito di iniezione.

Le iniezioni in regioni specifiche come la corteccia e il collicolo superiore generano tipicamente infezioni locali con una diffusione minima alle regioni adiacenti. L'uso di una soluzione virale ad alto titolo rende più probabile l'infezione delle aree adiacenti come l'ippocampo, l'iniezione con una soluzione virale a basso titolo. Provoca un'infezione sparsa tipicamente vicino al sito di iniezione come l'iniezione cerebellare sulla linea mediana, il numero di cellule infette dovrebbe essere correlato a un titolo della soluzione virale iniettata.

Ad esempio, l'iniezione di una miscela di soluzioni ad alto titolo di due virus R AAV otto che esprimono diverse proteine fluorescenti nel cervelletto, infetta molte cellule kinji che sono marcate in modo differenziato. Al contrario, l'iniezione di una soluzione virale a basso titolo può provocare un'infezione sparsa per aiutare a visualizzare le singole cellule. I neuroni marcati in fluorescenza possono essere osservati direttamente nel tessuto vivo appena tagliato, oppure possono essere sottoposti a colorazione immunologica.

Ciò migliora i segnali fluorescenti endogeni per la successiva acquisizione di immagini mediante microscopia a campo largo o fluorescente confocale. Infine, RAAV 8 è in grado di infettare una varietà di tipi di neuroni nella corteccia con una forte marcatura dei processi fini Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa 30 minuti se eseguita correttamente.