Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della mutagenesi trascrizionale, come ad esempio quali subunità dell'RNA polimerasi o processi biologici controllano la fedeltà della trascrizione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione degli errori di trascrizione endogeni nei trascrittomi degli organismi eucarioti. In generale, le persone che non conoscono questo protocollo avranno difficoltà a causa della lunghezza e della complessità del test e della necessità di una bioinformatica avanzata per interpretare i dati.

Per iniziare il protocollo, circolarizzare i frammenti di RNA denaturando a caldo 20 microlitri del campione precedentemente preparato a 65 gradi Celsius per un minuto. Dopo un minuto, posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio per due minuti. Quindi, aggiungi quattro microlitri di tampone 10x T4 RNA ligasi, quattro microlitri di ATP 10 millimolare, un microlitro di inibitore della RNasi, un microlitro di acqua priva di nucleasi e otto microlitri di polietilenglicole al 50% o PEG.

Quindi mescolare accuratamente il campione mediante vortex. Quindi aggiungere due microlitri da 10 unità per microlitro di T4 RNA ligasi uno. Miscelare nuovamente il campione mediante pipettaggio e incubarlo a 25 gradi Celsius per due ore in un termociclatore con la temperatura del coperchio impostata a 30 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione di due ore, aggiungere 10 microlitri di acqua priva di nucleasi al campione e pulire il campione con un kit di pulizia e concentrazione oligo. Eluire il campione in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per trascrivere al contrario le molecole di RNA circolare, aggiungere quattro microlitri di dNTP da 10 millimolari, quattro microlitri di esameri casuali da 50 nanogrammi per microlitro e nove microlitri di acqua priva di nucleasi a nove microlitri di RNA.

Miscelare accuratamente pipettando e denaturare il campione a 65 gradi Celsius per un minuto. Dopo aver denaturato il campione, metterlo in ghiaccio per due minuti. Aggiungere al campione otto microlitri di tampone di sintesi 5x primo filamento, due microlitri di DTT 0,1 millimolare e quattro microlitri di 200 unità per microlitro di trascrittasi inversa e miscelare mediante pipettaggio.

Incubare il campione a 25 gradi Celsius per 10 minuti con il coperchio impostato cinque gradi Celsius in più rispetto alla temperatura di incubazione. Quindi incubare il campione per 20 minuti a 42 gradi Celsius con il coperchio impostato a 47 gradi Celsius. Eluire il campione in 42 microlitri di soluzione di eluizione dopo la pulizia con il kit di pulizia e concentrazione.

Utilizzare il kit di sintesi del secondo filamento per generare una libreria di cDNA a doppio filamento. Posizionare i campioni sul ghiaccio e aggiungere 30 microlitri di acqua NF a 38 microlitri del campione. Successivamente, aggiungere otto microlitri di tampone 10x secondo filamento e quattro microlitri di enzima secondo filamento e mescolare il campione mediante pipettaggio delicato prima di incubare a 16 gradi Celsius per due ore e mezza.

Pulire i campioni con il kit di pulizia e concentrazione oligo per reazioni da 100 microlitri ed eluire i campioni in 38 microlitri di acqua priva di nucleasi. Miscelare la reazione di riparazione finale mediante pipettaggio e incubarla a 20 gradi Celsius per 30 minuti. Seguire l'incubazione a 20 gradi Celsius con un'incubazione di 30 minuti a 65 gradi Celsius.

Innanzitutto, diluire gli adattatori per il sequenziamento di nuova generazione dieci volte in 10 milliMolar tris HCl fino a una concentrazione finale di 1,5 microMolar. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di adattatore diluito e un microlitro di potenziatore di legatura a ciascun campione e mescolarli mediante vortex. Quindi, aggiungere 15 microlitri di master mix TA ligasi blunt.

Pipettare il campione su e giù per mescolarlo e incubarlo a 20 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, aggiungere tre microlitri di enzima reagente di escissione specifico per uracile e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Al termine della legatura, aggiungere 13,5 microlitri di acqua priva di nucleasi al campione per un volume totale di 100 microlitri e procedere alla selezione della dimensione.

Acclimatare le perle magnetiche a temperatura ambiente. Aggiungere 30 microlitri di microsfere magnetiche acclimatate e risospese a ciascun campione e miscelare mediante pipettaggio. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 millilitri e incubarlo a temperatura ambiente per cinque minuti.

Posizionare il campione su un supporto magnetico per cinque minuti per separare le perle dal surnatante. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e smaltire le perle magnetiche. Aggiungere un'aliquota fresca di 15 microlitri di microsfere magnetiche a ciascun campione.

Miscelare accuratamente pipettando e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare i campioni su un rack magnetico e incubarli per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere e smaltire con cura i surnatanti, facendo attenzione a non disturbare le perline.

Aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato all'80% a ciascuno dei campioni senza disturbare le microsfere magnetiche pellettate e incubare per 30 secondi. Quindi, rimuovere completamente ogni traccia di etanolo dai campioni e asciugare le perle all'aria per cinque minuti, ma fare attenzione a non asciugarle eccessivamente. Per eluire i campioni dalle perline, rimuovere le provette dal supporto magnetico.

Aggiungere 19 microlitri di 10 milliMolare tris HCl. Pipettare la miscela su e giù più volte per risospendere le perle e incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Riposizionare i campioni sul supporto magnetico e incubarli per cinque minuti per separare le perle dal surnatante.

Rimuovere con cautela dalle provette 15 microlitri di surnatante contenente le librerie di cDNA purificate e selezionate e trasferirle in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Aggiungere cinque microlitri di primer universale e cinque microlitri di un primer indice unico a ciascuna libreria di cDNA purificata e mescolarli accuratamente mediante pipettaggio. Controllare attentamente la miscela master della polimerasi per verificare la presenza di cristalli e altri precipitati e riscaldare la miscela master a mano fino a quando i precipitati non si dissolvono.

Aggiungere 25 microlitri della miscela master della polimerasi al campione. Miscelare il campione mediante pipettaggio e seguire le condizioni cicliche elencate nel protocollo di testo allegato per l'amplificazione PCR. Pulisci le librerie finali aggiungendo 45 microlitri di microsfere magnetiche risospese direttamente alla reazione PCR.

Mescolarli pipettandoli e incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 millilitri e posizionarlo in un supporto magnetico per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scartare il surnatante e lavarlo due volte con etanolo all'80% appena preparato per 30 secondi.

Dopo il secondo lavaggio, rimuovere completamente l'etanolo dal campione e asciugare all'aria il pellet di perline per cinque minuti. Quindi eluirlo in 35 microlitri di TE 0,1x. Risospendere le perle pipettandole e incubarle a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo che il tubo è rimasto sul supporto magnetico per cinque minuti, trasferire 30 microlitri di surnatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri.

Conserva le librerie a meno 80 gradi Celsius. Dopo l'isolamento dell'RNA, due distinti picchi di rRNA sono visibili sull'elettroforetogramma. La frammentazione dell'RNA si tradurrà in 50-70 frammenti di RNA di coppie di basi.

La trascrizione inversa a cerchio rotante è stata utilizzata per generare molecole di cDNA che sono costituite da almeno tre ripetizioni tandem dei modelli di RNA circolari. La selezione delle dimensioni con perline magnetiche consente di purificare librerie della dimensione appropriata. Le informazioni di sequenziamento di una singola libreria C-seq mostrano che la maggior parte delle ripetizioni tende ad essere lunga da 45 a 80 basi.

Circa il 50% delle basi che sono state sequenziate fanno parte di queste ripetizioni. Poiché la maggior parte di queste basi sono presenti in tassi che contengono tre o più ripetizioni, il numero di basi uniche che vengono sequenziate è circa un terzo del numero totale di basi sequenziate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere sempre un ambiente di lavoro sterile, privo di RNAsi che potrebbero interferire con il proprio lavoro. È anche importante seguire attentamente ogni passaggio per assicurarsi che non vengano commessi errori durante la procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare gli errori di trascrizione negli eucarioti utilizzando il test C-seq.