Name: Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Scopri un metodo computazionale per misurare errori di trascrizione endogeni negli organismi eucarioti. Questo protocollo avanzato utilizza bioinformatica per analizzare la fedeltà trascrizionale e supportare studi di mutagenesi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa pubblicazione è stata resa possibile dai finanziamenti da parte di grant T32ES019851 (a C. Fritsch), R01AG054641 e un ricercatore giovane AFAR concedere (Vermulst M.).

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la preparazione delle librerie C-seq per il rilevamento di errori di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo ha numerosi vantaggi rispetto ai protocolli esistenti, come pure le tecniche alternative.
Negli ultimi 15 anni, sono stati sviluppati numerosi sistemi reporter che si basano su luciferase7,8...

Il genoma fornisce un preciso progetto biologico della vita. Per implementare correttamente questo programma d'azione, è importante per il genoma deve essere trascritto per primo con grande precisione. Tuttavia, la trascrizione è improbabile che sia privo di errori. Ad esempio, RNA polimerasi lungamente sono state conosciute per essere soggetta a errori in vitro1,2, e recentemente è stato indicato che commettono errori in vivo come pure3,5,6, specialmente quando si confronta con DNA danni7,8,9,10. Prese insieme, queste osservazioni indicano che gli errori di trascrizione avviene con continuità in tutte le cellule viventi, suggerendo che potrebbe essere una potente fonte di proteine mutate.
Questo processo, chiamato mutagenesi trascrizionale, differisce dal classica mutagenesi in due modi. In primo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione interessano sia in cellule post-mitotiche che mitotiche, come essi non dipendono dalla replicazione del DNA. Lo studio dei meccanismi che influenzano la fedeltà della trascrizione, pertanto, fornirà informazioni preziose sul carico mutazione di cellule post-mitotiche e mitotiche. È interessante notare che, gli errori di trascrizione recentemente sono stati implicati nella promozione di proteina aggregazione11,12,13 e sono stati supposti per contribuire a entrambi di carcinogenesi10 e la sviluppo di resistenza agli antibiotico nei batteri14.
In secondo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione sono natura transitori. Loro esistenza temporanea è particolarmente impegnativo, perché rende gli errori di trascrizione estremamente difficile da rilevare. Ad esempio, mentre diversi laboratori hanno messo a punto saggi reporter prezioso per lo studio di mutagenesi trascrizionale, queste analisi sono solo in grado di misurare gli errori di trascrizione in un numero limitato di contesti e organismi modello4,15. Per superare queste limitazioni, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologia di sequenziamento di RNA (RNA-seq), che permette teoricamente gli errori di trascrizione da registrare in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie. Tuttavia, questi studi sono facilmente confusi dai manufatti di costruzione di libreria, quali errori di trascrizione inversa, errori di amplificazione di PCR e la natura soggetta a errori di impostazione della sequenza stessa. Per esempio, reverse transcriptases commit circa un errore ogni ~ 20.000 basi, mentre la RNA polimerasi (RNAPs) sono tenute a compiere un solo errore ogni 300.000 basi5,6. Poiché il tasso di errore di trascrizione d'inversione da solo nani il tasso di errore della polimerasi del RNA all'interno delle cellule, è praticamente impossibile distinguere gli errori di trascrizione vera da artefatti causati dalla preparazione libreria in dati di RNA-Seq tradizionali ( Figura 1a).
Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una versione ottimizzata del cerchio-sequenziamento (Cirseq, o C-seq d'ora in poi) dosaggio5,16. Questo test consente di rilevare gli errori di trascrizione e altre rare varianti nel RNA in tutto il trascrittoma5. L'analisi di sequenziamento circolare porta questo nome perché un passo fondamentale in questa analisi ruota intorno circularization di RNA. Una volta che gli obiettivi del RNA sono circolarizzazione, sono inverso trascritto in una rotolamento cerchio moda, per produrre molecole di cDNA lineare che contengono numerose copie dello stesso modello di RNA. Se un errore era presente in uno di questi modelli, questo errore potrebbe anche essere presente in ogni singola ripetizione contenute all'interno della molecola di cDNA. Al contrario, gli errori introdotti dal trascrizione inversa, amplificazione di PCR o sequenziamento tendono a verificarsi in modo casuale e così sarà presenti in solo uno o due ripetizioni. Così, generando una sequenza di consenso per ogni molecola di cDNA e distinguere errori casuali da errori che si verificano in tutte le ripetizioni, manufatti di costruzione di libreria possono essere separati in modo efficace da errori di trascrizione vera (Figura 1b).
Se usato correttamente, il dosaggio di C-seq può essere utilizzato per rilevare con precisione il tasso di base sostituzioni, inserimenti ed eliminazioni in RNA in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie (ad esempio, Vedi Traverse e Ochman17). Ad esempio, abbiamo usato il test C-seq per fornire misurazioni di genoma del tasso di errore di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans con una sola risoluzione base5 (osservazioni non pubblicate). Originariamente utilizzato per accuratamente sequenza RNA virus popolazioni, questa versione ottimizzata del dosaggio C-seq è stata semplificata per minimizzare condizioni difficili durante la preparazione di libreria che contribuiscono agli elementi di costruzione di libreria. Inoltre, utilizzando una serie di kit disponibili in commercio, la velocità effettiva del dosaggio è notevolmente migliorata, così come la facilità d'uso. Se usato correttamente, questo test è in grado di rilevare con precisione migliaia di errori di trascrizione per replica, migliorando così notevolmente il precedente studi6. Nel complesso, questo metodo fornisce un potente strumento per lo studio di mutagenesi trascrizionale e permetterà all'utente di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione in una vasta gamma di organismi.

<table><tbody><tr><td>Kit di purificazione dell'RNA RiboPure</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>Purificazione dell'RNA totale</td></tr><tr><td>Kit di purificazione dell'mRNA</td><td>Genelute Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>Purificazione dell'mRNA</td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Eluizione e diluizione</td></tr><tr><td>Ambion RNasi III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>Frammentazione dell'RNA</td></tr><tr><td>T4 RNA Ligasi 1 (ssRNA Ligasi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>Circolarizzazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>Inibitore dell'RNasi</td></tr><tr><td>SuperScript III Trascrittasi inversa</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Trascrizione inversa del cerchio rotante</td></tr><tr><td>10 mM Miscela dNTP</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Trascrizione inversa del cerchio rotante</td></tr><tr><td>Esameri casuali (50 ng/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Trascrizione inversa a cerchio rotante</td></tr><tr><td>NEB Modulo di sintesi del secondo filamento</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>Sintesi del secondo filamento</td></tr><tr><td>NEBNext Kit di preparazione della libreria di DNA Ultra per Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>Preparazione della libreria di cDNA</td></tr><tr><td>NEB Next primer dell'indice</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>Multiplex</td></tr> <tr><td>PCROligo pulito & Concentratore</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>Pulizia di campioni di RNA e DNA</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnete</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Purificazione di biglie</td></tr><tr><td>magnetiche Perle AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Purificazione di microsfere magnetiche</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 Microcentrifuga</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore INCU 10 L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore T100 BIO</td><td>RAD</td><td>1861096</td><td>Condizioni di ciclo a temperatura medio-alta</td></tr><tr><td>Termociclatore PTC-200</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&nbsp;</td><td>Condizioni di ciclo a bassa temperatura</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>Sterilizzazione</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 mL</td> senza nucleasi <td>Corning</td><td>430052</td> Provette Eppendorf <td>senza nucleasi</td></tr><tr><td></td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td> Sistema di tapestation 4200 <td>senza nucleasi</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Strumento di analisi nucleotidica per il controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento</td></tr><tr><td>Nastro per screening RNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>Controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Sample Buffer</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>Controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento</td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>Controllo di qualità di campioni di RNA e DNA a singolo filamento</td></tr><tr><td>2100 Strumento bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Controllo di qualità del DNA a doppio filamento</td></tr><tr><td>Kit DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Controllo di qualità per campioni di cDNA a doppio filamento</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>Incubazione</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C Spettrofotometro</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000C</td><td>Determinazione della concentrazione di RNA</td></tr></tbody></table>

sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Trascrizione accurata è necessaria per la fedele espressione dell'informazione genetica. Sorprendentemente, però, piccolo è conosciuto circa i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione. Per colmare questa lacuna nella conoscenza scientifica, abbiamo recentemente ottimizzato il dosaggio di cerchio-sequenziamento per rilevare errori di trascrizione in tutto il trascrittoma di Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo di fornire ai ricercatori con un nuovo potente strumento per mappare il paesaggio di errori di trascrizione nelle cellule eucariotiche, in modo che i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione possono essere chiariti in dettaglio senza precedenti.

Come tutti gli approcci di sequenziamento massivamente parallelo, ogni esperimento di C-seq produce un ingombrante, grandi set di dati. Per gli utenti di prima volta, può essere difficile gestire questi set di dati; Pertanto, si raccomanda che tutti gli utenti di contattare un esperto bio-pianista prima la sperimentazione. In media, l'aspettativa è che gli utenti genererà circa 55 – 70 Giga basi (Gbases) per eseguire su più piattaforme di sequenziamento massivamente parallelo. Per questo ...

Questo protocollo fornisce ai ricercatori con un nuovo strumento per monitorare la fedeltà della trascrizione in molteplici organismi di modello.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della mutagenesi trascrizionale, come ad esempio quali subunità dell'RNA polimerasi o processi biologici controllano la fedeltà della trascrizione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione degli errori di trascrizione endogeni nei trascrittomi degli organismi eucarioti. In generale, le persone che non conoscono questo protocollo avranno difficoltà a causa della lunghezza e della complessità del test e della necessità di una bioinformatica avanzata per interpretare i dati.Per iniziare il protocollo, circolarizzare i frammenti di RNA denaturando a caldo 20 microlitri del campione precedentemente preparato a 65 gradi Celsius per un minuto. Dopo un minuto, posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio per due minuti. Quindi, aggiungi quattro microlitri di tampone 10x T4 RNA ligasi, quattro microlitri di ATP 10 millimolare, un microlitro di inibitore della RNasi, un microlitro di acqua priva di nucleasi e otto microlitri di polietilenglicole al 50% o PEG.Quindi mescolare accuratamente il campione mediante vortex. Quindi aggiungere due microlitri da 10 unità per microlitro di T4 RNA ligasi uno. Miscelare nuovamente il campione mediante pipettaggio e incubarlo a 25 gradi Celsius per due ore in un termociclatore con la temperatura del coperchio impostata a 30 gradi Celsius.Dopo l'incubazione di due ore, aggiungere 10 microlitri di acqua priva di nucleasi al campione e pulire il campione con un kit di pulizia e concentrazione oligo. Eluire il campione in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Per trascrivere al contrario le molecole di RNA circolare, aggiungere quattro microlitri di dNTP da 10 millimolari, quattro microlitri di esameri casuali da 50 nanogrammi per microlitro e nove microlitri di acqua priva di nucleasi a nove microlitri di RNA.Miscelare accuratamente pipettando e denaturare il campione a 65 gradi Celsius per un minuto. Dopo aver denaturato il campione, metterlo in ghiaccio per due minuti. Aggiungere al campione otto microlitri di tampone di sintesi 5x primo filamento, due microlitri di DTT 0,1 millimolare e quattro microlitri di 200 unità per microlitro di trascrittasi inversa e miscelare mediante pipettaggio.Incubare il campione a 25 gradi Celsius per 10 minuti con il coperchio impostato cinque gradi Celsius in più rispetto alla temperatura di incubazione. Quindi incubare il campione per 20 minuti a 42 gradi Celsius con il coperchio impostato a 47 gradi Celsius. Eluire il campione in 42 microlitri di soluzione di eluizione dopo la pulizia con il kit di pulizia e concentrazione.Utilizzare il kit di sintesi del secondo filamento per generare una libreria di cDNA a doppio filamento. Posizionare i campioni sul ghiaccio e aggiungere 30 microlitri di acqua NF a 38 microlitri del campione. Successivamente, aggiungere otto microlitri di tampone 10x secondo filamento e quattro microlitri di enzima secondo filamento e mescolare il campione mediante pipettaggio delicato prima di incubare a 16 gradi Celsius per due ore e mezza.Pulire i campioni con il kit di pulizia e concentrazione oligo per reazioni da 100 microlitri ed eluire i campioni in 38 microlitri di acqua priva di nucleasi. Miscelare la reazione di riparazione finale mediante pipettaggio e incubarla a 20 gradi Celsius per 30 minuti. Seguire l'incubazione a 20 gradi Celsius con un'incubazione di 30 minuti a 65 gradi Celsius.Innanzitutto, diluire gli adattatori per il sequenziamento di nuova generazione dieci volte in 10 milliMolar tris HCl fino a una concentrazione finale di 1,5 microMolar. Quindi aggiungere 2,5 microlitri di adattatore diluito e un microlitro di potenziatore di legatura a ciascun campione e mescolarli mediante vortex. Quindi, aggiungere 15 microlitri di master mix TA ligasi blunt.Pipettare il campione su e giù per mescolarlo e incubarlo a 20 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, aggiungere tre microlitri di enzima reagente di escissione specifico per uracile e incubare il campione a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Al termine della legatura, aggiungere 13,5 microlitri di acqua priva di nucleasi al campione per un volume totale di 100 microlitri e procedere alla selezione della dimensione.Acclimatare le perle magnetiche a temperatura ambiente. Aggiungere 30 microlitri di microsfere magnetiche acclimatate e risospese a ciascun campione e miscelare mediante pipettaggio. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 millilitri e incubarlo a temperatura ambiente per cinque minuti.Posizionare il campione su un supporto magnetico per cinque minuti per separare le perle dal surnatante. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e smaltire le perle magnetiche. Aggiungere un'aliquota fresca di 15 microlitri di microsfere magnetiche a ciascun campione.Miscelare accuratamente pipettando e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare i campioni su un rack magnetico e incubarli per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere e smaltire con cura i surnatanti, facendo attenzione a non disturbare le perline.Aggiungere 200 microlitri di etanolo appena preparato all'80% a ciascuno dei campioni senza disturbare le microsfere magnetiche pellettate e incubare per 30 secondi. Quindi, rimuovere completamente ogni traccia di etanolo dai campioni e asciugare le perle all'aria per cinque minuti, ma fare attenzione a non asciugarle eccessivamente. Per eluire i campioni dalle perline, rimuovere le provette dal supporto magnetico.Aggiungere 19 microlitri di 10 milliMolare tris HCl. Pipettare la miscela su e giù più volte per risospendere le perle e incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Riposizionare i campioni sul supporto magnetico e incubarli per cinque minuti per separare le perle dal surnatante.Rimuovere con cautela dalle provette 15 microlitri di surnatante contenente le librerie di cDNA purificate e selezionate e trasferirle in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Aggiungere cinque microlitri di primer universale e cinque microlitri di un primer indice unico a ciascuna libreria di cDNA purificata e mescolarli accuratamente mediante pipettaggio. Controllare attentamente la miscela master della polimerasi per verificare la presenza di cristalli e altri precipitati e riscaldare la miscela master a mano fino a quando i precipitati non si dissolvono.Aggiungere 25 microlitri della miscela master della polimerasi al campione. Miscelare il campione mediante pipettaggio e seguire le condizioni cicliche elencate nel protocollo di testo allegato per l'amplificazione PCR. Pulisci le librerie finali aggiungendo 45 microlitri di microsfere magnetiche risospese direttamente alla reazione PCR.Mescolarli pipettandoli e incubarli a temperatura ambiente per cinque minuti. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 millilitri e posizionarlo in un supporto magnetico per cinque minuti. Dopo l'incubazione, scartare il surnatante e lavarlo due volte con etanolo all'80% appena preparato per 30 secondi.Dopo il secondo lavaggio, rimuovere completamente l'etanolo dal campione e asciugare all'aria il pellet di perline per cinque minuti. Quindi eluirlo in 35 microlitri di TE 0,1x. Risospendere le perle pipettandole e incubarle a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo che il tubo è rimasto sul supporto magnetico per cinque minuti, trasferire 30 microlitri di surnatante in un tubo fresco da 1,5 millilitri.Conserva le librerie a meno 80 gradi Celsius. Dopo l'isolamento dell'RNA, due distinti picchi di rRNA sono visibili sull'elettroforetogramma. La frammentazione dell'RNA si tradurrà in 50-70 frammenti di RNA di coppie di basi.La trascrizione inversa a cerchio rotante è stata utilizzata per generare molecole di cDNA che sono costituite da almeno tre ripetizioni tandem dei modelli di RNA circolari. La selezione delle dimensioni con perline magnetiche consente di purificare librerie della dimensione appropriata. Le informazioni di sequenziamento di una singola libreria C-seq mostrano che la maggior parte delle ripetizioni tende ad essere lunga da 45 a 80 basi.Circa il 50% delle basi che sono state sequenziate fanno parte di queste ripetizioni. Poiché la maggior parte di queste basi sono presenti in tassi che contengono tre o più ripetizioni, il numero di basi uniche che vengono sequenziate è circa un terzo del numero totale di basi sequenziate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre giorni se eseguita correttamente.Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere sempre un ambiente di lavoro sterile, privo di RNAsi che potrebbero interferire con il proprio lavoro. È anche importante seguire attentamente ogni passaggio per assicurarsi che non vengano commessi errori durante la procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare gli errori di trascrizione negli eucarioti utilizzando il test C-seq.

genome-wide-surveillance-transcription-errors-eukaryotic

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere una risoluzione vicina alla coppia di basi delle interazioni proteina-DNA. Questo si ottiene mediante trattamento esonucleasico di frammenti di DNA arricchiti selettivamente mediante immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-exo) seguita da sequenziamento ad alto rendimento.

Il metodo ChIP-exo: Identificazione interazioni proteina-DNA con Vicino paia di basi di precisione

Descriviamo un approccio sperimentale di base per l'analisi della terminazione della trascrizione da parte della RNA polimerasi II in vivo utilizzando BrUTP con l'approccio TRO (Strand-specific Transcription Run-on) in lievito in gemmazione. Questo protocollo può essere esteso per studiare la terminazione della trascrizione da parte di altre RNA polimerasi sia nel lievito che negli eucarioti superiori.

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è un potente strumento per la caratterizzazione genomica che è limitato per l'alto tasso di errore della piattaforma (~0.5–2.0%). Descriviamo i nostri metodi di sequenziamento di correzione d'errore che ci permettono di ovviare il tasso di errore NGS e rilevare le mutazioni alle frazioni di variante allele rare come 0,0001.

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Presentiamo un metodo rapido ed efficiente per rilevare le comuni rotture dei siti fragili attraverso l'immunoprecipitazione nativa della cromatina γH2A.X (ChIP). Questo approccio riduce significativamente sia il tempo che la manodopera associati ai tradizionali saggi ChIP γH2A.X, mantenendo al contempo un'elevata riproducibilità e affidabilità dei risultati.

Cattura delle rotture di siti fragili comuni mediante γH2A nativo. X ChIP

La mutagenesi inserzionale è uno strumento essenziale nella genetica avanzata per identificare gli elementi genomici funzionali. Qui, descriviamo l'Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), un metodo per rilevare i siti di integrazione dei lentivirus all'interno di una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale basata su lentivirus.

Identificazione di siti di integrazione di lentivirus funzionalmente rilevanti in una libreria di cellule di mutagenesi inserzionale

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per esaminare funzionalmente la trascrizione e l'attività inibitoria di agenti antibatterici che mirano alla trascrizione batterica.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

Scopri un metodo computazionale per misurare errori di trascrizione endogeni negli organismi eucarioti. Questo protocollo avanzato utilizza bioinformatica per analizzare la fedeltà trascrizionale e supportare studi di mutagenesi.

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Esplora altri video