Cella singola analisi di Immunophenotype e produzione di citochine nel sangue periferico intero tramite citometria a massa

Qui descriviamo un approccio proteomico di singola cellula per valutare immunitario fenotipica e funzionale (induzione di citochine intracellulari) alterazioni nei campioni di sangue periferico intero, analizzati tramite citometria a massa.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo dell'autoimmunità come l'identificazione di anomalie della frequenza cellulare e differenze di funzione come la produzione di citochine chiave nel contesto della malattia autoimmune. Il vantaggio principale di questo metodo è che può catturare un ampio repertorio o diversi tipi di cellule e differenze di funzione da un campione di sangue periferico facilmente ottenibile. In generale, le persone che non conoscono questo processo possono avere difficoltà a ottenere i tempi corretti delle fasi di lavorazione del sangue, il design del pannello anticorpale, il processo di codifica a barre stesso e l'analisi dei dati di singole cellule ad alta dimensione.

Questo approccio di immunologia sistemica è particolarmente adatto per le malattie autoimmuni come il LES, dove la disregolazione immunitaria è pervasiva ed evidente nel sangue periferico. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante per chiarire la tempistica delle fasi e anche per mostrare come più campioni possano essere codificati a barre e raggruppati prima dell'analisi di citometria di massa. Per iniziare questa procedura, posizionare su un rack le provette di polistirene a fondo tondo etichettate di cinque diverse condizioni per il trattamento del sangue intero.

Quindi, aggiungere un millilitro di RPMI a 37 gradi Celsius a ciascun tubo. Quindi, aggiungere un millilitro di sangue intero a ciascuna provetta e pipettare su e giù più volte per miscelare accuratamente con RPMI. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di ruxolitinib prediluito al tubo etichettato T sei più cinque R e mescolare accuratamente.

Posizionare il rack di provette nell'incubatore a 37 gradi Celsius e iniziare a cronometrare l'incubazione. Per processare il campione T zero, pipettare l'intero contenuto della provetta T zero in una provetta conica marcata contenente 20 millilitri di lisi/tampone di fissaggio a 37 gradi Celsius alla concentrazione di lavoro. Per ottimizzare il recupero cellulare, sciacquare la provetta con tampone di lisi/fissare e mescolare capovolgendo la provetta conica.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire la lisi e la fissazione. Quindi, centrifugare le celle a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, decantare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di PBS ghiacciato per rompere il pellet.

Quindi, riempire il tubo conico fino a un volume di 15 millilitri con PBS. Successivamente, centrifugare le celle a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le celle in un millilitro di CSM per rompere il pellet.

Quindi, trasferire il campione in una provetta da microcentrifuga etichettata per la colorazione degli anticorpi. Utilizzando un contatore di cellule automatizzato, contare le cellule con un campione di 10 microlitri. Quindi, centrifugare le celle a 500 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, aspirare il surnatante, lasciando il pellet in circa 60 microlitri di residuo. Mantenere questo pellet in ghiaccio fino a quando i campioni provenienti da altre condizioni non hanno completato l'elaborazione. A T pari a 30 minuti, trasferire il rack per provette nella cappa di coltura tissutale.

Aggiungere 10 microlitri di R848 a 0,1 grammi per microlitro al tubo T six plus R848 e mescolare accuratamente. Quindi, aggiungere 10 microlitri di LPS a 0,01 microgrammi per microlitro al tubo T six plus LPS e mescolare accuratamente. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di inibitore del trasporto proteico alle provette etichettate T sei, T sei più cinque R e T sei più LPS e rimettere i campioni nell'incubatore fino a quando T non equivale a sei ore.

Miscelare accuratamente i campioni con una pipetta P1000 ogni due ore. A T uguale a due ore, aggiungere quattro microlitri di cocktail di inibitori del trasporto proteico al tubo T six plus R848. Miscelare tutti i campioni e rimettere il rack nell'incubatore fino a quando T non è uguale a sei ore.

A T equivale a quattro ore, mescolare ancora una volta i campioni con una pipetta P1000. A T equivale a sei ore, processare T sei, T sei più LPS, T sei più R848 e T sei più cinque provette per campioni di sangue R come descritto per il campione T zero. Quindi, conservare i pellet nel volume CSM residuo a meno 80 gradi Celsius per lavorarli successivamente.

Per codificare a barre le celle lisate e fisse, scongelare lentamente i campioni dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius sul ghiaccio. Diluire il tampone permanente per codici a barre 10X con PBS da uno a 10 e preparare un tampone sufficiente per tre millilitri per campione. Riempire una mangiatoia non sterile con CSM e una con il tampone per permanente con codice a barre X.

Quindi, aggiungere un millilitro di CSM ghiacciato ai campioni appena scongelati, mescolare accuratamente e trasferire nelle rispettive provette cluster in polipropilene pre-marcate. Ora, prelevare un campione da 10 microlitri e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Normalizzare la conta delle cellule in ciascuna provetta a grappolo rimuovendo il volume delle cellule in eccesso.

Quindi, centrifugare le celle a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in un millilitro di un tampone permanente X barcoding con una pipetta multicanale e centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aspirare il surnatante.

Allineare le provette a grappolo su un rack nello stesso ordine indicato sul tasto del codice a barre, in modo che il campione corrisponda al relativo codice a barre. Aggiungere 800 microlitri di un tampone per permanente con codice a barre X mediante pipetta multicanale a tutti i campioni nelle provette a grappolo senza toccare il pellet cellulare per ridurre la perdita cellulare. Quindi, mettere da parte il rack con le provette a grappolo.

Rimuovere le strisce di provette del kit per codici a barre al palladio da 20 plex da meno 20 gradi Celsius e scongelarle a temperatura ambiente. Aggiungere 100 microlitri di un tampone per la permanente con codice a barre X, mescolare accuratamente e trasferire 120 microlitri della miscela per codici a barre risospesa nei campioni cellulari corrispondenti nelle provette a grappolo. Miscelare accuratamente con la pipetta multicanale in modo che non vi siano contaminazioni incrociate tra i singoli campioni con codice a barre.

Incubare le provette a grappolo per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire ai codici a barre di etichettare le cellule. Dopo 30 minuti, centrifugare i campioni a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante, quindi risospenderlo in un millilitro di CSM.

Successivamente, centrifugare e risospendere nuovamente in CSM. Successivamente, centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Con una singola pipetta e utilizzando lo stesso puntale, trasferire tutti i pellet cellulari in circa 70-80 microlitri di volume residuo in una provetta di polistirene.

Non espellere il puntale della pipetta. Mettere da parte la pipetta singola con questo puntale. Con una pipetta multicanale e nuovi puntali, aggiungere 100 microlitri di CSM a ciascuna provetta cluster originale per massimizzare il recupero cellulare.

Utilizzando la pipetta singola con il puntale che è stato messo da parte, trasferire tutti i pellet cellulari in 100 microlitri di volume residuo nella stessa provetta di polistirene. Aggiungere CSM per completare il tubo di polistirolo a circa tre millilitri. Contare e registrare il numero di cella del set di codici a barre in pool.

Quindi, centrifugare a 600 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Procedere alla colorazione dei campioni con codice a barre lo stesso giorno. Questo schema dimostra il flusso di lavoro per la stimolazione e l'elaborazione dei campioni di sangue periferico, compresa l'assegnazione delle aliquote dei campioni di sangue, i tempi di aggiunta degli agenti di stimolazione, il cocktail di inibitori del trasporto delle proteine e i tempi di incubazione fino alla lisi e alla fissazione dei globuli rossi.

La scelta degli agenti stimolanti dipenderà dalle vie di segnalazione e dalle citochine che sono mirate per la valutazione. Dopo la fissazione e la lisi dei globuli rossi, i singoli campioni di cellule lisate e fissate di un donatore sano sono stati codificati con codice a barre, marcati con 26 anticorpi contro i marcatori di superficie, permeabilizzati e colorati con 14 anticorpi contro le citochine. La strategia di gating limitata che rappresenta l'identificazione di monociti alti CD14 è mostrata qui.

Da sinistra a destra, ogni grafico 2D rappresentato è un sottoinsieme della popolazione principale che viene delimitato dal grafico 2D immediatamente a sinistra. Utilizzando monociti CD14 alti come rappresentanti in otto sottogruppi di cellule immunitarie, è stata eseguita un'analisi di citometria di massa su campioni di sangue periferico di un donatore sano al tempo zero non stimolato e dopo stimolazione con l'agonista TLR LPS e R848 e l'attivatore delle cellule T PMA ionomicina. Viene mostrato un esempio dell'induzione di citochine nei monociti alti CD14 e vengono illustrate citochine selezionate con specificità per l'agente stimolante utilizzato.

R848 induce selettivamente la subunità IL-12p40 e MCP1 nei monociti CD14 alti, mentre LPS non lo fa. Al contrario, la PMA ionomicina non induce citochine nei monociti alti CD14. Una volta padroneggiate, le stimolazioni del sangue possono essere eseguite in circa sette ore e la fase di codifica a barre può essere eseguita in circa un'ora.

Quando si tenta questa procedura, è importante prestare attenzione ai tempi dei passaggi e pianificare in anticipo di conseguenza. Una volta messa in atto questa procedura, si può prendere in considerazione la possibilità di modificare le condizioni di stimolazione del sangue nel pannello di citometria di massa al fine di valutare le risposte delle cellule immunitarie specifiche per i propri obiettivi di ricerca. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come suscitare risposte di citochine da campioni di sangue intero e come raggruppare più campioni in un set di codici a barre per l'analisi della citometria di massa.