Generazione di derivate da monociti cellule dendritiche umane da sangue intero

L'obiettivo generale di questa tecnica di separazione delle microsfere magnetiche CD14 è quello di isolare i monociti dal sangue per la loro ulteriore differenziazione in cellule dendritiche o macrofagi in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia sul riconoscimento, l'elaborazione e la presentazione di agenti patogeni o antigeni da parte delle cellule dendritiche. Il vantaggio principale di questa procedura di isolamento è che è possibile ottenere una popolazione di monociti pura dal 98 al 99%.

A dimostrare la procedura sarà Karolin Thurnes, un tecnico del nostro gruppo di lavoro. Inizia dividendo il volume della confezione di sangue tra provette da centrifuga sterili da 50 millilitri in base alla quantità di sangue ricevuta. Se necessario, regolare il volume finale di ciascuna provetta a 50 millilitri con il PBS sterile di Dulbecco e centrifugare i campioni.

Utilizzando una pipetta sierologica sterile da un millilitro collegata a una pompa a vuoto da laboratorio, rimuovere gli strati di plasma e piastrine lasciando indisturbati gli strati limite. Quindi, utilizzare una nuova pipetta da 25 millilitri per combinare gli strati limite delle cellule mononucleate da due delle provette nella nuova provetta conica sterile da 50 millilitri. Quindi, aggiungere 15 millilitri di terreno di gradiente di densità a ciascuna delle provette coniche da 450 millilitri e, pipettando lentamente e con attenzione, sovrapporre 25 millilitri di cellule del sangue raggruppate sul gradiente di densità in ciascuna provetta.

Separare le celle mediante centrifugazione. Quindi aspirare gli strati superiori del plasma e delle piastrine e trasferire le interfasi PBMC in nuove provette coniche individuali da 50 millilitri. Lavare le PBMC due volte con un massimo di 50 millilitri di DPBS sterile, estraendo le cellule dopo la prima centrifugazione e rimettendo in sospensione il pellet in 50 millilitri di DPBS fresco dopo la seconda.

Dopo il conteggio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione per l'isolamento delle particelle magnetiche dei monociti. Per purificare i monociti mediante isolamento con particelle magnetiche, regolare la concentrazione di PBMC a otto volte 10 per 7 cellule per millilitro di tampone di isolamento. Quindi, agitare accuratamente le particelle magnetiche CD14 anti-umane e mescolare 50 microlitri di particelle per ogni 10 volte al 7° PBMC nelle cellule e trasferire la soluzione di perline cellulari in una provetta sterile da 15 millilitri.

Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, regolare il volume totale a 12 millilitri di tampone di isolamento e trasferire due millilitri di sospensione di particelle cellulari in ciascuna delle sei provette sterili a fondo tondo. Posizionare immediatamente le provette sul magnete di separazione delle celle per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere il surnatante contenente i linfociti del sangue periferico da ciascuna provetta.

Rimuovere le provette dal magnete e aggiungere due millilitri di tampone di isolamento fresco a ciascun campione di cellule. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere le cellule e le particelle e rimettere le provette nel magnete per altri cinque minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere nuovamente il surnatante e risospendere le cellule in due millilitri di tampone di isolamento fresco, come appena dimostrato.

Quindi estrarre il monocita CD14 positivo contenente frazioni cellulari in una nuova provetta da 50 millilitri e portare il volume finale della provetta fino a 50 millilitri in DPBS sterile. Per differenziare i monociti purificati in cellule dendritiche, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 50 millilitri di DPBS. Dopo il conteggio, far girare nuovamente le cellule e risospendere il pellet a una concentrazione di 10 volte 10 per 6 per millilitro e terreno di coltura preriscaldato.

Trasferire tre millilitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e aggiungere l'interleuchina umana ricombinante quattro e il GMCSF a ciascun pozzetto per un'incubazione di 48 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il secondo giorno di coltura, ristimolare le cellule con citochine fresche e rimettere la piastra nell'incubatore. Il quinto giorno, estrarre i surnatanti e pipettare delicatamente il terreno fresco nei pozzetti più volte per raccogliere le cellule dendritiche immature.

Dopo la separazione per gradiente di densità, una tipica frazione di PBMC è composta da circa il 4% di linfociti B, il 28% di monociti e il 68% di altre cellule, di cui il 44% sono linfociti T. Dopo la separazione delle particelle magnetiche, l'analisi citofluorimetrica della frazione negativa rivela una percentuale simile di linfociti b, una percentuale più alta delle altre popolazioni cellulari e una percentuale notevolmente ridotta di monociti.

La caratterizzazione della frazione positiva dimostra l'elevata efficienza di purificazione con oltre il 99% delle cellule che esprimono CD14. Dopo cinque giorni di simulazione di Interleuchina 4 e GMCSF, le cellule CD14 positive si differenziano in cellule dendritiche CD83 negative immature derivate da monociti DC-SIGN positive che sono paragonabili alle cellule dendritiche dermiche nella morfologia, nel comportamento e nell'espressione del recettore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro o cinque ore se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i monociti dal sangue intero e differenziarli in cellule dendritiche. Questa tecnica è molto importante per i ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare non solo la funzione delle cellule dendritiche, ma anche dei monociti e dei macrofagi nel sistema cellulare umano primario in vitro. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi microscopica, la citometria a flusso, l'infezione o i saggi di presentazione dell'antigene per rispondere a domande sulla biologia delle cellule dendritiche, sulla funzione e sulle interazioni con gli antigeni.

Non dimenticare che lavorare con il sangue può essere pericoloso e che precauzioni come indossare guanti, camice da laboratorio o vaccinarsi contro l'epatite dovrebbero essere sempre prese prima di iniziare questa procedura.