Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine ​​intatte grande di 100 kDa

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare proteine intatte più grandi di 100 kilodalton in modo sensibile mediante spettrometria di massa maldi. Ciò si ottiene preparando prima le soluzioni a matrice. Il secondo passaggio consiste nel depositare la soluzione a strato sottile sul bersaglio.

Successivamente, il campione e la miscela di matrici vengono depositati sul bersaglio. Il passaggio finale consiste nell'osservare i punti del campione al microscopio. In definitiva, viene utilizzato uno spettrometro multiplo per analizzare le proteine intatte e registrare gli spettri di massa.

Il vantaggio principale della spettrometria di massa maldi rispetto ad altri approcci analitici, come l'elettro-ionizzazione a spruzzo, è che è più tollerante al sale, ai contaminanti e ai detergenti. Un altro vantaggio del maldi è che genera ioni che trasportano meno cariche rispetto all'elettrospray. Pertanto, l'acquisizione e l'interpretazione dei dati MDI è abbastanza semplice.

Per iniziare la cristallizzazione del rech, versare 10 millilitri di etanolo al 40% in una queque di Pyrex. Quindi a 600 milligrammi di una matrice utilizzando un bagno d'acqua e un riscaldatore a resistenza. Riscaldare la soluzione della matrice e mescolarla fino a quando la matrice non è completamente disciolta.

Ripetere i passaggi precedenti fino a quando la soluzione non è satura. Lasciare raffreddare lentamente la soluzione a temperatura ambiente per diverse ore, quindi conservare a quattro gradi Celsius per una notte. Se non si formano cristalli, grattare l'interno del becher appena sotto la superficie della soluzione, utilizzando una bacchetta di vetro per indurre la cristallizzazione.

Infine, raccogliere i cristalli della matrice mediante filtrazione. Sciacquare i cristalli residui nel pallone con una quantità minima di solvente ghiacciato e filtrarli. Una volta completata la filtrazione, lasciare asciugare i cristalli per pulire la piastra di destinazione maldi.

Sciacquarlo con metanolo e strofinarlo delicatamente con una salvietta kim. Quindi sciacquarlo con acqua e pulirlo con una salvietta kim. Inserire il bersaglio maldi in un becher da 600 millilitri e coprirlo con etanolo al 50%.

Quindi, sonicare il bersaglio nella soluzione di etanolo per 10 minuti in un bagno a ultrasuoni. Se sulla piastra sono rimasti dei residui, ripetere i passaggi precedenti. Sciacquare il bersaglio con metanolo o acqua, il solvente utilizzato, determina la diffusione del campione.

Quindi inclina il bersaglio in modo che tutto il liquido venga raccolto su una salvietta Kim. Asciugare il bersaglio utilizzando un flusso di azoto gassoso. Nella fase successiva, sciogliere l'alfa CHCA in acetone.

Per ottenere una soluzione satura, immergere un puntale per pipetta da 10 microlitri nella soluzione satura alfa CHCA in modo che una piccola quantità di soluzione fluisca nel puntale. Toccare rapidamente il target maldi con la punta della pipetta per depositare la soluzione alpha CHCA sul target maldi utilizzando una provetta di plastica da 1,5 millilitri. Preparare una soluzione di alfa CHCA da 20 milligrammi per millilitro sciogliendo l'alfa CHCA in un rapporto di volume da sette a tre di acetonitrile e acido formico al 5%, etichettato come soluzione alfa CHCA.

Successivamente, preparare una soluzione di DHB da 20 milligrammi per millilitro sciogliendo il DHB in un rapporto di volume da sette a tre di acetil nitrile e acido trifluoroacetico allo 0,1%, etichettato come soluzione DHB. Miscelare la soluzione alfa CHCA e la soluzione DHB in un rapporto di volume uno a uno. Per ottenere la soluzione C-H-C-A-D-H-B prima di iniziare questa procedura, un passaggio facoltativo consiste nel purificare i campioni proteici mediante scambio di tampone mostrato nel riferimento elencato.

In caso contrario, depositare un campione di proteina non purificata sul bersaglio MALDI. Quindi, depositare 0,5 microlitri del campione proteico sullo strato sottile di alfa CHCA preparato. Subito dopo, aggiungere 0,5 microlitri della soluzione C-H-C-A-D-H-B.

Depositare 0,5 microlitri dello standard Cain sulla piastra MALDI, quindi aggiungere 0,5 microlitri della soluzione di matrice. Una volta che i campioni e il caino sono stati asciugati, è possibile osservare le macchie al microscopio, inserire il bersaglio nello strumento e scegliere la configurazione appropriata dello strumento. Quindi scegliere l'intervallo appropriato tra massa e rapporto di carica.

Acquisire gli spettri del ca e calibrare lo strumento utilizzando l'intensità laser appropriata. Acquisire gli spettri dei campioni proteici. Qui è mostrata l'analisi MALDI toff della regione cromosomica intatta Mantenimento di una proteina.

La miscela C-H-C-A-D-H-B ha prodotto spettri di massa di qualità superiore in termini di rapporto segnale/rumore e sensibilità. In particolare, è stato possibile rilevare 0,5 picomoli di proteina depositati sul bersaglio MALDI, mentre la stessa quantità di proteina era appena rilevabile Utilizzando l'acido SINO NIC utilizzando la miscela C-H-C-A-D-H-B, sono stati osservati ioni con carica multipla della proteina, consentendo la determinazione della massa con maggiore precisione perché la risoluzione del picco è inversamente proporzionale al rapporto di carica master nel caso di uno strumento multi toff assiale. Inoltre, utilizzando la miscela C-H-C-A-D-H-B, il nostro metodo di scelta per la deposizione della matrice è stato l'approccio a strato sottile.

Con il metodo delle goccioline essiccate, non sono state rilevate proteine con una massa superiore a 100 kilodalton. La proteina aase beta collect monomerica è stata analizzata anche da più TOF. Gli spettri C-H-C-A-D-H-B erano migliori degli spettri dell'acido SINO NIC in termini di sensibilità e risoluzione.

Inoltre, la presenza di ioni con carica multipla ha permesso di confermare la massa della proteina con maggiore precisione. MALDI all'analisi di un'immunoglobulina intatta è mostrata qui. Gli spettri ottenuti utilizzando la miscela C-H-C-A-D-H-B erano molto più intensi degli spettri SA e alfa CHCA.

Più specificamente, i segnali proteici erano più alti e avevano una migliore risoluzione negli spettri C-H-C-A-D-H-B. L'uso della miscela C-H-C-A-D-H-B e il metodo di deposizione su strato sottile hanno dimostrato miglioramenti significativi nella qualità delle proteine intatte di grandi dimensioni. Spettri di massa acquisiti utilizzando un MALDI per strumentare.

Il protocollo presentato illustra come acquisire spettri di massa di alta qualità di proteine ad alto peso molecolare utilizzando un multi di strumenti. Durante l'esecuzione di questo tipo di analisi, tre cose sono importanti. Innanzitutto, utilizzare una soluzione di metriche appena preparata.

In secondo luogo, per depositare correttamente il campione sul bersaglio del Mali. E terzo, utilizzare l'impostazione strumentale appropriata come l'intensità del laser.