T-wave mobilità ionica-spettrometria di massa: Basic procedure sperimentali per l'analisi delle proteine ​​complesse

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare la forma complessiva dei complessi proteici. Questo risultato si ottiene acquisendo dati di mobilità ionica tramite spettrometria di massa per ioni di complessi proteici e misurando i valori di tempo di deriva per ogni stato di carica. Come secondo passaggio, si procede alla validazione delle condizioni sperimentali al fine di garantire misurazioni di mobilità per strutture proteiche native.

In seguito, i valori misurati del tempo di deriva vengono correlati alle aree della sezione trasversale. I risultati determinano i valori della sezione d'urto di proteine o complessi proteici con strutture tridimensionali sconosciute. Queste informazioni forniscono indizi sulla loro forma complessiva, sul confezionamento delle subunità e sulla topologia.

Ciao, sono Isaac Leski del Laboratorio di Mic, dipartimento di Chimica Biologica all'Istituto di Scienze Wiseman, e sono Naam Kirschenbaum, anch'io del laboratorio di mi. Oggi illustreremo una procedura per la misurazione della sezione trasversale di collisione di complessi proteici mediante spettrometria di massa ibrida e strumenti di mobilità ionica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la forma complessiva e l'organizzazione architettonica dei complessi proteici.

Iniziamo. Questa procedura si concentra sulla mobilità ionica, l'analisi mediante spettrometria di massa o IMM MS di complessi proteici. I passaggi di preparazione del campione, la calibrazione dello strumento e le procedure di ottimizzazione della spettrometria di massa e della spettrometria di massa in tandem sono descritte in un protocollo JOVE correlato.

In generale, questo protocollo prevede concentrazioni nell'ordine dei micromoli bassi del complesso in un tampone volatile come l'acetato di ammonio. Poiché vengono consumati uno o due microlitri per ogni capillare a flusso nanometrico, preparare da 10 a 20 microlitri come volume minimo per consentire l'ottimizzazione delle condizioni di spettrometria di massa. Per iniziare questa procedura, impostare l'IMMS a onda mobile o T wave Synapt sulla seguente modalità operativa: mobilità TOF, in cui le onde trifase e le pressioni sono automaticamente regolate sia per la separazione ionica tramite mobilità ionica che per la separazione tramite tempo di volo, acquisizione in ioni positivi e modalità V, impostando il percorso degli ioni attraverso il tubo di volo e riflessione; attivare tutti i gas in questo punto.

L'azoto viene utilizzato per la separazione IM e l'argon per le regioni di trappolamento e trasferimento. I valori iniziali consigliati sono un flusso gassoso di 24 millilitri al minuto per il dispositivo IMS e di 1,5 millilitri al minuto per la regione di trappolamento. Successivamente, impostare l'intervallo di acquisizione del rapporto carica/massa per un complesso proteico sconosciuto.

Utilizzare inizialmente un ampio intervallo di massa, che potrà poi essere ridotto ai valori desiderati, regolando di conseguenza il profilo dello spettrometro di massa. Per massimizzare l'efficienza di trasmissione per complessi di grandi dimensioni, l'intervallo di massa di acquisizione dovrebbe essere impostato da 1030 a 2000 MA rapporto carica e il profilo MS su auto. In caso contrario, il profilo può essere impostato in base al grafico mostrato.

Verificare l'impostazione RF e, se necessario, regolarla su valori appropriati per complessi proteici di grandi dimensioni come mostrato. Successivamente, caricare il campione, applicare la tensione capillare e una bassa pressione di flusso nanometrico. Una volta avviati gli spruzzatori, provare a ridurre la pressione di flusso nanometrico al valore minimo.

Inoltre, regolare la posizione della capillare rispetto al cono e i parametri di acquisizione dello spettrometro di massa al fine di ottenere uno spettro MS ben risolto. Ottimizzare il gradiente di pressione lungo lo strumento e il cono di campionamento, così come le impostazioni di potenziale del trappolo con polarizzazione del cono di estrazione e del trasferimento, come descritto nel protocollo JoVE associato. Sebbene questi parametri dipendano dal campione, di seguito vengono riportate le condizioni utilizzate per acquisire spettri MS di diverse masse di ferro, da complessi peptidici a complessi proteici.

Gli ioni di grandi dimensioni richiedono energie di collisione e tensioni di polarizzazione più elevate. Si raccomanda inoltre di aumentare la pressione posteriore per l'analisi di complessi proteici di grandi dimensioni, al fine di minimizzare l'attivazione del complesso. Provare a ridurre gradualmente, a passi di circa 10 volt, le tensioni di estrazione del cono del campione, del trappola cono e di polarizzazione, senza modificare la posizione del picco.

Una volta ottenuto uno spettro di massa ottimale, il tempo di deriva o il profilo di mobilità ionica devono essere regolati durante l'analisi degli assemblaggi proteici. Le condizioni ottimali per le misurazioni di massa e di mobilità sono spesso incompatibili. Pertanto, è fondamentale trovare il giusto equilibrio tra le due.

Complessivamente, il grafico della mobilità del ferro dovrebbe essere ottimizzato in modo che i picchi siano distribuiti su tutto l'intervallo di tempo di deriva e che il profilo del picco sia uniforme. L'avvicinarsi a una distribuzione a campana indica che un'elevata asimmetria del picco può essere correlata a una scarsa separazione di conformazioni multiple. La velocità dell'onda T, l'altezza dell'onda T e la portata del gas IMS possono essere regolate per ottimizzare la separazione per mobilità. L'aumento della velocità dell'onda T allarga il profilo della distribuzione del tempo di deriva.

Valori crescenti dell'altezza dell'onda T la restringono in modo simile all'aumento del flusso di gas IMS; a partire da un minimo di 10 millilitri al minuto, si osserva uno spostamento del profilo del tempo di deriva verso valori più elevati, operando così per ottimizzare lo spettro di mobilità del ferro. Fissando due delle tre variabili e ottimizzando la terza, impostare la velocità dell'onda T a 250 metri al secondo e il flusso di gas a 24 millilitri al minuto. Quindi, come punto di partenza, impostare l'altezza a tre volt e, in modo progressivo, aumentarla di un volt per volta.

Quando si utilizzano elevate tensioni di polarizzazione, si raccomanda di ridurre la pressione del gas IMS e, in questo modo, consentire la diminuzione della tensione di polarizzazione. Di conseguenza, le complesse attivazioni e dissociazioni saranno ridotte. Un effetto di arrotondamento può manifestarsi quando le condizioni non sono ottimizzate, osservato come un picco identico nella parte iniziale dello spettro dei tempi di deriva e nel bordo di coda.

Quando gli ioni non attraversano il dispositivo IAM, il loro percorso può effettivamente richiedere più tempo rispetto a quello necessario per il rilascio del successivo pacchetto di ioni di ferro nella cella di mobilità. Di conseguenza, un nuovo gruppo di ioni viene rilasciato dalla regione trappola prima che il pacchetto precedente sia stato consegnato alla regione pusher. Per eliminare questo artefatto, aumentare l'altezza dell'onda T e ridurre la velocità dell'onda T e la pressione IMS.

Inoltre, è possibile regolare il tempo di rilascio della trappia. È inoltre importante verificare che l'altezza dell'onda T di trasferimento sia impostata almeno a cinque volt, al fine di evitare perdite di ioni verso la cella IMS.

L'altezza della trappola di mobilità deve essere mantenuta ai livelli massimi. Basse velocità e alta ampiezza delle onde T di trasferimento possono portare a un'ondulazione del profilo della distribuzione del tempo di deriva. Questo artefatto si verifica quando la separazione per mobilità degli ioni non viene mantenuta durante le regioni di trasferimento e di contatto a causa di una sincronizzazione parziale tra la frequenza di spinta e la velocità dell'onda T di trasferimento.

Per eliminare questo effetto, è necessario regolare o il tempo del pusher o la velocità dell'onda T di trasferimento. Poiché la frequenza del pusher è correlata all'intervallo di massa, questo artefatto potrebbe riapparire quando questo parametro viene modificato.

L'altezza dell'onda T esercita un effetto minore. Sebbene la sua riduzione possa contribuire anche a eliminare le oscillazioni. Una volta ottimizzati i parametri sopra menzionati, i dati IMMS possono essere acquisiti per ottenere una risoluzione elevata.

I complessi proteici MS.Peaks sono spesso attivati all'interno dello spettrometro di massa per favorire la rimozione dell'acqua residua e dei componenti del tampone. Tuttavia, se l'energia di attivazione supera un valore soglia, può verificarsi un parziale svolgimento che forma multipli stati intermedi, i quali difficilmente corrispondono alla struttura nativa nello stato in soluzione. Di conseguenza, il picco del tempo di deriva può spostarsi e allargarsi, riflettendo la popolazione eterogenea di strutture svolte.

Per ottenere dati relativi al tempo di deriva coerenti con le strutture in fase soluzione, è essenziale controllare attentamente le tensioni utilizzate per accelerare gli ioni prima della separazione mediante IM; pertanto, aumentare in modo progressivo la tensione del capillare e del cono, monitorando l'effetto sullo spettro del tempo di deriva. Inoltre, per ottenere una risoluzione MS elevata, è preferibile aumentare la tensione di trasferimento piuttosto che quella del trappolamento. Il dispositivo IM è posizionato per primo, seguito dalla regione di trasferimento e dall'analizzatore TOF.

Poiché l'attivazione segue la misurazione IM, i dati rimangono invariati per IM, mentre l'accuratezza di MS può essere aumentata per garantire che l'acquisizione dei dati avvenga in condizioni che mantengono la struttura nativa del complesso; è quindi importante raccogliere dati su un intervallo di condizioni sperimentali e di soluzione piuttosto che attenersi a un singolo insieme ottimizzato di parametri. Per questo motivo, aumentare in modo graduale la tensione di collisione nel trappolo e acquisire dati a intervalli di 10 volt, monitorando l'effetto sul profilo di mobilità dell'ione. Infine, per identificare le conformazioni svolte e valutare i dati acquisiti, indurre manualmente la dissociazione del complesso proteico titolando il campione con acido acetico su un intervallo di pH compreso tra 2 e 7, registrare i dati e procedere all'analisi dei dati nel sistema T wave IMS, determinando le aree trasversali mediante un approccio di calibrazione del tempo di deriva, utilizzando proteine Cain con valori di sezione d'urto noti.

Preparare innanzitutto soluzioni proteiche denaturate del campione a 10 micromolari ciascuna. Utilizzare citocromo C equino, mioglobina del cuore equino e ubiquitina bovina in rapporto volumetrico 49:49:0,2 di acqua, metanolo e acido acetico. Successivamente, acquisire i dati IMMS per le proteine del campione nelle esatte stesse condizioni strumentali utilizzate per la proteina bersaglio o il complesso proteico, mantenendo tutti i valori di tensione e pressione identici per preservare le condizioni di separazione IM.

Dopo aver acquisito i dati, estrarre il valore sperimentale del tempo di deriva per ogni carica. Correggere ciascun tempo di deriva calibrato T' D delle proteine Cain utilizzando l'equazione seguente, in cui MOVZ è il rapporto di carica principale dell'ione osservato e C è il coefficiente di ritardo del ciclo di lavoro potenziato EDC. Il suo valore, tipicamente compreso tra 1,4 e 1,6, dipende dallo strumento.

Il valore EDC è indicato all'interno delle impostazioni di acquisizione del sistema, nella scheda di configurazione dell'acquisizione, correggendo ciascuna delle sezioni d'urto per lo stato di carica del ferro e per la massa ridotta. Dove omega C è la sezione d'urto corretta, omega è la sezione d'urto letteraria, Z è lo stato di carica del ferro, M è il peso molecolare dell'ione cationico e MG è il peso molecolare del ferro.

Gas di fondo, che tipicamente è azoto, plop il piano di T primo D contro il piano di omega C. La curva risultante corrisponde all'equazione seguente. I parametri X e A possono essere estratti adattando il grafico a una relazione lineare. La pendenza X corrisponde al fattore di proporzionalità esponenziale, e A rappresenta la costante determinata dall'adattamento.

Calcolare il coefficiente di correlazione del fit, R quadro. I valori accettabili di R quadro sono superiori a 0,95. Un valore più basso del coefficiente di correlazione può essere dovuto a un'apertura incompleta della proteina o all'invecchiamento del campione.

Condizioni sperimentali diverse utilizzate per proteine di calibro differente, spettro rumoroso e elaborazione incompleta dei dati o errore di calcolo. Correggere il tempo di drift del calcio utilizzando il fattore esponenziale X determinato e convalidare i calcoli riproducendo graficamente omega C rispetto a T primo D. Ridefinire nuovamente il coefficiente di correlazione. Sono attesi valori superiori a 0,95, in modo analogo ai passaggi descritti in precedenza; correggere il tempo di drift misurato della proteina bersaglio o del complesso proteico e calibrare il tempo di drift della proteina bersaglio o del complesso proteico utilizzando il fattore esponenziale X calcolato. Calcolare omega della proteina bersaglio o del complesso proteico utilizzando la costante A determinata dal fit, dove omega è uguale ad a TD. Ripetere questi passaggi per ogni condizione sperimentale.

Quando si definisce l'area della sezione trasversale della proteina o del complesso proteico sconosciuto, si raccomanda di ripetere ogni esperimento almeno tre volte e di determinare la deviazione standard di queste misurazioni triplicate una volta ottenuti i valori della sezione d'urto. Vengono impiegati approcci di modellizzazione al fine di prevedere la topologia o la disposizione del complesso. Questo viene effettuato confrontando i valori sperimentali della sezione d'urto con i valori Omega calcolati in silico a partire da strutture modello generate. Nel complesso, questo campo è ancora agli inizi e sono necessari ulteriori sviluppi per rendere questo approccio generico e applicabile a un'ampia gamma di complessi.

Viene mostrata qui la rappresentazione superficiale della forma tetramerica dell'emoglobina bovina. Il complesso trasportatore di ossigeno emoglobina può servire come esempio per l'approccio menzionato sopra. L'emoglobina è un complesso proteico tetramerico composto da due subunità alfa e due subunità beta, colorate rispettivamente in blu e rosso, che formano un dimero di dimeri alfa-beta.

Lo spettro IMMS dell'emoglobina è mostrato qui. Lo spettro IM ms acquisito del complesso rivela una distribuzione principale di serie di cariche corrispondente al complesso integro e serie di cariche minori, che corrispondono alle masse del dimero alfa-beta e delle subunità monomeriche alfa e beta. Qui sono mostrati il CCS teorico e misurato delle diverse forme dell'emoglobina.

I valori di tempo di deriva ottenuti per diversi stati di carica delle forme dimere e tetramere sono stati utilizzati per calcolare i valori di omega. Questi sono stati confrontati con i valori teorici. Poiché un complesso tetramerico presenta tre possibili modalità di associazione, ovvero impacchettamenti ciclici, diedrici o a catena.

Calcolando l'aumento dell'omega passando da un dimero a un tetramero, è possibile prevedere l'organizzazione strutturale. Studi precedenti e i nostri esperimenti hanno mostrato una forte correlazione tra i ccss misurati e le aree superficiali delle proteine derivate da dati strutturali cristallini. Questa correlazione può essere utilizzata per calcolare l'aumento previsto dell'area superficiale di un tetramero rispetto a un dimero per le diverse forme di impacchettamento.

Questo viene fatto considerando ogni subunità come un oggetto asferico. Un assemblaggio di tipo a catena raddoppierà circa la CCS del tetramero, mentre un impacchettamento di tipo C4 o D2 produrrà un aumento rispettivamente di circa 1,5 e 1,67. Il rapporto calcolato tra i valori di CCS misurati per le forme tetramerica e DME dell'emoglobina è risultato pari a 1,57 ± 0,03.

Questo numero illustra che la struttura nativa non è organizzata in modo lineare, ma è disposta in una forma più compatta, come un tetramero ciclico o diedrale. Ripetendo lo stesso calcolo sulla struttura cristallina risolta dell'emoglobina, il rapporto tra le aree superficiali delle forme tetramerica e DME era 1,63, valore compatibile con una simmetria D due. Ovviamente, questo modello geometrico era semplificato e le subunità proteiche non sono semplicemente sferiche.

Tuttavia, questo calcolo dimostra il potenziale entusiasmante che l'IMMS offre nel rivelare la disposizione di complessi con strutture ad alta risoluzione sconosciute. Vi ho appena mostrato come misurare il tempo di deriva della proteina e dei complessi proteici e come calcolare i loro valori di sezione efficace di collisione. Quando si esegue questa procedura, è importante acquisire i dati di IMMS per le proteine di calibrazione utilizzando esattamente le stesse condizioni impiegate per la proteina bersaglio o i complessi proteici.

Inoltre, raccomandiamo vivamente di ripetere almeno tre volte questi esperimenti e di determinare la deviazione standard di queste misurazioni triplicate. È tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.