T-wave mobilità ionica-spettrometria di massa: Basic procedure sperimentali per l'analisi delle proteine ​​complesse

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare la forma complessiva dei complessi proteici. Ciò si ottiene acquisendo dati di mobilità del ferro per spettrometria di massa per gli ioni del complesso proteico e misurando i valori del tempo di deriva di ogni stato di carica. Come seconda fase, le condizioni sperimentali vengono convalidate al fine di garantire misure di mobilità delle strutture proteiche native.

Successivamente, i valori del tempo di deriva misurati sono correlati con le aree della sezione trasversale. I risultati determinano i valori della sezione d'urto di collisione di proteine o complessi proteici con strutture tridimensionali sconosciute. Queste informazioni forniscono indizi sulla loro forma complessiva, sull'impacchettamento delle subunità e sulla topologia.

Ciao, sono Isaac Leski del laboratorio di Mic, dipartimento di chimica biologica presso il Wiseman Institute of Sciences, e sono Naam Kirschenbaum anche lui del laboratorio di mi. Oggi mostreremo una procedura di misurazione di complessi proteici con sezione trasversale di collisione utilizzando strumenti di spettrometria di massa ibrida e mobilità del ferro. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la forma complessiva e l'organizzazione dei complessi proteici.

Quindi iniziamo. Questa procedura si concentra sulla mobilità del ferro, sulla spettrometria di massa o sull'analisi IMM MS dei complessi proteici. Le fasi di preparazione del campione, la calibrazione dello strumento e le procedure di ottimizzazione MS e MS tandem sono illustrate in un protocollo JO correlato.

In generale, questo protocollo prevede basse concentrazioni micromolari di complesso in un tampone volatile come l'acetato di ammonio. Dato che vengono consumati da uno a due microlitri per capillare a flusso nanometrico, preparare da 10 a 20 microlitri come volume minimo per consentire l'ottimizzazione delle condizioni di MS. Per iniziare questa procedura, impostare l'onda viaggiante o l'onda T synap IMMS sulle seguenti modalità di funzionamento mobilità tof in cui la tri onda e le pressioni sono impostate automaticamente sia per IM che per il tempo di separazione del volo degli ioni, l'acquisizione di ioni positivi e la modalità V, impostando il percorso degli ioni attraverso il tubo di volo e la riflessione attiva tutti i gas qui.

L'azoto viene utilizzato per la separazione IM e l'argon per le regioni di trappola e trasferimento. I valori iniziali consigliati sono un flusso di gas di 24 millilitri al minuto per il dispositivo IMS e 1,5 millilitri al minuto per la regione della trappola. Quindi, impostare l'intervallo di acquisizione del rapporto di carica dell'albero per un complesso proteico sconosciuto.

Utilizzare inizialmente un ampio intervallo di massa, che può poi essere ridotto ai valori desiderati, regolare il profilo MS di conseguenza. Per la massima efficienza di trasmissione per complessi di grandi dimensioni, l'intervallo di massa di acquisizione deve essere impostato da 1030 a 2000 MA e il profilo MS su auto. In caso contrario, il profilo può essere impostato in base alla tabella visualizzata.

Controllare l'impostazione RF e, se necessario, regolare i valori appropriati per i complessi proteici di grandi dimensioni, come mostrato. Quindi, caricare il campione, applicare la tensione capillare e la bassa pressione di flusso nano. Una volta avviati gli spruzzi, cercare di ridurre la pressione del flusso nano a un valore minimo.

Inoltre, regolare la posizione del capillare rispetto al cono, regolare i parametri di acquisizione MS per acquisire uno spettro MS ben risolto. Ottimizza il gradiente di pressione lungo lo strumento e il cono di campionamento, nonché le potenziali impostazioni della trappola di polarizzazione del cono di estrazione e trasferiscile come descritto nel protocollo JoVE associato. Sebbene questi parametri siano mostrati in base al campione, ecco le condizioni utilizzate per acquisire gli spettri MS di varie masse di ferro dai complessi peptidici a quelli proteici.

Gli ioni di grandi dimensioni richiedono energie di collisione e tensione di polarizzazione più elevate. Si raccomanda inoltre di aumentare la contropressione per l'analisi di complessi proteici di grandi dimensioni per ridurre al minimo l'attivazione del complesso. Provare a ridurre gradualmente in incrementi di circa 10 volt, l'estrazione del cono del campione, la trappola del cono e le tensioni di polarizzazione senza modificare la posizione del picco.

Una volta ottenuto uno spettro di massa ottimale, il tempo di deriva o il profilo IM devono essere regolati durante l'analisi degli assemblaggi proteici. Le condizioni ottimali per le misurazioni della massa e della mobilità sono spesso incompatibili. Pertanto, è importante trovare il giusto equilibrio tra i due.

Nel complesso, il grafico della mobilità del ferro dovrebbe essere ottimizzato in modo tale che i picchi siano distribuiti sull'intero intervallo di tempo di deriva e il profilo dei picchi sia uniforme. Avvicinarsi a una distribuzione gian Una significativa asimmetria di picco può essere correlata a una scarsa separazione di più conformazioni La velocità dell'onda T, l'altezza dell'onda T e la portata del gas IMS possono essere regolate per ottimizzare la separazione della mobilità. L'aumento della velocità dell'onda T amplia il profilo di distribuzione del tempo di deriva.

Mentre l'aumento dei valori di altezza dell'onda T si restringe, allo stesso modo, l'aumento del flusso di gas IMS a partire da un minimo di 10 millilitri al minuto sposta il profilo del tempo di deriva verso valori più alti per ottimizzare lo spettro di mobilità del ferro. Fissando due delle tre variabili e ottimizzando la terza, impostare la velocità dell'onda T a 250 metri al secondo e il flusso di gas a 24 millilitri al minuto. Quindi, come punto di partenza, impostare l'altezza a tre volt e, in modo graduale, aumentarla con incrementi di un volt.

Quando si utilizzano tensioni di polarizzazione elevate, si consiglia di ridurre la pressione del gas IMS e in questo modo consentire la diminuzione della tensione di polarizzazione. Di conseguenza, l'attivazione e la dissociazione dei complessi saranno ridotte. Un effetto di rollover può apparire quando le condizioni non sono ottimizzate, osservato come un picco identico nella prima parte dello spettro dei tempi di deriva e del bordo di coda.

Quando gli ioni non attraversano il dispositivo IAM, effettivamente il loro viaggio può richiedere più tempo del tempo necessario per il successivo rilascio del pacchetto di ferro nella cella di mobilità. Di conseguenza, un nuovo gruppo di ioni viene rilasciato dalla regione della trappola prima che il pacchetto precedente sia stato consegnato alla regione dello spintore. Per eliminare questo artefatto, aumentare l'altezza dell'onda T e diminuire la velocità dell'onda T e la pressione IMS.

Inoltre, il tempo di rilascio della trappola può essere regolato. Inoltre, è importante verificare che l'altezza dell'onda T di trasferimento sia impostata su almeno cinque volt. Anche per evitare la fuoriuscita di ioni verso la cella IMS.

L'altezza della trappola per la mobilità deve essere mantenuta ai massimi livelli. La bassa velocità e l'elevata ampiezza delle onde T di trasferimento possono portare all'increspatura del profilo di distribuzione temporale della deriva. Questo artefatto si verifica quando la separazione della mobilità degli ioni non viene mantenuta attraverso il trasferimento e le regioni dure a causa della parziale sincronizzazione tra la frequenza di pusha e la velocità dell'onda T di trasferimento.

Per eliminare questo effetto, è necessario regolare il tempo di spinta o la velocità dell'onda T di trasferimento. Poiché la frequenza di pusha è correlata all'intervallo di massa, questo artefatto potrebbe riapparire. Quando questo parametro viene modificato.

L'altezza dell'onda T esercita un effetto minore. Anche se la sua riduzione può anche aiutare a eliminare le increspature. Una volta ottimizzati i parametri di cui sopra, i dati IMMS possono essere acquisiti per ottenere un'elevata risoluzione.

ms. I complessi proteici Peaks sono spesso attivati all'interno dello spettrometro di massa per promuovere lo stripping dell'acqua residua e dei componenti tampone. Tuttavia, se l'energia di attivazione viene aumentata oltre un valore di soglia, può verificarsi uno sviluppo parziale che forma più stati intermedi, che è improbabile che corrispondano alla struttura dello stato della soluzione nativa. Di conseguenza, il picco temporale di deriva può essere spostato e ampliato riflettendo la popolazione idrogena di strutture dispiegate.

Al fine di ottenere dati sul tempo di deriva coerenti con le strutture della fase della soluzione, è essenziale controllare attentamente le tensioni utilizzate per accelerare gli ioni prima della separazione IM, quindi aumentare la tensione capillare e del cono in modo graduale, monitorando l'effetto sullo spettro del tempo di deriva. Inoltre, per un'elevata risoluzione MS, è preferibile aumentare la tensione di trasferimento piuttosto che quella di trappola. Il dispositivo IM viene posizionato per primo, seguito dalla regione di trasferimento e dall'analizzatore TOF.

Poiché l'attivazione segue la misurazione IM e rimane inalterata per l'IM, mentre l'accuratezza MS può essere aumentata per garantire che l'acquisizione dei dati venga eseguita in condizioni che mantengano la struttura nativa del complesso, è importante raccogliere dati su una gamma di condizioni sperimentali e di soluzione piuttosto che aderire a un singolo set ottimizzato di parametri. Per questo motivo, aumentare la tensione di collisione della trappola in modo graduale e acquisire dati a intervalli di 10 volt monitorando l'effetto sul profilo di mobilità del ferro. Infine, per identificare le conferme dispiegate e valutare i dati acquisiti, indurre manualmente la dissociazione del complesso proteico titolando il campione con acido acetico in un intervallo di pH da due a sette e registrare i dati, procedere all'analisi dei dati nel sistema IMS a onde T, le aree della sezione trasversale definite da un approccio di calibrazione del tempo di deriva, utilizzando proteine Caino con valori di sezione d'urto noti.

Per prima cosa, preparare soluzioni proteiche di calibro denaturato a 10 micromolari ciascuna. Utilizzare citocromo C equino di cavallo, mioglobina cardiaca e ubiquitina bovina in 49, 49 0,2 rapporto in volume acqua, metanolo, acido acetico. Successivamente, acquisire i dati IMMS per le proteine del calibro esattamente nelle stesse condizioni dello strumento utilizzato per la proteina bersaglio o il complesso proteico, mantenere tutti i valori di tensione e pressione identici per preservare le impostazioni di separazione IM.

Dopo aver acquisito i dati, estrarre il valore del tempo di deriva sperimentale per ogni carica. Le proteine dello stato di Caino correggono ciascuno dei tempi di deriva del calibro T primo D utilizzando la seguente equazione dove MOVZ è il rapporto di carica principale dello ione osservato e C è il coefficiente di ritardo EDC del ciclo di lavoro potenziato. Il suo valore, tipicamente compreso tra 1,4 e 1,6, dipende dallo strumento.

Il valore EDC è indicato all'interno delle impostazioni di acquisizione del sistema, una scheda di configurazione dell'acquisizione, corregge ciascuna delle sezioni trasversali del calibro sia per lo stato di carica del ferro che per la massa ridotta. Dove omega C è la sezione d'urto corretta, omega è la sezione d'urto della letteratura Z è la carica di ferro. Lo stato M è il peso molecolare dello ione caino e MG è il peso molecolare del ferro.

Gas di fondo, che è tipicamente azoto plop thelan di T primo D contro thelan di omega C.La curva risultante corrisponde alla seguente equazione. I parametri X e A possono essere estratti adattando il grafico a una relazione lineare. La pendenza X corrisponde al fattore di proporzione esponenziale e A rappresenta la costante determinata dall'adattamento.

Calcolare il coefficiente di correlazione di adattamento R al quadrato. I valori accettabili per R al quadrato sono maggiori di 0,95. Un valore del coefficiente di correlazione più basso può essere dovuto al dispiegamento incompleto della proteina, all'invecchiamento del campione.

Condizioni sperimentali dissimili utilizzate per le diverse proteine di calibro, spettro rumoroso ed elaborazione incompleta dei dati o errore di calcolo. Correggi il tempo di deriva ca utilizzando il fattore esponenziale X determinato e convalida i tuoi calcoli riassegnando omega C rispetto a T primo D.Definisci nuovamente il coefficiente di correlazione. Valori superiori a 0,95 sono da aspettarsi in modo simile ai passaggi descritti in precedenza, correggere il tempo di deriva misurato della proteina bersaglio o del complesso proteico e calibrare il tempo di deriva della proteina bersaglio o del complesso proteico utilizzando il fattore esponenziale X.Calcolare l'omega della proteina bersaglio o del complesso proteico utilizzando la costante determinata dall'adattamento A dove omega è uguale a un TD. Ripetere questi passaggi per ogni condizione sperimentale.

Quando si definisce l'area della sezione trasversale della proteina o del complesso proteico sconosciuto, si raccomanda di ripetere ogni esperimento almeno tre volte e di determinare la deviazione standard di queste misurazioni triplicate una volta determinati i valori della sezione trasversale di collisione. Gli approcci di modellazione sono impiegati per prevedere la topografia o le disposizioni del complesso. Ciò viene fatto inserendo i valori sperimentali della sezione d'urto di collisione all'interno dei valori Omega in silico calcolati dalle strutture del modello generate nel complesso, questo campo è ancora nei suoi primi anni e sono necessari ulteriori sviluppi per rendere questo approccio generico e applicabile a un'ampia gamma di complessi.

Qui viene mostrata la rappresentazione superficiale della forma tetramerica dell'emoglobina bovina. Il complesso dell'emoglobina trasportatore di ossigeno può fungere da esempio per l'approccio sopra menzionato. L'emoglobina è un complesso proteico tetramerica composto da due subunità alfa e due beta, colorate rispettivamente di blu e rosso, che formano un dimero di alfa beta dimeri.

Lo spettro IMMS dell'emoglobina è mostrato qui. Lo spettro IM ms acquisito del complesso rivela una distribuzione di serie di carica maggiore corrispondente al complesso intatto e alla serie di carica minore, che si adatta alle masse del dimero alfa beta e delle subunità monomeriche alfa e beta. La CCS teorica e misurata delle diverse forme di emoglobina è mostrata qui.

Per calcolare i valori omega sono stati utilizzati i valori del tempo di deriva recuperati per diversi stati di carica delle forme dimeriche e tetrameriche. Questi sono stati confrontati con i valori teorici. Dato che un complesso tetramerica ha tre possibilità di associazione: diedro ciclico o impacchettamento a catena.

Calcolando l'aumento di omega quando si passa da un dimero a un tetramero, è possibile prevedere l'organizzazione strutturale. Studi precedenti e i nostri esperimenti hanno mostrato una forte correlazione tra la ccss misurata e le aree superficiali delle proteine derivate da dati strutturati in cristallo. Questa correlazione può essere utilizzata per calcolare l'aumento atteso della superficie di un tetramero rispetto a un dimero per le diverse forme di impacchettamento.

Questo viene fatto considerando ogni oggetto asferico di subunità. Un assemblaggio a catena aumenterà il CCS del tetramero di circa il doppio, mentre un C quattro o D due produrranno un aumento rispettivamente di circa 1,5 e 1,67. Il rapporto calcolato tra i valori misurati di CCS delle forme tetramerica e DME dell'emoglobina era 1,57 più o meno 0,03.

Questo numero illustra che la struttura nativa non è organizzata linearmente, ma è disposta in una forma più compatta, sia come tetramero ciclico che diedro. Ripetendo lo stesso calcolo sulla struttura cristallina risolta dell'emoglobina, il rapporto tra le aree superficiali delle forme tetrameriche e quelle DME era 1,63, che si adatta a una simmetria D due. Ovviamente, questo modello geometrico è stato semplificato e le subunità proteiche non sono meramente sferiche.

Tuttavia, questo calcolo dimostra l'eccitante potenziale di IMMS per rivelare l'impacchettamento di complessi con strutture ad alta risoluzione sconosciute. Ti ho appena mostrato come misurare il tempo di deriva della proteina e i complessi proteici comportano come calcolare i valori della loro sezione d'urto di collisione. Quando si esegue questa procedura, è importante acquisire i dati IMMS per le proteine del calibro utilizzando le stesse identiche condizioni utilizzate per la proteina bersaglio o i complessi proteici.

Inoltre, si consiglia vivamente di ripetere almeno tre volte questi esperimenti e di determinare la deviazione standard di queste misurazioni triplicate. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.