Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

La microscopia a fotoni multipli di tessuti fissati è normalmente limitata a profondità di penetrazione di appena alcune centinaia di micron. Abbiamo recentemente dimostrato il primo utilizzo della microscopia a fotoni multipli a profondità di diversi millimetri all'interno di organi di topo fissati, mediante chiarificazione ottica con una soluzione di alcol benzoico e benzoato di benzile. Nella nostra dimostrazione iniziale, la tecnica ha permesso di immaginare la fluorescenza intrinseca del tessuto.

Tuttavia, cresce l'interesse nell'uso di metodi di chiarificazione ottica su tessuti che esprimono proteine fluorescenti come la GFP. Presentiamo qui un protocollo per la microscopia a fotoni multipli di tessuto cerebrale chiarificato, utilizzando la stessa soluzione di alcol benzoilico che preserva la fluorescenza della proteina fluorescente gialla espressa da un promotore nel cervello del mouse. L'imaging ad alta risoluzione di interi organi di topo mediante microscopia a fotoni multipli diventa possibile grazie alla chiarificazione ottica dell'organo prima dell'acquisizione delle immagini, senza chiarificazione. Multiphoton.

L'acquisizione di immagini del cervello è limitata a 300 micron sotto la superficie del tessuto a causa degli effetti di scattering della luce causati dalle differenze tra gli indici di rifrazione dell'acqua e delle proteine che compongono il tessuto cerebrale. Per superare questo limite, l'organo viene disidratato e l'acqua è sostituita con un fluido che ha un indice di rifrazione simile a quello delle proteine costitutive del tessuto. Questo processo di chiarificazione ottica contribuisce a ridurre notevolmente lo scattering della luce, consentendo un'acquisizione d'immagini migliore a maggiori profondità sotto la superficie del tessuto.

Le immagini di Batta et al. dimostrano come questa tecnica possa essere applicata per visualizzare l'istologia di diversi organi di topo utilizzando la fluorescenza intrinseca e la generazione di armonica secondaria. Questa prima immagine mostra il testicolo del topo, acquisita a 1,4 millimetri sotto la superficie del tessuto. L'elevata risoluzione della microscopia a fotoni multipli ci consente di effettuare uno zoom e ottenere una visione chiara delle singole cellule spermatiche in formazione nei tubuli seminiferi.

Come mostrato all'estrema destra, presentiamo un'immagine del polmone di topo, acquisita anche essa a 1,4 millimetri sotto la superficie del tessuto. Questa immagine dimostra un'acquisizione multiphoton a due canali in cui i componenti dell'elastina sono marcati in rosso mentre il collagene è marcato in verde; ingrandendo, singoli oli sono facilmente distinguibili. Infine, mostriamo immagini ad alta risoluzione delle regioni interne del cervello del topo, acquisite a 850 micron sotto la superficie del tessuto. Ingrandendo la neocorteccia e l'ippocampo del cervello, singoli astrociti e corpi cellulari neuronali possono essere chiaramente visibili.

Tuttavia, quando si trattano organi resi otticamente trasparenti che possono contenere proteine fluorescenti come la YFP, il protocollo di chiarificazione ottica di badra non preserva affatto il segnale fluorescente di queste proteine. Il protocollo qui presentato rappresenta un nuovo approccio per eseguire la chiarificazione ottica e l'immagine dell'intero organo di cervello di topo, preservando al contempo il segnale fluorescente della YFP e dei neuroni, disidratando il cervello mediante una serie graduata di etanolo e procedendo alla chiarificazione con una soluzione uno a due di alcol benzilico e benzoato, noto anche come BAB, che si è dimostrata in grado di ridurre i danni alle proteine fluorescenti e di preservarne il segnale. Per l'immagine a fotoni multipli, i topi esprimenti YFP vengono innanzitutto pesati e quindi anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina.

Deve essere confermata una profondità chirurgica di anestesia prima di procedere all'intervento chirurgico. L'animale deve essere controllato ogni cinque minuti per verificare se reagisce a una forte pizzicatura dell'alluce o della coda. Se l'animale reagisce, è necessaria una dose supplementare di chetamina e xilazina.

Dopo l'anestesia, i topi vengono mantenuti in posizione supina fissando ogni arto a un lettino chirurgico con nastro adesivo da laboratorio, in modo da esporre il torace per l'intervento. Per iniziare, si pratica un'incisione al di sotto del processo xifoidale per effettuare un taglio lungo la base della gabbia toracica utilizzando forbici e pinzette per tirare indietro la pelle durante il taglio; successivamente vengono effettuate due incisioni lungo i lati dello sterno del topo per creare un lembo di tessuto che viene tenuto sollevato dalla cavità toracica mediante un emostatico, lasciando così il cuore esposto. Successivamente, un ago da 23 gauge viene inserito nel ventricolo sinistro del cuore e viene praticata una piccola incisione nella parete muscolare dell'atrio destro per permettere al sangue di defluire. Immediatamente dopo aver inciso l'atrio destro, si inizia una perfusione con soluzione salina tamponata al fosfato a quattro gradi Celsius finché non cessa il deflusso di sangue dall'atrio destro.

Durante la perfusione, si utilizza una pompa peristaltica impostata su una potenza di pompaggio tale da espellere il liquido a una distanza di 1,5-5 cm dalla punta dell'ago. Una volta drenato tutto il sangue, il mezzo di perfusione viene sostituito con una soluzione di paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius, fino a quando il corpo del topo diventa visibilmente rigido e rigido. Al termine della perfusione, il topo viene rimosso dal lettino chirurgico e decapitato per iniziare l'escissione del cervello utilizzando pinze e forbici per iridectomia.

Il cranio viene rimosso in piccole sezioni partendo dalla parte posteriore e procedendo verso l'anteriore. Vengono effettuati piccoli tagli ogni due-quattro millimetri con le forbici lungo il cranio, mentre con la pinza si estrae con cura l'osso dal cervello in piccole sezioni, fino a quando l'intera superficie superiore del cervello risulta esposta. Il cervello viene quindi escisso dal cranio utilizzando una spatola chirurgica e trasferito in una provetta di vetro contenente paraformaldeide al 4% per la fissazione, che dura sei ore.

Sebbene in questa dimostrazione ci concentriamo principalmente sull'immagine del cervello di topo che esprime YFP, procederemo anche con la chiarificazione ottica di un topo, di una zampa posteriore e di un tratto di intestino tenue, al fine di mostrare al meglio le capacità di chiarificazione di questo metodo. Dopo la fissazione post-operatoria, il cervello e gli altri tessuti vengono lavati due volte in PBS. I campioni di tessuto vengono quindi disidratati a temperatura ambiente mediante una serie di incubazioni in etanolo alle concentrazioni del 50%, 70%, 90% e 100%.

Ogni incubazione dura due ore e successivamente un'altra. Viene effettuata un'incubazione con etanolo al 100% per 12 ore al fine di estrarre in modo efficiente l'acqua dal tessuto fissato. Dopo la disidratazione, l'ultima soluzione di etanolo al 100% viene eliminata e i campioni di tessuto vengono immersi in una soluzione uno a uno di etanolo e BAB per due ore prima di essere posti nella soluzione chiara al 100% di BAB.

Una volta immersi nel BAB, i campioni cerebrali e di altri tessuti diventano visibilmente trasparenti entro quattro o cinque ore. Qui mostriamo un video time-lapse delle prime sei ore del processo di chiarificazione ottica. Il segno di salto indica il momento in cui la soluzione uno a uno di etanolo e BAB è stata sostituita con una soluzione al 100% di BAB.

Dopo sei ore, tutti gli organi mostrano segni di trasparenza; ad esempio, l'osso della zampa posteriore del topo è ora chiaramente visibile per ottenere i migliori risultati di chiarificazione. Il cervello deve essere lasciato a chiarificare per sei giorni a temperatura ambiente, protetto dalla luce intensa. Una volta che il cervello è stato chiarificato e pronto per l'acquisizione delle immagini, viene fissato al fondo della piastra di Petri utilizzando colla acrilica Sano o colla istantanea.

Dopo che la colla si è asciugata, il cervello viene immerso nel BAB e la piastra è posizionata sotto l'obiettivo per l'acquisizione delle immagini. Per l'acquisizione, utilizziamo un microscopio a multiphoton che incorpora un laser al titanio-saffio MI tie, regolabile su una lunghezza d'onda di eccitazione compresa tra 710 e 990 nanometri. La lunghezza d'onda di eccitazione utilizzata per generare i segnali YFP è di 886 nanometri.

Il segnale fluorescente riflesso viene quindi acquisito utilizzando un obiettivo NIK icon da 5x che consente l'acquisizione con un ampio campo visivo. Il segnale fluorescente riflesso viene filtrato mediante un filtro passa-banda 535/50 e raccolto utilizzando un fotomoltiplicatore ad alta efficienza quantistica. Le immagini da Multiplier due di OMA Matsu vengono elaborate mediante il software ScanImage a una risoluzione di 2048 per 2048 pixel, utilizzando una velocità di scansione di due millisecondi per riga, al fine di generare immagini ad alta risoluzione di YFP.

Al termine dell'acquisizione delle immagini, il cervello viene rimosso dalla piastra P due e conservato in BAB, al riparo dalla luce, per successive acquisizioni. Le immagini e i video rappresentativi qui mostrati dimostrano la capacità di imaging multiphoton ad alta risoluzione resa possibile dalla chiarificazione ottica. L'imaging dell'intero cervello permette di visualizzare chiaramente i neuroni marcati con YFP nei diversi strati dell'ippocampo e della neocorteccia, fino a una profondità di due millimetri sotto la superficie del tessuto.

Qui mostriamo un video di uno stack di immagini di 1,2 millimetri di un intero preparato del cervello, acquisito da 0,8 a due millimetri all'interno del cervello per rivelare i diversi strati anatomici dell'ippocampo. Di seguito è riportata un'immagine rappresentativa di una sezione coronale a 1,94 millimetri, denominata Bergman, ottenuta dallo stack di immagini profondo due millimetri, in cui i diversi strati dell'ippocampo sono stati etichettati. Eseguendo uno zoom sulla neocorteccia, le singole assoni e i corpi cellulari neuronali dei neuroni della sesta strato della neocorteccia risultano chiaramente distinguibili fino a 1,02 millimetri al di sotto della superficie del tessuto.

Qui mostriamo un'immagine di uno stack di neuroni del quinto strato, acquisita tra 700 e 1020 micron sotto la superficie del tessuto. Di seguito è riportata un'immagine rappresentativa di tale stack, ottenuta a 774 micron di profondità nel cervello. Utilizzando lo stesso stack di immagini, è stata realizzata una ricostruzione tridimensionale della regione neuronale mediante il software Image J.

La capacità di alta risoluzione della microscopia multi-bot ci permette inoltre di presentare immagini di singoli neuroni completi. Qui mostriamo una ricostruzione di un neurone del quinto strato della neocorteccia in cui i processi dendritici sono chiaramente visibili. Questo conclude la nostra presentazione della chiarificazione ottica e del topo intero che esprime YFP.

La realizzazione di questa tecnica è relativamente semplice e, come abbiamo mostrato, può essere utilizzata per visualizzare e acquisire immagini di molte diverse regioni e strutture della zampa del topo. Grazie per aver guardato e buona fortuna.