Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Microscopio multifotone di organi topo intero è possibile otticamente deselezionando l'organo prima di imaging, ma non tutti i protocolli di preservare il segnale fluorescente di proteine ​​fluorescenti. L'utilizzo di un metodo ottico di compensazione con etanolo a base di disidratazione e alcol benzilico: benzil benzoato di compensazione, mostriamo immagini ad alta risoluzione multiphoton di cervello di topo che esprime tutta la YFP.

La microscopia multifotone di tessuti fissi è normalmente limitata a profondità di penetrazione ridotte di poche centinaia di micron. Recentemente abbiamo dimostrato il primo utilizzo della microscopia multifotone fino a diversi millimetri di profondità in organi di topo fissati utilizzando la pulizia ottica con la soluzione di benzo alcol e benzoilbenzoato. La nostra dimostrazione iniziale, la tecnica ha ripreso la fluorescenza intrinseca dei tessuti.

Tuttavia, c'è un crescente interesse nell'uso di metodi di chiarificazione ottica con tessuti che esprimono proteine fluorescenti come la GFP. Qui presentiamo un protocollo per la microscopia multifotonica di tessuto cerebrale ripulito con la stessa soluzione di benzo alcol che preserva la fluorescenza della proteina fluorescente gialla espressa dalla coscia. Un promotore nel cervello di topo L'imaging ad alta risoluzione dell'intero organo di topo mediante microscopia multifotone è reso possibile dalla pulizia ottica dell'organo prima dell'imaging senza clearing. Multifotone.

L'imaging del cervello è limitato a 300 micron sotto la superficie del tessuto a causa degli effetti di dispersione dei punti salienti creati dalle differenze negli indici di rifrazione dell'acqua e delle proteine che compongono il tessuto cerebrale. Per ovviare a questa limitazione, l'organo viene disidratato e l'acqua viene sostituita con un fluido che ha un indice di rifrazione simile a quello delle proteine che compongono il tessuto. Questo processo di pulizia ottica aiuta a ridurre notevolmente la dispersione della luce per offrire immagini migliori più lontano sotto la superficie del tessuto.

Le immagini di Batta et al. dimostrano come questa tecnica possa essere applicata per visualizzare l'istologia di diversi organi di topo utilizzando la fluorescenza intrinseca e la generazione di seconda armonica. Questa prima immagine è del testicolo del topo, scattata a 1,4 millimetri sotto la superficie del tessuto. La proprietà ad alta risoluzione della microscopia multifotone ci consente di ingrandire e avere una visione chiara dei singoli spermatozoi che si formano nei tubolari seminiferi.

Come si vede all'estrema destra, mostriamo un'immagine del polmone del topo, che è stata scattata a 1,4 millimetri sotto la superficie del tessuto. Questa immagine è una dimostrazione dell'imaging multifotone a due canali in cui i componenti dell'elastina sono etichettati in rosso mentre il collagene è etichettato in verde, lo zoom dei singoli oli è facilmente distinguibile. Infine, mostriamo immagini ad alta risoluzione delle regioni interne del cervello del topo che si trovano a 850 micron sotto la superficie del tessuto. Ingrandendo la neocorteccia e l'ippocampo del cervello, i singoli astrociti e i corpi cellulari dei neuroni possono essere visti chiaramente.

Tuttavia, quando vengono puliti otticamente organi che possono contenere proteine fluorescenti come YFP, il protocollo di pulizia ottica di badra non preserva affatto il segnale fluorescente di queste proteine fluorescenti. Il protocollo qui presentato è un nuovo modo in cui eseguire la pulizia ottica dell'intero organo e l'imaging della distorsione del topo, preservando il segnale fluorescente di YFP e neuroni che disidratano il cervello utilizzando una serie graduata di etanolo e la pulizia con una soluzione uno a due di benzoato di alcol, altrimenti noto come BAB, è stato scoperto che riduce il danno alle proteine fluorescenti e preserva il loro segnale fluorescente. Per l'imaging multifotone, i topi YFP vengono prima pesati e poi anestetizzati con un'iniezione intraperitoneale di ketamina xilazina.

Una placca chirurgica di anestesia deve essere confermata prima di procedere all'intervento chirurgico. L'animale dovrebbe essere controllato ogni cinque minuti per vedere se reagisce a un pizzicamento deciso del dito del piede o della coda. Se l'animale reagisce, è necessaria una dose supplementare S di ketamina xilazina.

Una volta anestetizzati, i topi rimangono facendo aderire ogni arto a un letto chirurgico usando del nastro da laboratorio in modo che il topo sia in posizione supina esponendo il torace per l'intervento chirurgico Per iniziare, viene praticata un'incisione sotto il processo xifoideo per fare un taglio lungo la base della gabbia toracica usando forbici e pinzette per tirare indietro la pelle mentre viene effettuato il taglio, Due tagli vengono quindi realizzati su entrambi i lati dello sterno del topo per creare un lembo di tessuto che viene tenuto lontano dalla cavità toracica usando un emostatico per lasciare il cuore esposto. Successivamente, un ago calibro 23 viene inserito nel ventricolo sinistro del cuore e viene praticata una piccola incisione nella parete muscolare dell'atrio destro per consentire al sangue di fuoriuscire. Immediatamente dopo il taglio dell'atrio destro, inizia una perfusione con soluzione salina tamponata con fosfato a quattro gradi Celsius fino a quando non fuoriesce più sangue dall'atrio destro.

Durante la perfusione, viene utilizzata una pompa epistolica e impostata su una potenza di pompaggio che espelle il fluido da 1,5 a due pollici di distanza dalla punta dell'ago. Una volta che tutto il sangue è stato drenato, il mezzo di perfusione viene commutato in una soluzione di aldeide paraforme al 4% a quattro gradi Celsius fino a quando il corpo del topo diventa notevolmente rigido e rigido. Dopo la perfusione, il topo viene rimosso dal letto chirurgico e decapitato per iniziare l'escissione del cervello utilizzando una pinza e forbici dell'iride.

Il cranio viene rimosso in piccole sezioni partendo dalla parte posteriore del cranio e andando avanti. Piccoli tagli vengono eseguiti ogni due o quattro millimetri con le forbici attraverso il cranio, mentre le pinze vengono utilizzate per estrarre con cura l'osso dal cervello in piccole sezioni, questo viene fatto fino a quando l'intera superficie superiore del cervello è esposta. Il cervello viene quindi asportato dal cranio utilizzando una spatola chirurgica e posizionato per prelevare una fiala di vetro di aldeide paraforme al 4% da fissare per sei ore.

Mentre ci stiamo concentrando principalmente sull'imaging del cervello di topo che esprime YFP per questa dimostrazione, elimineremo anche otticamente un topo, una zampa posteriore e sezioneremo un intestino tenue per mostrare al meglio le capacità di pulizia di questa procedura. Dopo la post-fissazione, il cervello e gli altri tessuti vengono lavati due volte in PBS. I campioni di tessuto vengono quindi disidratati a temperatura ambiente mediante una serie di incubazioni di etanolo a concentrazioni del 50%70%90% e 100%etanolo.

Ogni incubazione dura due ore e poi una seconda. L'incubazione al 100% di etanolo di 12 ore viene condotta per estrarre in modo efficiente l'acqua dal tessuto fissato. Dopo la disidratazione, l'ultima soluzione di etanolo al 100% viene versata e i campioni di tessuto vengono immersi in una soluzione uno a uno di etanolo in BAB per due ore prima di essere immersi in una soluzione di chiarificazione al 100% di BAB.

Una volta in bambino, il cervello e gli altri campioni di tessuto diventeranno notevolmente trasparenti entro quattro o cinque ore. Qui mostriamo un video time-lapse delle prime sei ore del processo di schiarimento ottico. Il salto segna il momento in cui la soluzione uno-a-uno di etanolo in BAB è stata sostituita con una soluzione di BAB al 100%.

Al termine delle sei ore, tutti gli organi mostrano segni di trasparenza, ad esempio, l'osso della zampa posteriore del topo è ora chiaramente visibile per ottenere i migliori risultati di pulizia. Il cervello dovrebbe essere lasciato pulirsi per sei giorni a temperatura ambiente, protetto dalla luce intensa. Una volta che il cervello è stato ripulito e pronto per l'imaging, viene apposto sul fondo della piastra di Petri utilizzando l'acrilico Sano o la super colla.

Dopo che la colla si è asciugata, il cervello viene immerso nel BAB e la capsula di Petri viene posizionata sotto l'obiettivo per l'imaging. Per l'imaging, utilizziamo un microscopio multifotone che incorpora un laser MI tie titanium sapphire regolabile tra una lunghezza d'onda di eccitazione da 710 a 990 nanometri. La lunghezza d'onda di eccitazione che utilizziamo per generare segnali YFP è di 886 nanometri.

Il segnale fluorescente riflettente viene quindi catturato utilizzando un obiettivo NIK icon five x che consente l'imaging con un ampio campo visivo. Il segnale fluorescente riflettente viene filtrato utilizzando un filtro passa-banda 5, 35, 50 e raccolto utilizzando una cartella ad alta efficienza quantica. Le immagini di OMA Matsu vengono elaborate utilizzando il software di scansione delle immagini a una risoluzione di 2048 x 2048 pixel utilizzando una velocità di scansione di due millisecondi per linea per generare immagini YFP ad alta risoluzione.

Una volta completato l'imaging, il cervello viene rimosso dalla piastra P 2 e conservato in BAB e schermato dalla luce per l'imaging futuro. Le immagini e i video rappresentativi mostrati qui dimostrano la capacità di imaging multifotone ad alta risoluzione resa possibile dalla pulizia ottica. L'imaging dell'intero cervello consente ai neuroni dell'etichetta YFP nei diversi strati dell'ippocampo e della neocorteccia di essere chiaramente visibili fino a due millimetri sotto la superficie del tessuto.

Qui mostriamo un video di una pila di immagini di 1,2 millimetri di distorsione dell'intera bocca, presa da 0,8 a due millimetri nel cervello per rivelare i diversi strati anatomici dell'ippocampo. Quella che segue è un'immagine rappresentativa di una sezione coronale di 1,94 millimetri chiamata a Bergman presa dall'immagine profonda due millimetri bloccata in cui sono stati etichettati i diversi strati dell'ippocampo. Ingrandendo la neocorteccia, i singoli assoni e i corpi cellulari neuronali dei neuroni perali di quinto strato della neocorteccia sono chiaramente distinguibili fino a 1,02 millimetri sotto la superficie del tessuto.

Qui mostriamo un'immagine bloccata dei neuroni dello strato cinque presi tra i 700 e i 1020 micron sotto la superficie del tessuto. Quella che segue è un'immagine rappresentativa di quella pila presa a 774 micron nel cervello. Utilizzando questo stesso stack di immagini, è stata realizzata una ricostruzione 3D della regione del neurone utilizzando il software Image J.

La capacità ad alta risoluzione della microscopia multi-bot ci consente anche di presentare immagini di interi singoli neuroni. Qui mostriamo una ricostruzione di un neurone di quinto strato della neocorteccia in cui i processi genetici D sono chiaramente visibili. Questo conclude la nostra presentazione della cancellazione ottica, distorsione dell'intero topo che esprime YFP.

L'esecuzione di questa tecnica è relativamente semplice e, come abbiamo mostrato, può essere utilizzata per visualizzare e visualizzare molte regioni e strutture diverse della distorsione del topo. Grazie per aver guardato e buona fortuna.