Caratterizzante Microbiome Dynamics – flusso Cytometry basato su flussi di lavoro da colture Pure di comunità naturali

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ecologia microbica e nella biotecnologia, ad esempio, quali concetti ecologici guidano un determinato ecosistema. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per chiudere la dinamica rapida del microbioma con il regime di campionamento a intervalli brevi, pur rimanendo altamente conveniente. Questo metodo può essere utilizzato per ottenere informazioni sulle comunità microbiche biotecnologiche e naturali e anche sui microbiomi animali e umani per gli stati nutrizionali e di salute.

A dimostrare la procedura sarà Florian Schattenberg, tecnico e operatore di Sedimetro presso il nostro laboratorio. Per essiccare un campione di comunità di biogas, utilizzare un puntale di pipetta modificato da un millilitro per trasferire 200 microlitri di digestato viscoso in una provetta da due millilitri contenente 1,7 millilitri di PBS. Dopo un'accurata miscelazione, immergere le provette in un bagno a ultrasuoni per un minuto per sciogliere eventuali aggregati cellulari di grandi dimensioni e attaccare le cellule che si attaccano ai residui di cellule vegetali.

Dopo la sonicazione, mescolare accuratamente il campione e filtrare le cellule attraverso un colino a maglie di pori da 50 micrometri in un tubo di plastica da 2 millilitri. Dividere il filtrato in quattro aliquote da 400 microlitri e centrifugare le aliquote due volte, scartando completamente il surnatante entrambe le volte per disidratare meccanicamente il campione di microbi il più accuratamente possibile. Quindi asciugare il campione in una centrifuga sottovuoto riscaldata per creare un pellet stabile e conservare il pellet a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce.

Per la stabilizzazione e la fissazione di campioni di fanghi attivi, centrifugare quattro millilitri di celle e risospendere il pellet in quattro millilitri di formaldeide al due percento in PBS. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, centrifugare il campione di cella stabilizzata e fissare il pellet in quattro millilitri di etanolo al 70% per una conservazione a meno 20 gradi Celsius. Miscelare e trasferire 0,6 millilitri della sospensione cellulare fissa in una provetta di vetro contenente 1,4 millilitri di PBS e, dopo un'accurata miscelazione, sonicare per 10 minuti come dimostrato.

Al termine della sonicazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in due millilitri di PBS fresco. Dopo un'accurata miscelazione, sonicare le celle come appena dimostrato per cinque minuti e regolare l'OD 700 nanometro a 035 con PBS fresco. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di permeabablizzazione contenente 0,11 molari di acido citrico e 4,1 millimolari tra 20, con un'accurata miscelazione, per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente.

Quindi raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere accuratamente il pellet in due millilitri di soluzione colorante contenente 0,68 micromolari DAPI, per un'incubazione di almeno 60 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Per la calibrazione delle microsfere, caricare la miscela di microsfere per la calibrazione lineare nel citometro a flusso e misurare le microsfere in modo continuo mentre si manipolano le posizioni dell'ugello e dell'ottica laser per precalibrare lo strumento nell'intervallo lineare. Quando i picchi delle microsfere possono essere inseriti in un modello di calibrazione preimpostato, passare alla modalità log e caricare un campione di microsfere di calibrazione logaritmica.

Adattare i picchi logaritmici delle perline al loro modello di calibrazione preimpostato per mettere a punto l'hardware dello strumento e utilizzare l'impostazione del guadagno del tubo fotomoltiplicatore per apportare le regolazioni finali necessarie alla posizione delle perline L'aspetto più critico di questa procedura è il mantenimento di misurazioni coerenti per consentire la comparabilità tra gli esperimenti. Pertanto, la calibrazione giornaliera del citometro e l'uso di perline nei monconi biologici sono vitali per il successo della dialisi lenta del microbioma citromico. Quando le cellule sono pronte, mescolare e filtrare i campioni e aggiungere la miscela di microsfere logaritmiche alle cellule.

Ora mescola e carica il campione sul citometro e crea un cancello per includere le cellule colorate ed escludere il rumore e le perline. Quindi analizzare il set di campioni consecutivamente a una velocità massima di 3.000 eventi al secondo fino a quando non vengono rilevate 250.000 celle all'interno del gate della cella. Per analizzare i dati della citometria a flusso, sviluppare un modello di gate master da utilizzare su tutti i campioni.

Iniziare caricando i file standard della citometria a flusso in un programma di analisi della citometria a flusso appropriato ed elaborare i campioni in successione. Caricare i campioni, fare doppio clic su una misura e selezionare i parametri degli assi X e Y dai rispettivi menu a discesa per aprire un grafico a fluorescenza a dispersione diretta rispetto a DAPI. Utilizzare lo strumento di disegno poligonale per riprodurre il cancello della cella di misurazione generato in precedenza per escludere i cordoni e il rumore e denominare il cancello di conseguenza.

Trascinare la voce del gate della cella nell'elenco dei gruppi di tutti i campioni e fare doppio clic sul gate della cella per visualizzare in modo selettivo solo gli eventi della cella. Definisci le sottocomunità prevalenti in un campione con lo strumento cancello ellittico e raggruppale. Aggiungere quindi ulteriori allocazioni di sottocomunità e campioni successivi fino a quando il modello di gate master non si adatta a tutti i campioni.

Controlla il modello del cancello principale con il metodo di scansione a dispersione laterale per risolvere il clustering delle sottocomunità vicine l'una all'altra. Quindi, aggiungi tutte le sottocomunità all'editor di tabelle e imposta la statistica di output sulla frequenza del genitore. Utilizza l'editor di tabelle per esportare le abbondanze relative alla sotto-comunità in un software per fogli di calcolo appropriato e adatta la formattazione dei dati secondo le linee guida nel manuale della barra laterale.

Quindi, per visualizzare le dinamiche e le correlazioni della sottocomunità, installare e caricare il pacchetto R e caricare e normalizzare il file txt. I grafici a fluorescenza a dispersione diretta rispetto a DAPI rivelano gli stati del ciclo cellulare delle colture di ceppi puri in diversi punti di una coltura batch. L'utilizzo di un modello di gate master consente quindi di quantificare la proporzione di cellule con uno, due o più cromosomi, rivelando, ad esempio, la capacità di questo microbo rappresentativo di replicare i suoi cromosomi più velocemente del suo tempo di generazione.

Quando si studiano comunità microbiche complesse nel tempo, il ritmo e il significato del cambiamento della comunità possono essere facilmente visualizzati con una sequenza di dot plot. Le sotto-comunità dominanti nelle diverse fasi dell'esperimento possono essere chiaramente identificate utilizzando lo strumento del codice a barre citometrico. La combinazione di questi dati con la distribuzione di frequenza delle abbondanze relative delle sotto-comunità consente di selezionare le porte che dimostrano cambiamenti significativi dell'abbondanza nei punti temporali chiave.

La visualizzazione di questi dati in un grafico di scala multidimensionale non metrico può facilitare una comprensione più profonda delle dinamiche della comunità. Le comunità del biogas possono potenzialmente affrontare eterogeneità spaziali a causa delle limitazioni dell'agitazione. I punti campione esemplari della comunità del biogas mostrano poca eterogeneità spaziale, ma anche temporale pronunciata.

Forti correlazioni positive o negative con parametri abiotici, come i prodotti più rigidi, possono aiutare a comprendere e ottimizzare gli ecosistemi e i processi biotecnologici. Inoltre, facilitano l'identificazione di porte di particolare interesse per il successivo smistamento e analisi. Durante la definizione di questa procedura, si consiglia di valutare diverse procedure di fissazione e colorazione per valutarne le prestazioni e la stabilità per ogni nuovo set di campioni.

Dopo la selezione, ulteriori approcci come la recinzione ampliconsica, la metagenomica e la proteomica possono essere applicati per selezionare le migliori comunità che forniscono informazioni sull'affiliazione protogenetica sugli stati di attività al di fuori delle vie metaboliche. Questo metodo ha aperto la strada agli ecologi microbici e agli ingegneri dei bioprocessi per seguire le dinamiche del microbioma, gli ecosistemi naturali e controllati con un ragionevole investimento di risorse.