Privo di calibrazione In Vitro quantificazione delle proteine omo-oligomerizzazione utilizzando Strumentazione commerciale e libero, Open Source Software di analisi di luminosità

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello screening farmacologico, come chiarire l'effetto degli inibitori di piccole molecole su concentrazioni molto basse per le interazioni proteina-proteina. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è priva di calibrazione, può essere implementata in qualsiasi microscopio confocale e utilizza quantità molto piccole di proteine marcate. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di farmaci antitumorali, inibitori di piccole molecole e vari inibitori di fusione perché fornisce informazioni quantitative sulle interazioni proteina-proteina.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni e le aggregazioni proteiche in vitro, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la dinamica delle proteine delle cellule vive e le interazioni cellula-cellula. Per iniziare, trasformare le cellule pLysS con un vettore pET-22b contenente tag FKBP12 umani monomerizzati e His6 e mVenus N-terminali. Dopo che le cellule si sono riprese dall'incubazione e dallo shock termico, piastrelarle su agar LB integrato con antibiotici.

Trasferisci le colonie trasformate in una coltura starter LB da 100 millilitri e cresci per 16-20 ore a 37 gradi Celsius con agitazione. Dopo l'incubazione, diluire la coltura starter densa da uno a 100 in LB in due lotti da 500 millilitri. Quindi, cresci per due o tre ore fino a una densità ottica a 600 nanometri da 0,6 a 0,8.

Dopo aver raffreddato le colture su ghiaccio, indurre la produzione di proteine con IPTG da 250 micromolari. Coltiva le colture per 16-20 ore a 21 gradi Celsius e 200 giri/min. Quindi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 2.000 g per 20 minuti.

Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 40 millilitri di tampone IMAC A integrato con inibitori della proteasi privi di EDTA. Ora, sonica le celle a 500 watt, 20 kilohertz e 40% di ampiezza a nove secondi di accensione, 11 secondi di spegnimento per 15 minuti sul ghiaccio. Dopo la sonicazione, raccogliere il materiale solubile mediante centrifugazione a 20.000 g per un'ora a quattro gradi Celsius.

Trasferire il lisato solubile in un pallone conico e aggiungere due millilitri di resina TALON. Lasciare incubare la sospensione per un'ora con una rotazione di 105 giri/min. Ora, raccogli la resina e lavala con 250 millilitri di tampone IMAC A seguiti da 500 millilitri di tampone IMAC B.Eluire la proteina marcata con His6 utilizzando il tampone IMAC C.Iniettare l'eluato su una colonna di esclusione dimensionale pre-bilanciata e raccogliere il picco FKBP12, che eluisce a circa 87,7 millilitri.

Valutare la purezza della proteina tramite SDS-PAGE, raggruppare e concentrare secondo necessità. Per impostare l'array di piastre multipozzetto, preparare prima una soluzione di FKBP12 purificato a 100 nanomolari nello stesso tampone utilizzato per la cromatografia ad esclusione dimensionale. Sonicare e centrifugare con una rotazione rapida di 13.000 giri/min per prevenire la formazione di aggregati.

Ora, pipettare da 100 a 200 microlitri della proteina diluita in una camera di osservazione a otto pozzetti con fondo di vetro. Aggiungere il dimerizzatore BB alle concentrazioni finali di 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nanomolari. Come riferimento, preparare una soluzione di mVenus a 100 nanomolari da solo per valutare i potenziali effetti di aggregazione e precipitazione e per recuperare un valore di luminosità per il monomero con le stesse impostazioni di acquisizione.

Può essere utilizzato qualsiasi sistema confocale per microscopio a scansione ottica dotato di rivelatori digitali o rivelatori analogici ben caratterizzati e in grado di mantenere un tempo di permanenza costante per ogni pixel acquisito. Seleziona l'obiettivo a immersione in acqua per la correzione del collare progettato per la spettroscopia di correlazione della fluorescenza. Ora, aggiungere una goccia d'acqua all'obiettivo di immersione in acqua di correzione del collare.

Montare la camera di osservazione a otto pozzetti nel tavolino. Impostare il percorso del raggio di eccitazione accendendo il laser a 514 nanometri e impostandolo a una potenza compresa tra 20 e 100 nanowatt all'uscita dell'obiettivo. Accendere un rilevatore HyD.

Sono preferibili rivelatori in grado di contare i fotoni. Selezionare la finestra di emissione da 520 a 560 nanometri. Per la modalità di acquisizione, utilizzare 16 x 16 pixel.

Impostate il tempo di permanenza dei pixel in modo che il tempo di permanenza dei pixel sia più lungo della diffusione delle proteine e il tempo di permanenza dei pixel sia molto più breve. Ciò corrispondeva all'impostazione del tempo di permanenza a circa 13 microsecondi per il sistema utilizzato in questa dimostrazione. Impostare il foro stenopeico su un'unità Airy per l'emissione corrispondente di circa 545 nanometri.

Selezionare la modalità di acquisizione xy time e selezionare il numero di fotogrammi da acquisire per acquisizione e bene. Ora, imposta la dimensione dei pixel a circa 120 nanometri. Se il sistema è dotato di modalità ad alta produttività, introdurre le coordinate di ciascun pozzo e il numero di acquisizioni per pozzo per automatizzare il processo.

Se il sistema è dotato di un sistema di perfusione, caricare la soluzione BB e programmare la perfusione in modo che inizi subito dopo il 5.000° fotogramma per valutare la cinetica di dimerizzazione durante l'acquisizione di 10.000 immagini. Seleziona il pozzo corretto e concentrati sulla soluzione. Quindi, avvia l'acquisizione e salva la pila di immagini risultante in formato TIFF.

Sono state acquisite sequenze di 20.000 immagini di FKBP12 mVenus purificato in soluzione a 100 nanometri, come specificato nella sezione del protocollo. L'intensità del primo fotogramma viene mostrata insieme al profilo di intensità media dell'immagine detrended. Viene mostrata anche la luminosità senza e con filtro uniforme.

Dopo l'acquisizione di 10.000 fotogrammi, il farmaco omodimerizzante BB è stato aggiunto alla soluzione durante l'acquisizione. Ogni serie consecutiva di 5.000 fotogrammi è stata analizzata. La luminosità media cinque minuti dopo l'aggiunta di BB è stata di 1,010, che è un aumento doppio, indicando un dimero FKBP12.

La cinetica del processo mostra un ritardo tra l'aggiunta di BB e la dimerizzazione completa di FKBP12 di circa due minuti. Un aspetto chiave per valutare le interazioni proteina-proteina in vitro è la produzione e la purificazione della proteina marcata. Assicurati di avere piccole quantità della proteina etichettata di interesse e che la tua proteina non si stia aggregando secondo l'analisi.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la risonanza plasmonica di superficie o la spettroscopia di correlazione della fluorescenza per rispondere a ulteriori domande, come le costanti di dissociazione o i coefficienti di diffusione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biofisica per esplorare in dettaglio le interazioni proteina-proteina nelle cellule vive. Non dimenticare che lavorare con i reagenti per la purificazione delle proteine può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come occhiali di sicurezza, guanti.