Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo

La misurazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale può tracciare la risposta del cervello a cambiamenti a lungo termine tali che si verificano durante lo sviluppo e la neuroplasticità. Il nostro metodo ha i vantaggi che le misurazioni sono completamente quantitative e vengono effettuate nell'animale che si comporta sveglio. La tecnica autoradiografica quantitativa consente misurazioni simultanee in tutte le regioni cerebrali.

A dimostrare la procedura saranno Anita Torossian, una borsista post-maturità nel mio laboratorio, e Tianjian Huang, il nostro chirurgo animale. Inizia questa procedura con la preparazione per l'intervento chirurgico come descritto nel protocollo di testo. Una volta in fase chirurgica, utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione di un centimetro dalla parte mediale superiore della coscia sinistra rostralmente verso la linea mediana rivelando l'arteria femorale e la vena.

Ritrarre la pelle sciolta con ganci chirurgici della pelle sopra e su entrambi i lati dell'incisione. Fissare i ganci della pelle assottiglindoli alla fase di intervento chirurgico. Applicare cloruro di sodio sterile allo 0,9% sull'area esposta per mantenere un'umidità adeguata.

Utilizzare le forcelle per smussare la dissezione, separando il tessuto connettivo attorno a una piccola sezione dell'arteria femorerale e della vena. Separare accuratamente l'arteria e la vena. Ora usa le forcep per infilare un filamento di sutura assorbibile sotto la vena femorale e l'arteria nel punto più laterale dell'incisione.

Tirare la sutura a metà strada in modo che le estremità siano pari. In un punto più prossimale all'inguine, utilizzare le forcep per infilare una seconda sutura sotto solo la vena femorale. Legare delicatamente un mezzo nodo che verrà utilizzato per limitare il flusso sanguigno.

In un punto tra il filamento A e il filamento B, utilizzare le forcep per infilare una terza sutura sotto solo la vena femorale. Legare delicatamente un nodo completo che verrà utilizzato per limitare il flusso sanguigno. Fai attenzione a non strappare la vena.

Tirare delicatamente sul filo B per limitare il flusso sanguigno. Utilizzare un emostato per rimorchiare delicatamente il filamento B per mantenere la restrizione del sangue. Ora, collegare l'estremità non tagliata del tubo pe a un ago calibro 32 e una siringa di un millimetro riempita con soluzione salina eparinizzata.

Sciacquare il catetere per rimuovere le bolle d'aria. Tagliare un piccolo foro nell'area ristretta della vena femorale con micro forbici e inserire con cura l'estremità angolata del tubo PE a filo otto verso il filo B.Una volta inserito, rilasciare la tensione del filamento B e guidare il catetere più in alto nella vena. Stringere il filo B intorno alla vena contenente il catetere.

Usando il filo C, legare un nodo aggiuntivo attorno al catetere. Assicurati che questo nodo non catturi l'arteria femorale. Tirare delicatamente indietro sulla canna della siringa per riempire parzialmente il tubo di sangue per assicurarsi che il catetere sia stato impiantato correttamente prima di inserire un catetere PE 10 nell'arteria femorale sinistra utilizzando la stessa procedura.

Una volta che sia la vena femorale che i cateteri dell'arteria sono stati fissati, legare il filamento A in un nodo attorno a entrambi i cateteri. Dopo aver tagliato tutte le suture in eccesso e rimosso i ganci della pelle, sciacquare il catetere arterioso con soluzione salina eparinizzata per evitare la coagulazione. Cauterizzare le estremità di entrambi i cateteri per creare un sigillo.

Posizionare il mouse in posizione prona e fare una piccola incisione alla base del collo applicando soluzione salina all'area esposta. Inserire un'asta metallica cava sottdermicamente dall'incisione del collo all'incisione femorale. Serpeggia i cateteri attraverso l'asta cava e fuori dall'incisione del collo.

Dopo aver rimosso l'asta cava, chiudere l'incisione femorale con sutura seguita da analgesia post-chirurgica. Serpeggia i cateteri attraverso un tubo cavo flessibile di 30 centimetri per rendere il cavo della molla prima di suturare il pulsante del cavo a molla sotto la pelle seguito da analgesia post-chirurgica. Spostare il mouse in un contenitore cilindrico chiaro con un supporto girevole e un braccio per ospitare il mouse durante il periodo di recupero.

Posizionare uno scaldamani sotto il contenitore per mantenere caldo il mouse. Assicurarsi che il mouse si trova in uno stato fisiologico normale all'inizio dell'esperimento prelevare campioni come descritto nel protocollo di testo. Per somministrare il tracciante per via endovenosa, utilizzare un connettore Y con una siringa che tiene il tracciante di leucina etichettato C 14 collegato a un braccio e una siringa con da 100 a 200 microlitri di soluzione salina sterile per lavare la linea venosa collegata all'altro braccio.

Collegare il connettore Y alla linea venosa. Avvia lo studio avviando contemporaneamente un cronometro, iniettando il tracciante e raccogliendo campioni di sangue arterioso a tempo. Lavare la linea venosa con soluzione salina immediatamente dopo l'iniezione.

Raccogliere campioni di sangue da uno a sette continuamente durante i primi due minuti dell'esperimento nello stesso modo. Dopo aver raccolto i sette campioni, raccogliere 30 microlitri di sangue nello spazio morto prima di ogni campione rimanente. I campioni da otto a 14 vengono raccolti rispettivamente a tre, cinque, 10, 15, 30, 45 e 60 minuti.

Ad un certo punto, durante l'esperimento, elaborare tre tubi per norme interne contenenti leucina tritiata e norleucina come descritto nel protocollo di testo. Per quantificare le concentrazioni di leucina plasmatica, utilizzare un sistema HPLC con una colonna di scambio di cationi di sodio e una derivazione post colonna con ortoftaldeide e rilevamento flourometrico. L'area sotto la curva leucina è proporzionale alla concentrazione di leucina nel campione.

Utilizzare il confronto con gli standard per quantificare le concentrazioni di leucina nei campioni. Quindi utilizzare un contatore di scintillazione liquida per quantificare le disintegrazioni al minuto di trizio e C 14 nei campioni di plasma. Utilizzare queste concentrazioni per costruire la curva di gioco della leucina etichettata C 14 dalla circolazione e il decorso del tempo della sua attività specifica nel plasma arterioso.

Dal grafico, calcolare l'attività specifica integrata C 14 etichettata leucina nel plasma arterioso. Per eseguire l'autorarografia quantitativa, preparare sezioni cerebrali di 20 micron di spessore. Se sezione il cervello per mezzo di un criostato a meno 20 gradi celsius.

Scongelare le sezioni di montaggio su vetrini rivestiti di gelatina. Dopo la fissazione delle diapositive, disporre le diapositive in una cassetta a raggi X insieme a una serie di standard di metacrilato metile etichettati in C 14 precedentemente calibrati. In una stanza buia e sotto una luce sicura, posiziona un pezzo di pellicola a raggi X, lato emulsione verso il basso sui lati e sugli standard.

Sigillare la cassetta e posizionarla in una borsa nera. Sviluppare i film secondo le istruzioni del produttore. Lo sviluppo automatico della pellicola non è raccomandato perché lo sfondo può essere irregolare e può influire sulla quantificazione.

Costruire una curva di calibrazione della densità ottica rispetto alla concentrazione del tessuto C 14 in base ai valori di densità ottica dell'insieme di standard calibrati sul film. Adattare questi dati a un'equazione polinomiale. Un'equazione polinomiale di secondo o terzo grado si adatta molto bene.

Per analizzare specifiche regioni cerebrali, individuare la regione di interesse o il ROI in sei-otto sezioni rispetto a un atlante cerebrale. Registrare la densità ottica dei pixel all'interno di un ROI in tutte le sezioni. In base alla curva di calibrazione, calcolare la concentrazione di tessuto C 14 in ogni pixel.

Infine, calcolare i tassi regionali di sintesi proteica cerebrale dalla concentrazione media di tessuto C 14 nel ROI nell'integrale dei rapporti delle concentrazioni plasmatiche arteriosa di leucina non etichettata ed etichettata a volte t e lamba. La frazione di leucina nel pool di precursori tissutali che proviene dal plasma. Qui sono mostrate immagini rappresentative di un animale trattato con un veicolo rispetto a un animale trattato con anisomicina, un inibitore della sintesi proteica.

I tassi di sintesi proteica sono proporzionali al livello di oscurità nell'immagine. L'anisomicina riduce drasticamente i tassi misurati di sintesi proteica cerebrale indicando la specificità di questo metodo. Qui, gli autoradiogrammi digitalizzati sono mostrati da un topo che si comporta sveglio a livello dell'ippocampo e dell'ipotalamo.

Le regioni più scure hanno tassi regionali più elevati di sintesi proteica cerebrale. Qui è mostrato un autoradiogramma digitalizzato da un topo di controllo che si comporta sveglio a livello dell'ippocampo dorsale. I tassi di sintesi proteica cerebrale sono rivestiti di colore nelle immagini in base alla barra dei colori.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che gli animali si trovano in uno stato fisiologico normale durante le misurazioni. La nostra metodologia ha già dimostrato la disregolazione della sintesi proteica in disturbi del neurosviluppo come la sindrome di Fragile X. Può anche essere un marcatore utile per cambiamenti degenerativi e condizioni come il morbo di Alzheimer.

Il metodo di sintesi proteica può essere usato in combinazione con l'istochimica immunitaria in sezioni alternate per correlare i cambiamenti nella sintesi proteica con i cambiamenti regionali in proteine specifiche. In sintesi, il metodo leucina autoradiografico quantitativo L-1 C 14 è ideale per una determinazione accurata dei tassi regionali di sintesi proteica in vivo. Offre notevoli vantaggi in termini di precisione e la sua applicabilità alle condizioni in vivo.