Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patologia del cancro, quantificando le proteine del biomarcatore dal materiale di biopsia lavorato regolarmente. I principali vantaggi di questa tecnica in relazione all'immunoistochimica convenzionale, sono che è oggettiva, ha un'ampia gamma dinamica e consente la quantificazione delle proteine in specifici tipi di cellule. La presenza o l'assenza di alcune cosiddette proteine biomarcatori, o più in particolare, l'abbondanza relativa di tali proteine negli esemplari di biopsia tumorali può essere molto utile per effettuare una diagnosi patologica specifica di specifici tipi di tumori.

Ma può anche essere utile per prevedere la risposta ai trattamenti contro il cancro, ecco perché questa tecnica è rilevante sia per la diagnosi che per il trattamento dei pazienti con cancro. Questo protocollo riguarda principalmente come utilizzare la quantificazione proteica nelle linee cellulari immortalate per convalidare la natura quantitativa del saggio a base di immunofluorescenza. Ma è importante notare che l'immunofluorescenza può essere facilmente incorporata in un approccio multiplexato e applicata ai campioni di biopsia primaria.

Ad assistere e dimostrare questa procedura ci saranno Lee Boudreau, un tecnico, e Shakeel Virk, il direttore delle operazioni. Entrambi del Queen's Laboratory for Molecular Pathology. Per iniziare, centrifuga le cellule precedentemente raccolte in un tubo conico da 50 millilitri a 225 G per cinque minuti.

Decantare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 10 millilitri di PBS. Quindi, centrifugare le cellule rimosidenti a 225 G per cinque minuti. Sospendere il pellet di cella con 10 millilitri del 10%NBF.

Quindi incubare le cellule a temperatura ambiente su un rocker a 24 RPM durante la notte. Dopo aver riparato le cellule, centrifugare le cellule a 225 G per cinque minuti. Quindi rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 500 microlitri di PBS.

Trasferire le cellule in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e pelletare le cellule tramite centrifugazione. Quindi, aspira il supernatante. Aggiungere circa 500 microlitri di soluzione di agarosio all'1% a ciascun tubo contenente celle.

Quindi, pipettare la miscela su e giù per mescolare. Dopo che la soluzione cellulare di agarosio si indurisce, aggiungere un millilitro del 10%NBF ai tubi. Successivamente, rimuovere l'NBF dai campioni.

Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere la spina della cella e posizionare la spina in una cassetta di tessuto plastico. Elaborare i campioni durante la notte con un processore di tessuti automatizzato. Quindi, incorporare i campioni in cera di paraffina, usando metodi istologico standard.

Utilizzando uno strumento di arrayer di tessuti, raccogliere nuclei duplicati da 6 millimetri dal blocco di paraffina e inserirli in un blocco di paraffina vuoto. Successivamente, utilizzare un microtomo per preparare due sezioni istologiche della linea cellulare appena creata, la TMA. Quindi montare le sezioni su uno scivolo istologico e deparaffinizzarle.

In primo luogo, caricare le due diapositive della linea cellulare TMA in un sistema di colorazione automatizzato. Macchiare un lato con la diluizione ottimale dell'anticorpo primario, lasciando l'altro come scivolo di controllo negativo. Ad entrambe le diapositive, applicare un controsostenibile nucleare e un anticorpo secondario.

Dopo il processo di colorazione, aggiungere i reagenti di amplificazione del segnale del tiroide. Successivamente, scansionare le diapositive immunostained utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriate per i fluorofori utilizzati. Utilizzare il software di analisi delle immagini per identificare il compartimento cellulare di interesse, sia esso nucleo o citoplasma, e quantificare l'intensità media della fluorescenza, o IFM, per ogni linea.

Per determinare quale linea cellulare ha la maggiore abbondanza della proteina bersaglio, aliquote preziosamente preparate lentezza cellulare in tubi di microcentrifugo. Aggiungere quindi 2,5 microlitri di tampone 6x laemly e abbastanza tampone di lisi RIPA per portare il volume totale a 15 microlitri. Quindi, caricare un gel di pagina SDS, con una scala proteica, e i campioni precedentemente preparati.

Successivamente, caricare il buffer laemly nei pozzi vuoti. Eseguire il gel fino a quando il colorante blu raggiunge il fondo della piastra. Dopo aver eseguito un trasferimento proteico semi-secco, utilizzare una lama di rasoio per tagliare la membrana orizzontalmente per separare la proteina di interesse dalla proteina di controllo.

Eseguire il blocco e le incubazioni di anticorpi secondo le istruzioni dei produttori. Quindi posizionare le strisce di membrana in un sacchetto di plastica trasparente. Utilizzare una pipetta P1000 per coprire le membrane con miscela ECL.

Quindi sigillare il sacchetto e incubare le membrane a temperatura ambiente al buio per uno o due minuti. Quindi, posizionare il sacchetto di plastica contenente le membrane in una piattaforma di imaging digitale. Utilizzare la chemiluminescenza e il rilevamento dei marcatori colorimetrici per catturare varie esposizioni della membrana.

Utilizzando un software di analisi delle immagini, o osservazione visiva, determinare quale linea cellulare esprime la proteina più bersaglio. Dopo aver immunoblotting una diluizione seriale di questa linea cellulare, aprire le immagini di esposizione utilizzando il software di analisi delle immagini. Utilizzare lo strumento selezioni rettangolari per selezionare la prima corsia del gel.

Quindi vai ad analizzare, gel e seleziona la prima corsia. Ripetere questo processo spostando lo strumento selezione rettangolare sulla corsia successiva e passare ad analizzare, gel e selezionare la corsia successiva. Quindi, vai ad analizzare, gel e tracciare le corsie.

Utilizzare lo strumento linea retta per disegnare linee attraverso le basi di ogni picco, per rimuovere il rumore di fondo. Quindi utilizzare lo strumento bacchetta per selezionare ogni picco e ottenere l'intensità della banda di ogni picco dalla finestra dei risultati. Creare uno scatterplot di intensità della banda rispetto alla quantità di proteina totale caricata per ogni anticorpo primario utilizzando l'uscita densitometrica.

Quindi, utilizzare una linea di migliore adattamento e osservazione visiva per determinare la posizione dell'intervallo dinamico lineare di ogni anticorpo. Selezionare una concentrazione proteica che produca un'intensità di banda all'interno dell'intervallo lineare ed eseguire un'immunoblot di tutti i llysati di linea cellulare con quella concentrazione proteica, come dimostrato in precedenza. Successivamente, eseguire la densitometria sulle scansioni digitali, selezionando le esposizioni che producono segnali all'interno degli intervalli lineari precedentemente identificati per ogni anticorpo.

Successivamente, calcola il rapporto tra l'intensità della banda proteica target e l'intensità della banda di controllo di carico per ogni linea cellulare. Infine, utilizzare un software statistico per eseguire un test di correlazione Pearson tra i valori ottenuti dall'analisi dell'immagine della colorazione IF e quelli ottenuti dall'immunoblotting. Questo protocollo è stato utilizzato per confermare la capacità di IF di determinare la quantità relativa della proteina anti-apoptotica Bcl-2.

Diverse diluizioni dell'anticorpo primario sono state testate sul tessuto umano della tonsille con uno scalatore di immunoistologia. Per questo esperimento, una diluizione da uno a 50 è stata determinata come la diluizione ottimale che ha prodotto un segnale forte con poco rumore di fondo. Questa diluizione è stata utilizzata per macchiare la linea cellulare TMA per immunofluorescenza, e l'analisi dell'immagine è stata utilizzata per quantificare il segnale Citoplasmatico Cy5 attribuito a Bcl-2.

Basato sull'immunoblot per tutte le linee cellulari testate, Granta-519 aveva la maggiore abbondanza di Bcl-2. Un'immunoblot della diluizione seriale del lisato Granta-519 è stata quindi utilizzata per trovare la gamma dinamica lineare di Bcl-2 e controllare la proteina GAPDH. La gamma dinamica per Bcl-2 in questo saggio variava da un'intensità di banda di quasi 0, a 7500 unità.

La gamma dinamica per GAPDH variava da 3000 a 6500 unità. L'immunoblot è stato ripetuto con esposizioni all'interno di quell'intervallo lineare. E il rapporto tra Bcl-2 e GAPDH è stato calcolato per ogni linea cellulare.

Un test di correlazione di Pearson ha dimostrato che i rapporti di intensità dall'immunoblotting erano fortemente e positivamente correlati con le letture di intensità dal SE quantitativo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esporre la membrana finale per più punti di tempo, al fine di trovare l'esposizione ottimale in cui tutte le bande si trovano all'interno dei rispettivi intervalli lineari. Dopo aver convalidato la natura quantitativa del protocollo IF, può essere modificato per il multiplex IF, in campioni di tessuto regolarmente elaborati al fine di rispondere a domande cliniche come dove viene espressa una proteina bersaglio.