Name: Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare limmunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Scopri l'immunoblotting quantitativo per validare l'immunofluorescenza nella quantificazione delle proteine biomarcatore nei campioni di tessuto FFPE. Questo metodo offre un approccio oggettivo per migliorare la diagnosi e la previsione dei trattamenti oncologici.

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Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal Fredrick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship (A.M.).

Approvazione di utilizzare campioni di tessuti umani primari è stata ottenuta dalla Health Sciences e affiliati ospedali d'istruzione ricerca etica Board (HSREB) presso l'Università della Regina.
1. costruzione di un linea cellulare Tissue Microarray (TMA)
<ol><li>Raccogliere e lavare le cellule. Nota: Questo protocollo è stato testato su varie linee cellulari immortalizzate stabilizzate (per esempio HeLa, Jurkat, RCH-ACV).<ol>
<li>Per le celle aderenti, raccolto circa 1.3 x 107 cellule una volta che raggiungono circa confluency di 80%. Staccare le celle utilizzando un reagente appropriato per tale linea cellulare. Nota: Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) è in genere preferibile tripsina per ridurre il rischio di degradare le proteine di superficie. Se si utilizza tripsina, neutralizzare la tripsina utilizzando siero bovino fetale (FBS) immediatamente dopo la raccolta le cellule.</li>
		<li>Per cellule in sospensione, raccolto circa 8 x 107 cellule in ritardo-fase di crescita.</li>
		<li>Raccogliere le cellule raccolte/staccato mediante centrifugazione per 5 min a 225 x g in una provetta conica da 50 mL.</li>
		<li>Decantare il supernatante e risospendere il pellet in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x. Centrifugare per 5 min a 225 x g e decantare il supernatante. Nota: 1x PBS è composto da 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 in acqua distillata; regolare il pH a 7.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fissare le cellule in formalina e appallottolarli.<ol>
<li>Sospendere il pellet cellulare all'interno del tubo conico in 10 mL di formalina 10% neutra tamponata (NBF). Nota: NBF può essere preparata diluendo 1 mL di soluzione di riserva di formaldeide al 37% in 9 mL di 1X PBS. Attenzione: Prestare attenzione quando si maneggia la formalina e formaldeide. Utilizzare una cappa aspirante per passaggi riguardanti formalina e formaldeide.</li>
		<li>Incubare le cellule su un agitatore meccanico a 24 giri/min a temperatura ambiente durante la notte (circa 17 ore).</li>
		<li>Preparare una soluzione di 1% di agarosio basso punto di fusione in PBS (0,01 g di agarosio per 1 mL di PBS).<ol>
<li>Preparare abbastanza per 500 µ l di soluzione di agarosio per campione linea cellulare.</li>
			<li>Sciogliere l'agarosio in un 80 ° C acqua vasca o calore di blocco, con occasionali di miscelazione per 2-5 min. Una volta sciolto, mantenere la soluzione a 37 ° C acqua vasca o in calore per evitare l'indurimento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>A pellet le celle fisse da passo 1.2.2 mediante centrifugazione per 5 min a 225 x g. eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 µ l di PBS 1X.</li>
		<li>Trasferire le cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e pellet mediante centrifugazione per 5 min a 290 x g. aspirato tutto del surnatante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire il cast le cellule in agarosio.<ol>
<li>~ 500 µ l di soluzione di agarosio 1% (dal punto 1.2.3) in ogni provetta contenente le celle. Delicatamente, ma rapidamente, pipettare miscela su e giù utilizzando una micropipetta P-1000 a mescolare. Nota: Tagliare l'estremità della punta della pipetta per allargare l'apertura ed evitare la formazione di bollicine. Tenere la soluzione di agarosio di lavoro nel bagno d'acqua di 37 ° C per evitare l'indurimento.</li>
		<li>Lasciare la soluzione di agarosio-cella indurire (5-10 min) a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mL di 10% NBF per ogni microcentrifuga provetta contenente un campione e tenere a temperatura ambiente fino a (fino a 24 h) di inclusione a paraffina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la spina dell'agarosi per inclusione in paraffina.<ol>
<li>Aspirate fuori le NBF dal campione.</li>
		<li>Rimuovere la spina di cella utilizzando una lama di rasoio per tagliare il tubo del microcentrifuge, inserire la spina in cassetta di plastica tessuto. Conservare le cassette a 10% NBF a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trattare i campioni durante la notte sia manualmente o utilizzando un processatore automatico e incorporare in cera di paraffina utilizzando metodi standard di istologia. Nota: Vedere Fischer et al. 19 per un protocollo di esempio.</li>
	<li>Utilizzando uno speciale strumento "arrayer tessuto", vendemmia duplicati 0,6-mm anime dalla paraffina bloccano da ogni linea cellulare e inserirli, a righe, in un blocco di paraffina destinatario vuoto al fine di creare una linea cellulare di TMA. Nota: I metodi Standard devono essere utilizzati come quelli descritti in Fedor e De Marzo20.</li>
	<li>Incorporare il core da campioni primari che rappresenta 2-3 tipi di tessuto supplementare (ad es., tonsilla, del colon, testicoli, ecc.) come controlli positivi o negativi in TMA. Scegliere tessuti che sono appropriati per la proteina di interesse.</li>
	<li>Utilizzare un microtomo per preparare due sezioni istologiche, circa 4-6 µm di spessore, della linea cellulare TMA. Montare la sezione in una diapositiva di istologia, asciugarlo e deparaffinizzare (come descritto in Fedor e De Marzo20).</li>
</ol>2. campione di colorazione di immunofluorescenza
<ol><li>Ottimizzare la diluizione dell'anticorpo primario. Nota: Esistono protocolli Standard per l'ottimizzazione di IHC oppure se per sezioni di tessuto FFPE come in Kajimura et al. 21. una breve panoramica dell'approccio è descritta qui.<ol>
<li>Preparare 4-5 diluizioni dell'anticorpo primario alla proteina di interesse guidati dalle istruzioni del produttore.</li>
		<li>Identificare un tipo di tessuto di controllo da un'origine animale o umana che esprime la proteina di interesse in popolazioni di cellule morfologicamente riconoscibile. Preparare le sezioni del tessuto e montarli su una diapositiva procedura immunohistochemistry standard come Fedor e De Marzo20. Nota: Il numero di sezioni necessarie è il numero di diluizioni di anticorpo primario più uno supplementare.</li>
		<li>Utilizzando un sistema automatizzato o manuale per il immunohistology, testare le diluizioni di anticorpo primario dal punto 2.1.1 ogni su una diapositiva dal punto 2.1.2. Omettere l'applicazione dell'anticorpo primario dalla diapositiva supplementare e utilizzarlo come controllo negativo.</li>
		<li>Durante il processo di colorazione, colorare tutti i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) come una colorazione nucleare e un anticorpo secondario fluorescente contrassegnato. Se una maggiore sensibilità è necessaria, utilizzare un HRP (perossidasi di rafano)-coniugato anticorpo secondario e sistema di amplificazione del segnale basati su microarray (Vedi Stack et al. 13). Nota: Quando gli anticorpi primari di multiplexing, un'altra etichetta fluorescente viene utilizzata per ogni proteina.</li>
		<li>Scansione le diapositive immunostained con apposito strumento in grado di generare un file di immagine digitale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriato per i fluorofori utilizzati.</li>
		<li>Utilizzare software appropriato per visualizzare le immagini digitali e scegliere empiricamente la diluizione di anticorpo primario che ottimizza l'intensità del segnale rispetto a fluorescenza di fondo. Nota: Se lo si desidera, questa ottimizzazione può verificarsi usando un anticorpo secondario coniugato HRP, 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) e microscopia in campo chiaro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire se macchiatura sulla linea cellulare TMA.<ol>
<li>Utilizzare un sistema automatico o manuale per il immunohistology a macchiare una diapositiva della linea cellulare TMA con la diluizione di anticorpo primario ottimizzato (come determinato al punto 2.1). Omettere l'applicazione dell'anticorpo primario dalla seconda diapositiva e utilizzarlo come controllo negativo.</li>
		<li>Durante il processo di colorazione, colorare tutti i vetrini con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) come una colorazione nucleare e con un anticorpo secondario e tyramide come descritto al punto 2.1.4.</li>
		<li>Scansione le diapositive immunostained con apposito strumento in grado di generare un file di immagine digitale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriato per i fluorofori utilizzati.</li>
		<li>Utilizzare un pacchetto di software di analisi di immagine per identificare il compartimento cellulare di interesse (cioè, citoplasma e nucleo) e quantificare l'intensità media di fluorescenza (MFI) per ogni linea cellulare. Nota: Vari pacchetti software possono essere utilizzati per questo scopo e molti sono discussi in Stack et al. 13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. quantitativo Immunoblotting di linee cellulari
<ol><li>Preparare lisati di cellule.<ol>
<li>Raccogliere 2 milioni le cellule di ogni linea cellulare, come descritto nei passaggi da 1.1.1 a 1.1.3.</li>
		<li>Selezione celle verso il basso per 5 min a 650 x g in una provetta conica da 50 mL. Decantare il supernatante.</li>
		<li>Lavare le cellule con 10 mL di PBS ghiacciata. Risospendere in 1 mL di PBS ghiacciata e trasferirlo in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare il secondo passaggio 3.1.2, decantare e lasciare celle sul ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere circa 200 µ l di tampone di lisi di radioimmunoprecipitation freddo (RIPA) con inibitori delle proteasi (10 µ l di inibitori di X 100 / mL di tampone di lisi RIPA) alle celle, vortex e incubare in ghiaccio per 15 min. Nota: La quantità di tampone di lisi necessaria per lisi efficace varia a seconda della linea cellulare e può essere determinata empiricamente. RIPA buffer è composto di 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% sodio desossicolato, SDS 0,1% in acqua distillata.</li>
		<li>Per garantire il caricamento relativamente anche sui immunoblots, quantificare la proteina totale in un campione di 20 µ l di ciascun lisato utilizzando un metodo appropriato, ad esempio, il saggio di Bradford. Aggiungere circa 40 µ l di tampone di lisi 6 X Laemmli per il resto (circa 180 µ l) di ogni cella lysata e far bollire a 100 ° C in un bagno di acqua o blocco di calore per 5 min. Nota: 6 X Laemmli buffer è composto di 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (p/v) SDS, 60% glicerolo, bromofenolo 0,6% (p/v), 50 mM dithiothreitol (DTT) in acqua distillata.</li>
		<li>Conservare i campioni a-20 ° C fino a due settimane.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire un immunoblot di tutte le linee di celle per determinare quale linea cellulare è la proteina più abbondante di interesse. Nota: Seguire la procedura descritta in Mahmood, T. e Yang, PC. 22, con le seguenti modifiche.<ol>
<li>In microcentrifuga aliquota cella lysate (preparati in fase 3.1) contenente 10-50 µ g di proteina (a seconda l'abbondanza della proteina di interesse). Aggiungere 2,5 µ l di 6 X Laemmli buffer e buffer di lisi RIPA sufficiente per rendere il volume fino a 15 µ l.</li>
		<li>Caricare un accatastamento del 5% e una concentrazione appropriata risoluzione (ad esempio, 10% per le proteine tra 15-100 kDa) gel di SDS-PAGE con una scaletta di proteina e i campioni dal punto 3.2.1. Caricare 1 X Laemmli buffer nei pozzetti vuoti. Eseguire l'alimentazione alle impostazioni appropriate, in genere 125 V, per 80 min o fino a quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo del piatto.</li>
		<li>Eseguire un trasferimento di proteine semi-secco come descritto in Wiedemann et al. 23. Nota: per ottenere risultati rappresentativi, una membrana di nitrocellulosa (che non deve necessariamente essere imbevuto di metanolo), e tampone di trasferimento freddo Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN) sono stati usati. Buffer di BSN è composto da 48 mM Tris, glicina 39 mM, metanolo 20% in acqua distillata.</li>
		<li>Dopo il trasferimento, è possibile utilizzare una lama di rasoio per tagliare la membrana orizzontale per separare la parte contenente la proteina di interesse da una proteina di controllo interno appropriato, ad esempio GAPDH.</li>
		<li>Procedere al blocco e anticorpo incubazioni usando il tampone bloccante raccomandati dal produttore degli anticorpi primari. Nota: Le diluizioni di anticorpo primario ottimale possono variare notevolmente a seconda della sensibilità e abbondanza di proteine. Per i risultati rappresentativi di seguito, l'anticorpo alla proteina di interesse richiesto una diluizione di 1:1,000 mentre il controllo GAPDH richiesto una diluizione di 1: 40.000. La diluizione di anticorpi secondari utilizzati era 1:3, 000.</li>
		<li>Dopo le incubazioni dell'anticorpo e il lavaggio della membrana, posizionare le strisce di membrana in una guaina in plastica trasparente come un sacchetto di sandwich.</li>
		<li>Preparare enchanced miscela di chemiluminescenza (ECL) seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare una pipetta P-1000 per coprire la membrana con la miscela di ECL, chiudere la guaina e incubare le strisce di membrana con la miscela al buio a temperatura ambiente per 1-2 min.</li>
		<li>Posizionare la guaina di membrana in una piattaforma di imaging digitale. Utilizzare la chemiluminescenza e rilevazione colorimetrica marcatore per acquisire varie esposizioni della membrana. Nota: I tempi di esposizione variano in base alla quantità di proteina caricata, abbondanza di proteina bersaglio, affinità anticorpale ecc iniziano con un'esposizione automatica (in genere pochi secondi) e tempi di esposizione di prova sopra e sotto da incrementi di pochi secondi.</li>
		<li>Empiricamente, o utilizzando software di analisi di immagine, determinare quale linea cellulare esprime più proteina bersaglio.</li>
	</ol></li>
	<li>Trovare la gamma dinamica lineare di ogni anticorpo primario utilizzando una diluizione seriale.<ol>
<li>Eseguire passaggi 3.2.1-3.2.8 utilizzando una serie di diluizioni seriali dalla linea cellulare che esprime la più alta concentrazione della proteina dell'obiettivo (identificata nel passaggio 3.2.9).</li>
		<li>Utilizzare software di analisi di immagine quali ImageJ per eseguire densitometria sulle immagini di esposizione.<ol>
<li>Ad esempio, utilizzando ImageJ, utilizzare lo strumento di Selezione rettangolare per selezionare il primo vicolo del gel per quantificare. Vai a analizzare | Gel | Selezionare primo Lane. Utilizzare il mouse per spostare il rettangolo risultante alla corsia accanto. Vai a analizzare | Gel | Selezionare Avanti Lane. Ripetutamente spostare il rettangolo alla corsia accanto e scegliere la corsia per il resto delle corsie.</li>
			<li>Vai a analizzare | Gel | Tracciare corsie. Utilizzare lo strumento Linea retta per disegnare linee attraverso le basi di ogni picco per rimuovere il rumore di fondo. Utilizzare la bacchetta magica per selezionare ogni picco e raccogliere la densità di ogni picco, qui di seguito definita intensità di banda, dalla finestra dei risultati .</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare la densitometria uscita per creare un scatterplot della banda intensità contro la quantità di proteine totali caricati per ogni anticorpo primario. Utilizzando una linea di misura migliore e ispezione visiva, determinare la posizione (intervallo di intensità) della gamma dinamica lineare di ciascun anticorpo.</li>
		<li>Scegliere una concentrazione di proteina che genera un valore all'estremità superiore della gamma lineare di essere la concentrazione muovendo in avanti con tutte le linee cellulari. Nota: Poiché questa concentrazione è inferiore al livello di saturazione nella linea cellulare con la maggiore quantità di questa proteina, non ci dovrebbe essere alcun pericolo di eccessiva frequenza le bande per le altre linee cellulari.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire un immunoblot usando la concentrazione di proteina scelta al punto 3.3.4 per tutte le linee cellulari e ripetere i passi 3.2.1-3.2.8.<ol>
<li>Eseguire densitometria nelle scansioni digitali come descritto al punto 3.3.2. Scegli le immagini di esposizioni che producono segnali all'interno delle gamme lineari per ogni anticorpo identificato nel passaggio 3.3.3.</li>
		<li>Utilizzando i segnali di intensità di banda dall'esposizione ideale da 3.4.1, calcolare il rapporto di intensità di banda proteina bersaglio al caricamento di intensità di banda di controllo per ogni linea cellulare. Questi valori di rapporto indicano l'abbondanza relativa della proteina di interesse.</li>
		<li>Eseguire un test di correlazione di Pearson (può essere fatto utilizzando un pacchetto di software statistico) per correlare i valori ottenuti dall'analisi di immagine del se colorazione (punto 2.2) a quelli ottenuti da immunoblotting (punto 3.4.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Abbiamo descritto un metodo che fa uso di quantitativi immunoblotting (IB) per dimostrare l'utilità di immunofluorescenza (IF) per accertare l'abbondanza relativa di una proteina dell'obiettivo nei campioni di tessuto FFPE. Attuali metodi di quantificazione della proteina sono limitati nella loro natura categorica, come cromogenico IHC2,3, o dalla necessità di omogeneizzare campioni, impedendo di indagine nelle popolazioni delle cellule e la struttura del campion...

La necessità di quantificare le proteine nei campioni di biopsia di tessuto (FFPE) da formalina-fisse, paraffina-incastonato esiste in molti campi clinici. Ad esempio, quantificazione delle proteine di biomarcatore negli esemplari di biopsia di routine è usato per delucidare la prognosi e informare il trattamento per cancro pazienti1. Tuttavia, gli attuali metodi sono in genere soggettivi e mancano di convalida.
Immunohistochemistry (IHC) è usato ordinariamente nei laboratori di patologia e generalmente dipende da un anticorpo primario direzionati alla proteina bersaglio e un anticorpo secondario coniugato con un'etichetta enzimatica come rafano perossidasi2. IHC convenzionale è sensibile, può fare uso di minuto campioni e preserva l'integrità morfologica dei campioni di tessuto, permettendo la valutazione dell'espressione della proteina all'interno del contesto istologico pertinente. Tuttavia, perché il segnale cromogenico generato da IHC è sottrattivo, soffre di un intervallo relativamente ristretto di dinamico e offre un potenziale limitato per multiplexing2,3,4. Spettrometria di massa desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-MSI) di imaging preserva l'integrità morfologica. Tuttavia, questa tecnologia in via di sviluppo è associata con modesta risoluzione morfologiche e richiede notevole calibrazione e normalizzazione, alterando la sua fattibilità per uso clinico sistematico5,6,7. Tecniche alternative per quantificare le proteine nei campioni di tessuto comprendono immunoblotting8, spettrometria di massa9,10,11ed enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) dosaggio12, ogni che comincia con un omogeneizzato lysate del tessuto del campione. Campioni di tessuto primario sono eterogenei, in quanto contengono una moltitudine di tipi di cellule. Di conseguenza, le tecniche che comportano l'omogeneizzazione dei campioni non consentono quantificazione di una proteina in una popolazione particolare cella di interesse come le cellule tumorali.
Come IHC, se è applicabile al piccolo FFPE campioni e consente il mantenimento di integrità istologica13. Tuttavia, grazie alla natura additiva dei segnali di fluorescenza, se è favorevole all'applicazione di molteplici anticorpi primari ed etichette fluorescenti. Così, una proteina di interesse può essere quantificata relativamente all'interno di celle specifiche o compartimenti cellulari (ad esempio, nucleo e citoplasma) definite utilizzando altri anticorpi. Segnali di fluorescenza hanno anche il vantaggio di una maggiore gamma dinamica13,14. La superiorità, la riproducibilità e la potenziale multiplexing di se applicato a campioni FFPE è stata dimostrata13,14,15.
Qui descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting utilizzando linee cellulari stabilizzate come gold standard per accertare la natura quantitativa di se accoppiato con analisi di immagine computerizzata nel determinare l'abbondanza relativa di una proteina di interesse in sezioni istologiche dai campioni di tessuto FFPE. Abbiamo applicato questo metodo con successo in un approccio multiplex per quantificare le proteine biomarcatore in clinica biopsia campioni16,17,18.

<table><tbody><tr><td>697</td><td>DSMZ</td><td>ACC 42</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>RCH-ACV</td><td>DSMZ</td><td>ACC 548</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ</td><td>ACC 342</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>REH</td><td>DSMZ</td><td>ACC 22</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Raji</td><td>Linea cellulare ATCC</td><td>CCL-86</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Linea cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>R001100</td><td>Per il distacco di cellule adesive</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale (FBS)</td><td>Wisent Inc.</td><td>81150</td><td>Per neutralizzare la tripsina</td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra</td><td>Protocollo</td><td>245-684</td><td>Per il fissaggio di pellet cellulari</td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro a basso punto di fusione</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td>Per colata di pellet cellulari</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo anti-umano Bcl-2, clone 124</td><td>Dako (Agilent)</td><td>cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td><td>Per rilevare Bcl-2 mediante immunofluorenzienza e immunoblot (lotto#:&nbsp; 00095786</td></tr><tr><td>Ventana Discovery XT</td><td>Roche-Per</td><td></td> <td>l'automazione della colorazione in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>EnVision+ System- Polimero marcato HRP (anti-topo)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4000</td><td>Per l'amplificazione del segnale di immunofluorescenza</td></tr><tr><td>EnVision+ System- Polimero marcato HRP (anti-coniglio)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4002</td><td>Per l'amplificazione del segnale di immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Cianina 5 reagente tiramide</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL745001KT</td><td>Per l'amplificazione del segnale di immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Aperio ImageScope</td><td>Leica Biosystems-Per</td><td></td> <td>visualizzare i vetrini scansionati Software</td></tr> di <tr><td>analisi delle immagini HALO</td><td>Indica Labs-Per</td><td></td> la quantificazione degli inibitori della proteasi in <td>immunofluorescenza</td></tr><tr><td>(cocktail di inibitori della proteasi Halt, 100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td> tampone RIPA</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>BioShop</td><td>EDT001</td><td>Per tampone RIPA</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>BDH Limited</td><td>56009</td><td>Per tampone RIPA</td></tr><tr><td>Desossicolato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Per tampone RIPA</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>FisherBiotech</td><td>BP229</td><td>Per tampone Laemlli</td></tr><tr><td>Blu bromofenolo</td><td>BioShop</td><td>BRO777</td><td>Per tampone Laemlli</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>Per tampone Laemlli</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>Per lavaggi immunoblot</td></tr><tr><td>Scala proteica (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td>Per gel proteico da corsa</td></tr><tr><td>Carta da filtro (carta per macchie extra spessa)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703969</td><td>Per tamponamento trasferimento</td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td>Per il trasferimento di blotting</td></tr><tr><td>Cella di trasferimento semi-secca Trans-blot SD</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Per il trasferimento semisecco</td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere (latte in polvere scremato)</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9999S</td><td>Per tampone di blocco</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Per tampone di lavaggio</td></tr><tr><td>GAPDH coniglio anticorpo monoclonale</td><td>Epitomics</td><td>2251-1</td><td>Anticorpo primario della proteina di controllo (lotto#: YE101901C)Anticorpo</td></tr> <tr><td>IgG anti-topo di capra (coniugato HRP)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td><td>Anticorpo secondario per immunoblot Anticorpo</td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio di capra (coniugato HRP)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td><td>Anticorpo secondario per immunoblot (lotto#: GR3192725-5)</td></tr><tr><td>Clarity Western Substrati ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Per il rilevamento del segnale immunoblot</td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29083461</td><td>Per il rilevamento del segnale immunoblot</td></tr><tr><td>Software</td><td>ImageJ Freeware, NIH-Per</td><td></td> <td>l'analisi densitometrica</td></tr></tbody></table>

immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di routine

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantificazione di proteine di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE) è importante negli studi clinici e applicazioni di ricerca. Un metodo ottimale di quantificazione è accurato, ha un'ampia gamma dinamica lineare e mantiene l'integrità strutturale del campione per consentire per l'identificazione dei tipi di cella singola. Attuali metodi quali immunohistochemistry (IHC), spettrometria di massa e immunoblotting ciascuno non riescono a soddisfare queste stipulazioni dovuto la loro natura categoria o bisogno di omogeneizzare il campione. Come metodo alternativo, proponiamo l'uso di immunofluorescenza (IF) e analisi dell'immagine per determinare l'abbondanza relativa di una proteina di interesse in tessuti FFPE. Qui dimostriamo che questo metodo è facilmente ottimizzato, produce un'ampia gamma dinamica e linearmente quantificabile rispetto il gold standard di immunoblotting quantitativa. Inoltre, questo metodo consente il mantenimento dell'integrità strutturale del campione e per la distinzione dei vari tipi di cellule, che può essere cruciale in applicazioni diagnostiche. Nel complesso, questo è un metodo affidabile per la quantificazione relativa delle proteine in campioni FFPE e può essere facilmente adattato per soddisfare le cliniche o esigenze di ricerca.

Questo protocollo è stato usato per confermare la possibilità di se per determinare la quantità relativa della proteina anti-apoptotica Bcl-2 nelle linee cellulari realizzati in blocchi di tessuto FFPE. Bcl-2 quantificare selettivamente nelle cellule tumorali può delucidare i meccanismi oncogenici e può essere utile nella diagnosi patologica e nell'informare le decisioni di gestione clinica24. Più specificamente, Bcl-2 svolge un ruolo nel corretto sviluppo dei linf...

Descriviamo l'uso di quantitativi immunoblotting per convalidare l'istologia di immunofluorescenza accoppiato con analisi dell'immagine come mezzo di quantificare una proteina di interesse nei campioni di tessuto formalina-fisse, paraffina (FFPE). I nostri risultati dimostrano l'utilità dell'istologia di immunofluorescenza per accertare la quantità relativa di proteine biomarcatore nei campioni di biopsia di routine.

Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della patologia del cancro, quantificando le proteine del biomarcatore dal materiale di biopsia lavorato regolarmente. I principali vantaggi di questa tecnica in relazione all'immunoistochimica convenzionale, sono che è oggettiva, ha un'ampia gamma dinamica e consente la quantificazione delle proteine in specifici tipi di cellule. La presenza o l'assenza di alcune cosiddette proteine biomarcatori, o più in particolare, l'abbondanza relativa di tali proteine negli esemplari di biopsia tumorali può essere molto utile per effettuare una diagnosi patologica specifica di specifici tipi di tumori.Ma può anche essere utile per prevedere la risposta ai trattamenti contro il cancro, ecco perché questa tecnica è rilevante sia per la diagnosi che per il trattamento dei pazienti con cancro. Questo protocollo riguarda principalmente come utilizzare la quantificazione proteica nelle linee cellulari immortalate per convalidare la natura quantitativa del saggio a base di immunofluorescenza. Ma è importante notare che l'immunofluorescenza può essere facilmente incorporata in un approccio multiplexato e applicata ai campioni di biopsia primaria.Ad assistere e dimostrare questa procedura ci saranno Lee Boudreau, un tecnico, e Shakeel Virk, il direttore delle operazioni. Entrambi del Queen's Laboratory for Molecular Pathology. Per iniziare, centrifuga le cellule precedentemente raccolte in un tubo conico da 50 millilitri a 225 G per cinque minuti.Decantare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 10 millilitri di PBS. Quindi, centrifugare le cellule rimosidenti a 225 G per cinque minuti. Sospendere il pellet di cella con 10 millilitri del 10%NBF.Quindi incubare le cellule a temperatura ambiente su un rocker a 24 RPM durante la notte. Dopo aver riparato le cellule, centrifugare le cellule a 225 G per cinque minuti. Quindi rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule in 500 microlitri di PBS.Trasferire le cellule in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e pelletare le cellule tramite centrifugazione. Quindi, aspira il supernatante. Aggiungere circa 500 microlitri di soluzione di agarosio all'1% a ciascun tubo contenente celle.Quindi, pipettare la miscela su e giù per mescolare. Dopo che la soluzione cellulare di agarosio si indurisce, aggiungere un millilitro del 10%NBF ai tubi. Successivamente, rimuovere l'NBF dai campioni.Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere la spina della cella e posizionare la spina in una cassetta di tessuto plastico. Elaborare i campioni durante la notte con un processore di tessuti automatizzato. Quindi, incorporare i campioni in cera di paraffina, usando metodi istologico standard.Utilizzando uno strumento di arrayer di tessuti, raccogliere nuclei duplicati da 6 millimetri dal blocco di paraffina e inserirli in un blocco di paraffina vuoto. Successivamente, utilizzare un microtomo per preparare due sezioni istologiche della linea cellulare appena creata, la TMA. Quindi montare le sezioni su uno scivolo istologico e deparaffinizzarle.In primo luogo, caricare le due diapositive della linea cellulare TMA in un sistema di colorazione automatizzato. Macchiare un lato con la diluizione ottimale dell'anticorpo primario, lasciando l'altro come scivolo di controllo negativo. Ad entrambe le diapositive, applicare un controsostenibile nucleare e un anticorpo secondario.Dopo il processo di colorazione, aggiungere i reagenti di amplificazione del segnale del tiroide. Successivamente, scansionare le diapositive immunostained utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione e rilevamento appropriate per i fluorofori utilizzati. Utilizzare il software di analisi delle immagini per identificare il compartimento cellulare di interesse, sia esso nucleo o citoplasma, e quantificare l'intensità media della fluorescenza, o IFM, per ogni linea.Per determinare quale linea cellulare ha la maggiore abbondanza della proteina bersaglio, aliquote preziosamente preparate lentezza cellulare in tubi di microcentrifugo. Aggiungere quindi 2,5 microlitri di tampone 6x laemly e abbastanza tampone di lisi RIPA per portare il volume totale a 15 microlitri. Quindi, caricare un gel di pagina SDS, con una scala proteica, e i campioni precedentemente preparati.Successivamente, caricare il buffer laemly nei pozzi vuoti. Eseguire il gel fino a quando il colorante blu raggiunge il fondo della piastra. Dopo aver eseguito un trasferimento proteico semi-secco, utilizzare una lama di rasoio per tagliare la membrana orizzontalmente per separare la proteina di interesse dalla proteina di controllo.Eseguire il blocco e le incubazioni di anticorpi secondo le istruzioni dei produttori. Quindi posizionare le strisce di membrana in un sacchetto di plastica trasparente. Utilizzare una pipetta P1000 per coprire le membrane con miscela ECL.Quindi sigillare il sacchetto e incubare le membrane a temperatura ambiente al buio per uno o due minuti. Quindi, posizionare il sacchetto di plastica contenente le membrane in una piattaforma di imaging digitale. Utilizzare la chemiluminescenza e il rilevamento dei marcatori colorimetrici per catturare varie esposizioni della membrana.Utilizzando un software di analisi delle immagini, o osservazione visiva, determinare quale linea cellulare esprime la proteina più bersaglio. Dopo aver immunoblotting una diluizione seriale di questa linea cellulare, aprire le immagini di esposizione utilizzando il software di analisi delle immagini. Utilizzare lo strumento selezioni rettangolari per selezionare la prima corsia del gel.Quindi vai ad analizzare, gel e seleziona la prima corsia. Ripetere questo processo spostando lo strumento selezione rettangolare sulla corsia successiva e passare ad analizzare, gel e selezionare la corsia successiva. Quindi, vai ad analizzare, gel e tracciare le corsie.Utilizzare lo strumento linea retta per disegnare linee attraverso le basi di ogni picco, per rimuovere il rumore di fondo. Quindi utilizzare lo strumento bacchetta per selezionare ogni picco e ottenere l'intensità della banda di ogni picco dalla finestra dei risultati. Creare uno scatterplot di intensità della banda rispetto alla quantità di proteina totale caricata per ogni anticorpo primario utilizzando l'uscita densitometrica.Quindi, utilizzare una linea di migliore adattamento e osservazione visiva per determinare la posizione dell'intervallo dinamico lineare di ogni anticorpo. Selezionare una concentrazione proteica che produca un'intensità di banda all'interno dell'intervallo lineare ed eseguire un'immunoblot di tutti i llysati di linea cellulare con quella concentrazione proteica, come dimostrato in precedenza. Successivamente, eseguire la densitometria sulle scansioni digitali, selezionando le esposizioni che producono segnali all'interno degli intervalli lineari precedentemente identificati per ogni anticorpo.Successivamente, calcola il rapporto tra l'intensità della banda proteica target e l'intensità della banda di controllo di carico per ogni linea cellulare. Infine, utilizzare un software statistico per eseguire un test di correlazione Pearson tra i valori ottenuti dall'analisi dell'immagine della colorazione IF e quelli ottenuti dall'immunoblotting. Questo protocollo è stato utilizzato per confermare la capacità di IF di determinare la quantità relativa della proteina anti-apoptotica Bcl-2.Diverse diluizioni dell'anticorpo primario sono state testate sul tessuto umano della tonsille con uno scalatore di immunoistologia. Per questo esperimento, una diluizione da uno a 50 è stata determinata come la diluizione ottimale che ha prodotto un segnale forte con poco rumore di fondo. Questa diluizione è stata utilizzata per macchiare la linea cellulare TMA per immunofluorescenza, e l'analisi dell'immagine è stata utilizzata per quantificare il segnale Citoplasmatico Cy5 attribuito a Bcl-2.Basato sull'immunoblot per tutte le linee cellulari testate, Granta-519 aveva la maggiore abbondanza di Bcl-2. Un'immunoblot della diluizione seriale del lisato Granta-519 è stata quindi utilizzata per trovare la gamma dinamica lineare di Bcl-2 e controllare la proteina GAPDH. La gamma dinamica per Bcl-2 in questo saggio variava da un'intensità di banda di quasi 0, a 7500 unità.La gamma dinamica per GAPDH variava da 3000 a 6500 unità. L'immunoblot è stato ripetuto con esposizioni all'interno di quell'intervallo lineare. E il rapporto tra Bcl-2 e GAPDH è stato calcolato per ogni linea cellulare.Un test di correlazione di Pearson ha dimostrato che i rapporti di intensità dall'immunoblotting erano fortemente e positivamente correlati con le letture di intensità dal SE quantitativo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esporre la membrana finale per più punti di tempo, al fine di trovare l'esposizione ottimale in cui tutte le bande si trovano all'interno dei rispettivi intervalli lineari. Dopo aver convalidato la natura quantitativa del protocollo IF, può essere modificato per il multiplex IF, in campioni di tessuto regolarmente elaborati al fine di rispondere a domande cliniche come dove viene espressa una proteina bersaglio.

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Il video dimostra una tecnica di western blotting basata sulla normalizzazione totale delle proteine per quantificare l'espressione della proteina bersaglio in un campione. Utilizzando la colorazione proteica totale del campione, viene eseguita un'analisi raziometrica per determinare il livello di espressione relativa della proteina bersaglio.

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Il progresso del western blotting utilizzando la fluorescenza ha permesso di rilevare sottili cambiamenti nell'espressione proteica consentendo analisi quantitative. Qui descriviamo una solida metodologia per il rilevamento di una serie di proteine in una varietà di specie e tipi di tessuto. Viene inoltre fornita una strategia per superare i problemi tecnici comuni.

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L'immunoistochimica è una potente tecnica di laboratorio per valutare la localizzazione e l'espressione delle proteine all'interno dei tessuti. Gli attuali metodi semi-automatici per la quantificazione introducono soggettività e spesso creano risultati irriproducibili. In questo articolo, descriviamo i metodi per l'immunoistochimica multiplexata e la quantificazione oggettiva dell'espressione proteica e della co-localizzazione mediante imaging multispettrale.

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Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Il metodo di localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo (IVIL) può essere utilizzato per esaminare la biodistribuzione in vivo di anticorpi e jujuganti anticorpi per scopi oncologici negli organismi viventi utilizzando una combinazione di targeting per tumori in vivo ed immunostaining ex vivo Metodi.

Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

L'uso di un approccio basato sull'RNA per determinare i profili immunitari quantitativi dei tessuti tumorali solidi e sfruttare le coorti cliniche per la scoperta di biomarcatori immuno-oncologici è descritto attraverso un protocollo molecolare e informatico.

Modellazione immunitaria predittiva dei tumori solidi

Presentato qui è un protocollo per la generazione di controlli del pellet cellulare fissati in formalina e incorporati in paraffina per l'immunoistochimica.

Elaborazione standardizzata per controlli immunoistochimici di pellet cellulari fissati in formalina e incorporati in paraffina

Questo rapporto descrive un protocollo automatizzato per saggi di immunofluorescenza multiplex (mIF) su un coloratore automatico per vetrini. Dimostra l'elevata riproducibilità della proteomica spaziale su autocoloratori tissutali standard ad alto rendimento e imager a fluorescenza su vetrini interi, ideale per saggi mIF personalizzati su un gran numero di vetrini tissutali nella ricerca traslazionale.

Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

Scopri l'immunoblotting quantitativo per validare l'immunofluorescenza nella quantificazione delle proteine biomarcatore nei campioni di tessuto FFPE. Questo metodo offre un approccio oggettivo per migliorare la diagnosi e la previsione dei trattamenti oncologici.

Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare limmunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine (Video) | JoVE Journal

Immunoblotting quantitativa delle linee cellulari come Standard per convalidare l'immunofluorescenza per quantificare le proteine biomarcatore nei campioni di tessuto di Routine

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