Name: Elaborazione standardizzata per controlli immunoistochimici di pellet cellulari fissati in formalina e incorporati in paraffina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Impara a creare controlli standardizzati per immunoistochimica utilizzando pellet cellulari fissati in formalina e incorporati in paraffina. Questo metodo con cellule 293T garantisce distribuzione uniforme e caratterizzazione accurata degli anticorpi.

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Vorremmo ringraziare i nostri colleghi dell'organizzazione di ricerca Genentech, e in particolare i laboratori di Pathology core (P-core) che hanno contribuito allo sviluppo di questi metodi nel corso degli anni.

1. Preparazione del pellet cellulare
<ol><li>In quattro o otto palloni da 150 mm2 o otto x T175, far crescere le cellule nel mezzo e nelle condizioni raccomandate per la linea cellulare all'80% -90% di confluenza. Ad esempio, coltiva cellule 293T nel Modified Eagle's Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino e 2 mM di L-glutammina15. NOTA: Le cellule devono essere coltivate utilizzando le condizioni e il mezzo richiesti per la linea cellulare di interesse16. Queste condizioni possono variare a seconda della linea cellulare, ma i metodi di pellettizzazione a valle dovrebbero essere adattabili per linee cellulari indipendentemente dalle condizioni di coltura.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono vicine alla confluenza (80% -90%), aspirare il terreno di crescita con una pipetta sottovuoto e sciacquare le cellule in soluzione salina tamponata fosfato (PBS).</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di 5-10 mM di EDTA a ciascun matraccio e incubare i matraccio a 37 °C per 5-10 minuti. Picchiettare delicatamente sul lato del matraccio per rimuovere le celle. NOTA: Non usare tripsina in quanto ciò può scindere gli epitopi superficiali che avrebbero un impatto negativo su alcuni antigeni.<ol><li>Una volta che le cellule sono state spostate, aggiungere 5 ml di terreno di crescita utilizzato per la linea cellulare (ad esempio, DMEM per cellule 293T) a ciascun pallone, quindi trasferire le cellule in tubi conici da 50 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugare i tubi conici a 930 x g a temperatura ambiente per 5 min. Dopo la centrifugazione, rimuovere il fluido e l'EDTA mediante aspirazione della pipetta sottovuoto.</li>
	<li>Lavare i pellet cellulari in 10-20 mL di 1x PBS e, se si utilizzano più piastre o palloni , raggruppare le cellule dalle piastre o dai palloni (circa sei palloni T175 nell'esperimento illustrato nella Figura 1) in un singolo tubo conico da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 930 x g per 5 minuti. Aspirare il PBS dopo centrifugazione con una pipetta sottovuoto.</li>
	<li>Tenere il tubo di pellet cellulare su ghiaccio bagnato fino al fissaggio. NOTA: Le cellule vengono mantenute refrigerate per limitare l'attività enzimatica degradativa e ridurre al minimo l'autolisi delle cellule e i cambiamenti proteici associati, compresi i cambiamenti nella localizzazione delle proteine.</li>
</ol>2. Fissazione del pellet cellulare
<ol><li>Eseguire la fissazione aggiungendo 30 ml di formalina tamponata neutra al 10% a 3 ml di pellet cellulare per creare un rapporto fissativo / cella 10: 1 (vol: vol).</li>
	<li>Capovolgere ripetutamente il tubo da 50 mL strettamente tappato fino a quando le celle sono completamente in sospensione. NOTA: La formazione di un pellet cellulare condensato prima della fissazione completa può causare una fissazione irregolare, con conseguenti artefatti durante le successive procedure di colorazione e immunomarcatura.</li>
	<li>Lasciare riposare la sospensione cellulare durante la notte a temperatura ambiente.</li>
	<li>Capovolgere nuovamente il tubo il giorno successivo per risospendere le celle, aumentando il rapporto superficie/volume per migliorare la fissazione. NOTA: il vortice del pellet cellulare non è richiesto o raccomandato in quanto potrebbe causare danni alle cellule.</li>
</ol>3. Rifilatura e lavorazione del pellet cellulare
<ol><li>Dopo 24 h di fissazione, centrifugare il tubo conico da 50 mL a 930 x g a 5 °C per 10-15 min. Assicurarsi che i tubi siano ben tappati, distribuiti equamente e bilanciati nella centrifuga. NOTA: I tempi di fissazione possono essere modificati per riflettere i tempi di fissazione dei tessuti utilizzati dal laboratorio o i requisiti di specifiche condizioni sperimentali.</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, assicurarsi che le cellule formino un pellet visibile. Rimuovere il fissativo travasando e/o aspirando accuratamente con pipetta di trasferimento sterile.</li>
	<li>Aggiungere gel fuso (40-60 °C) a base di idrossietilagarosio (vedi Tabella dei materiali) al pellet cellulare con un rapporto gel / pellet cellulare 1:4 (vol:vol).</li>
	<li>Utilizzando una sonda Sterling pulita da 5 pollici, punta da 2 mm con un occhio risciacquato con acqua di rubinetto, mescolare delicatamente il gel fuso nel pellet a cellule fisse, creando una sospensione uniforme di cellule fisse in gel fuso sul fondo del tubo conico da 50 mL (Figura 1A).</li>
	<li>Posizionare il tubo conico da 50 mL tappato con il gel fuso miscelato con pellet a cellule fisse su ghiaccio umido per 5-10 minuti per solidificare il pellet di cellule gelificate.</li>
	<li>Utilizzando una micro-spatola pulita, rimuovere con attenzione il pellet dal tubo conico posizionando una spatola lungo il lato del tubo e facendo leva delicatamente sul pellet senza perforarlo. Posizionare il pellet su carta da biopsia.</li>
	<li>Utilizzando una micro-spatola pulita, tagliare il pellet cellulare in fette spesse 4-5 mm, in modo che ogni fetta possa entrare in una cassetta di tessuto di 26 mm x 26 mm x 5 mm (Figura 1B).</li>
	<li>Posizionare le singole fette di pellet di gel al centro di un pezzo di carta da biopsia. Piegare le due estremità opposte della carta bioptica sul pellet, avvolgendolo. Posizionare il pellet avvolto in una cassetta di tessuto da 26 mm x 26 mm x 5 mm. Chiudere il coperchio, crimpando i lati aperti dell'involucro bioptico con il coperchio della cassetta di tessuto (Figura 1C).</li>
	<li>Posizionare la cassetta del pellet di cella rifilata nella storta del processore tissutale riempita con formalina tamponata neutra al 10% ed eseguire con un breve programma di elaborazione. NOTA: Il breve programma di lavorazione consiste di 30 minuti in ogni storta a partire da formalina tamponata neutra al 10%, disidratata attraverso una serie di alcoli sempre più graduati, eliminata in tre cambi di xileni e terminante con l'infiltrazione di paraffina in due cambi di paraffina fusa di infiltrazione / incorporazione di 60 °C (punto di fusione 56 °C).</li>
</ol>4. Incorporazione del pellet cellulare
<ol><li>Posizionare le cassette elaborate nell'area di attesa del centro di incorporamento.</li>
	<li>Aprire il coperchio della cassetta del tessuto e aprire con attenzione la carta da biopsia.</li>
	<li>Posizionare il pellet cellulare in un piccolo stampo monouso monouso da 15 x 15 mm, tagliato con il lato rivolto verso il basso. NOTA: Un piccolo stampo incorporante consente di inserire fino a tre sezioni di pellet cellulare su un vetrino di tessuto non colorato per i saggi IHC.</li>
	<li>Tenendo delicatamente il pellet cellulare sul fondo dello stampo con una pinza, aggiungere 62 °C di infiltrazione tissutale/incorporando paraffina nello stampo, coprendo il pellet cellulare.</li>
	<li>Spostare lo stampo in un blocco freddo per iniziare a solidificare la paraffina. Regolare i pellet di cella mentre la paraffina si sta solidificando per fissarli nella loro posizione appropriata sul fondo dello stampo.</li>
	<li>Rimuovere il coperchio dalla cassetta. Posizionare la cassetta, con il lato inferiore verso il basso, sopra lo stampo incorporato e aggiungere ulteriore paraffina fusa per coprire la cassetta.</li>
	<li>Quando la paraffina viene riempita sulla cassetta di tessuto, riportare lo stampo nel blocco freddo per solidificare17,18.</li>
</ol>5. Sezionamento del pellet cellulare
<ol><li>Utilizzare un microtomo rotante impostato con uno spessore di sezione di 20 μm per tagliare il blocco di pellet cellulare fino a quando l'intera faccia del blocco di paraffina e il pellet di cella vengono catturati nel nastro della sezione di paraffina. Questo è definito "affrontare" il blocco.</li>
	<li>Raffreddare e immergere i blocchi di pellet rivestiti su un vassoio da bagno ghiacciato per 5-15 minuti per raffreddare e idratare il blocco prima di sezionare. NOTA: Quando il blocco è idratato, il pellet cellulare sarà traslucido nel nastro di paraffina. Se opaco, è necessario un maggiore ammollo e potrebbero essere presenti artefatti.</li>
	<li>Sezionare il nastro di paraffina del blocco di pellet cellulare ad uno spessore di 4 μm o altro spessore desiderato in modalità di taglio continuo utilizzando un microtomo rotante.</li>
	<li>Disporre i nastri di paraffina su un bagno di galleggiamento dell'acqua impostato a 42 °C.</li>
	<li>Prelevare le sezioni di paraffina preparate con il microtomo rotante dal bagno di galleggiamento su vetrini caricati positivamente.<ol><li>Posizionare la prima sezione nella parte superiore del vetrino all'interno del bordo di copertura e colorazione, posizionando la seconda sotto di essa e la terza sezione di pellet di cella al di sotto di quella (Figura 1D).</li>
		<li>Dopo il sezionamento, asciugare i vetrini a temperatura ambiente (circa 23 °C) per 24 ore, seguiti da 60 °C per 30 min. NOTA: Dopo aver cotto i vetrini a 60 °C, le sezioni di pellet cellulare possono essere utilizzate con qualsiasi protocollo IHC standard, compresi i protocolli che utilizzano il recupero dell'antigene indotto dal calore e basato su enzimi9.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Tutti gli autori sono dipendenti di Genentech/ Roche e, come tali, sono azionisti di Roche.

Questo protocollo descrive una metodologia per generare pellet cellulari fissati in formalina e incorporati in paraffina che possono essere utilizzati come controlli per studi di immunoistochimica a valle e ibridazione in situ. Le metodologie istologiche descritte in questo protocollo sono applicabili a una vasta gamma di linee cellulari tumorali e primarie e adattano principalmente le tecniche istologiche di routine per produrre questi pellet17,18. Una volta lavorati e incorporati, i pellet possono essere utilizzati in modo simile ai tessuti. Ciò include l'utilizzo di protocolli di recupero dell'antigene enzimatico e indotti dal calore per esperimenti di immunoistochimica. Uno degli obiettivi delle metodologie utilizzate in questo protocollo è quello di preservare la morfologia e l'antigenicità delle cellule durante tutto il processo. Pertanto, l'EDTA, che è relativamente delicato in termini di cambiamenti sia nella morfologia che nell'antigenicità, viene utilizzato per staccare le cellule. Questo non vuol dire che altri approcci, come l'interruzione fisica, non siano praticabili; Tuttavia, qualsiasi approccio per staccare le cellule dovrebbe garantire che le cellule non siano danneggiate nel processo. Il secondo obiettivo di questo protocollo è quello di fissare ed elaborare le cellule in modo simile ai tessuti, utilizzando lo stesso fissativo, rapporto fissativo, programma di elaborazione (fissazione, disidratazione, pulizia e infiltrazione di paraffina) e tecniche di incorporamento, in modo che possano servire come controlli comparabili per i saggi a valle. Quindi, gli approcci di fissazione e lavorazione utilizzati per generare pellet cellulari dovrebbero imitare gli approcci utilizzati per i tessuti.
Il protocollo descritto in questo rapporto non è adatto a gestire cellule con agenti infettivi, come le cellule infettate da batteri patogeni o virus, poiché le cellule vengono staccate, raccolte e centrifugate prima della fissazione. I ricercatori potrebbero prendere in considerazione protocolli per fissare le cellule prima del distacco, ma ciò richiederebbe un'ulteriore ottimizzazione per raccogliere le cellule senza disturbare la morfologia cellulare. Inoltre, i tempi di fissazione e le condizioni di manipolazione per le cellule con agenti infettivi richiedono ulteriori considerazioni basate sull'agente infettivo e sui protocolli di biosicurezza istituzionali associati.
I pellet cellulari fissati in formalina e incorporati in paraffina sono particolarmente vantaggiosi nell'avere livelli di espressione proteica ben definiti10. Mentre il cancro e le linee cellulari endogene offrono una selezione di cellule con diversi livelli di espressione proteica, le tecnologie di ingegneria genetica consentono agli scienziati di modellare l'espressione proteica, attraverso proteine sovraesplicenti di interesse e l'uso di tecnologie CRISPR per asportare o inserire geni codificanti di interesse20,21 . Lo svantaggio delle proteine sovraespresse nelle linee cellulari è che sono misure scarse per la sensibilità di un test in quanto potrebbero non rappresentare i livelli di proteine endogene22. Al contrario, sia le linee cellulari endogene che le linee cellulari tumorali possono rappresentare meglio i livelli di espressione endogena e la delezione mediata da CRISPR del gene codificante in una linea affine può servire come controllo negativo corrispondente. Inoltre, le linee cellulari endogene o le linee cellulari tumorali con diversi livelli di espressione proteica sono ideali per esperimenti di titolazione per selezionare le diluizioni finali degli anticorpi e per comprendere meglio la sensibilità di un test (Figura 2). La decisione su quali linee cellulari utilizzare dovrebbe essere basata sulle esigenze sperimentali individuali e spesso utilizzerà una combinazione di approcci.
Oltre a valutare se un anticorpo può rilevare la proteina di interesse, un pannello di linee cellulari può essere utilizzato per definire la specificità di un anticorpo. Ad esempio, un pannello di linee cellulari che esprimono individualmente una famiglia di proteine strettamente correlate può essere utilizzato per verificare se un anticorpo è specifico per una singola proteina o se rileva anche altre proteine strettamente correlate. Controlli più elaborati possono comportare l'uso di linee cellulari che esprimono, attraverso il knock-in CRISPR o attraverso la sovraespressione, proteine con mutazioni puntiformi che non possono subire specifici eventi di segnalazione che vengono rilevati (ad esempio, mutazioni in specifici siti di fosforilazione quando si valuta un anticorpo fosfo-specifico). Sebbene questi siano approcci più complessi, potrebbero essere necessari per confermare che l'anticorpo ha utilizzato solo etichette in circostanze specifiche10.
È importante notare che le manipolazioni genetiche delle linee cellulari potrebbero non generare una popolazione cellulare omogenea. Ad esempio, l'efficienza di trasfezione nelle linee cellulari sovraesprimenti non è in genere del 100% e alcune cellule potrebbero non sovraesprimere la proteina di interesse. L'inclusione di FLAG o di un tag correlato nella trasfezione che può essere rilevata con metodi standard può essere utile per valutare l'efficienza di trasfezione della linea cellulare23. Questo può essere utile sia per determinare se la trasfezione ha avuto successo ed escludere una mancanza di rilevamento dovuta all'espressione proteica, sia per servire come riferimento per la proporzione attesa di cellule che dovrebbero esprimere la proteina di interesse.
L'ibridazione in situ (ISH) può anche essere uno strumento utile per caratterizzare l'espressione genica bersaglio nei pellet cellulari e informare lo sviluppo del metodo IHC10. Durante lo screening degli anticorpi, può essere informativo sapere quando la trascrizione, e quindi la potenziale proteina, può essere rilevata. Inoltre, lo screening ISH del pellet cellulare può essere utile per lo sviluppo del metodo ISH. Mentre la specificità è meno frequentemente un problema per i saggi ISH, è ancora importante avere controlli appropriati e considerazioni simili per lo sviluppo e l'utilizzo di controlli che possono essere applicati agli studi ISH.
I microarray tissutali vengono creati rimuovendo i nuclei dai blocchi donatori e trasferendo questi nuclei, spesso in un modello a griglia, in un blocco di paraffina ricevente. Alla fine, il blocco destinatario contiene uno spettro di campioni in un unico blocco, consentendo a tutti i campioni del blocco di passare attraverso identiche procedure IHC e consentendo il confronto diretto di più campioni sulla stessa diapositiva24,25. Poiché i pellet cellulari sono popolazioni relativamente uniformi, possono essere rappresentati con precisione da nuclei di 1 mm, rendendoli candidati ideali per l'inclusione in array simili. Utilizzando un array di pellet cellulari, è possibile includere pellet cellulari con diversi livelli di espressione, pellet cellulari che esprimono in modo univoco proteine correlate e pellet cellulari che esprimono ortologhi della proteina di interesse di specie diverse in un singolo vetrino (Figura 3). Ciò consente di valutare simultaneamente e in modo rapido tutti i pellet cellulari in condizioni uniformi, riducendo al minimo l'uso di reagenti25.
Per questo protocollo si raccomanda un volume minimo di pellet della cella di partenza di 2 ml raccolti da otto palloni T175. Questo volume consente la produzione e l'archiviazione di più blocchi di pellet a celle, in modo che i controlli dei pellet di cella possano essere standardizzati per periodi di tempo più lunghi e che da un dato pellet possano essere creati più array di pellet. Volumi di pellet cellulari inferiori possono essere utilizzati quando si tratta di linee cellulari primarie derivate dal paziente, linee cellulari a crescita lenta o quando le condizioni limitano il volume del campione. Naturalmente, volumi iniziali inferiori potenzieranno l'impatto negativo di qualsiasi perdita di celle durante la fissazione e la preparazione del pellet e limiteranno il materiale disponibile per i processi a valle. È particolarmente importante prestare attenzione quando si rimuove il fissativo dopo la centrifugazione, per ridurre al minimo qualsiasi perdita associata. Per volumi di campione inferiori, è possibile utilizzare una provetta da centrifuga con tappo da 1,5 ml per pellettare le celle. Questi tubi possono essere tagliati longitudinalmente con una lama per la lavorazione.
Analogamente alla fissazione tissutale, la fissazione cellulare all'interno di questo pellet è fondamentale per le valutazioni IHC a valle. Per ottenere una fissazione completa, utilizziamo almeno un rapporto formalina 10: 1 / pellet cellulare e invertiamo il tubo conico per mantenere le celle in sospensione. Se le cellule non sono in sospensione al momento della fissazione, esiste il rischio di una fissazione incompleta o inadeguata, che influenzerà l'immunomarcatura a valle. Spesso questo si manifesta come etichettatura forte nella periferia e perdita di etichettatura al centro del pellet o etichettatura di intensità variabile in tutto il pellet.
Questo protocollo utilizza Histogel, che è composto principalmente da idrossietilagarosio, sia per legare il pellet cellulare che per consentire alle cellule di essere distribuite uniformemente in tutto il pellet cellulare. Senza di esso, le cellule si compattano e perdono i loro dettagli citomorfologici. Questi dettagli citomorfologici sono spesso importanti durante lo screening degli anticorpi, in quanto forniscono ulteriori informazioni sul fatto che l'anticorpo sia marcato nel compartimento subcellulare appropriato (ad esempio, il nucleo, il citoplasma o la membrana plasmatica). Al contrario, troppo gel può causare densità cellulari più basse all'interno del pellet, portando le cellule ad essere ampiamente distribuite e riducendo il numero di cellule per sezione.
Questo protocollo può essere utilizzato di routine per sviluppare controlli IHC. I materiali necessari per creare questi pellet sono comuni nei laboratori di biologia investigativa e istologia, e i metodi sono semplici e facili da adattare. Mentre i pellet cellulari hanno limitazioni come controlli IHC, servono come ottimi strumenti per lo screening iniziale degli anticorpi e completano altri controlli tissutali.

L'immunoistochimica (IHC) è uno dei test più comunemente usati nella patologia investigativa e diagnostica. A seconda del contesto e del test, l'IHC viene utilizzato per assistere nella diagnosi del cancro1,2, prevedere la risposta al trattamento 3,4, identificare i patogeni5, caratterizzare i tipi di cellule nei tessuti malati 6 e studiare i percorsi biologici e le risposte tissutali 7,8. In tutte le situazioni, il principio di base di un test IHC è che un anticorpo si lega specificamente a un bersaglio di interesse, più comunemente una proteina, e questo evento di legame viene successivamente visualizzato in una sezione tissutale9. Tuttavia, una delle maggiori sfide di qualsiasi test IHC è garantire che gli anticorpi rilevino specificamente il target di interesse10. La specificità degli anticorpi è una sfida nella maggior parte dei test immunologici, ma l'immunoistochimica offre sfide uniche in quanto non esistono misure secondarie, come il peso molecolare, per distinguere tra marcatura specifica e non specifica. Ciò è particolarmente problematico quando si valutano obiettivi scarsamente caratterizzati o espressi ovunque che mancano di modelli di localizzazione cellulare ben definiti. Pertanto, controlli robusti che possono aiutare a caratterizzare la specificità del legame sono fondamentali quando si sviluppa un nuovo test IHC10.
Per bersagli ben definiti con modelli di espressione cellulare caratteristici, i controlli tissutali sono frequentemente utilizzati negli sviluppi del metodo IHC. Sulla base di una grande quantità di dati precedenti, si può determinare se l'anticorpo sta marcando il tessuto, la cellula e il compartimento subcellulare in cui è noto per essere espresso, e che non sta etichettando componenti tissutali dove non dovrebbe essere presente11. Tuttavia, i controlli tissutali sono di uso limitato per nuovi bersagli scarsamente caratterizzati senza modelli di espressione noti o per proteine che sono ampiamente espresse e mancano di modelli di espressione distinti. In entrambi questi scenari, la mancanza di un modello di espressione ben definito rende impossibile discriminare l'etichettatura specifica da quella non specifica nei tessuti. In queste situazioni, i pellet cellulari offrono una valida alternativa di controllo IHC. I controlli del pellet cellulare possono includere: cancro o altre linee cellulari che hanno livelli di espressione endogena o intrinseca / non indotta della proteina di interesse e la cui espressione proteica può essere caratterizzata da western blotting, analisi citometriche a flusso o estrapolata dalla profilazione trascrizionale; linee cellulari ingegnerizzate che sovraesprimono la proteina di interesse o hanno il gene codificante di interesse cancellato; o cellule che sono state trattate in condizioni specifiche per indurre espressione proteica o eventi di segnalazione di interesse (ad esempio, fosforilazione)10,12. Livelli di espressione proteica ben caratterizzati nelle linee cellulari consentono anche di valutare la sensibilità di un test utilizzando un pannello di linee cellulari con espressione proteica alta, media, bassa e assente. Inoltre, i pellet cellulari ingegnerizzati possono essere preziosi controlli specifici per specie per le specie veterinarie, per le quali può esserci una caratterizzazione limitata o controlli tissutali disponibili13. Mentre i pellet cellulari hanno i loro limiti, come il proteoma limitato presente nelle linee cellulari che non riflettono il diverso proteoma nei tessuti, servono come controlli adatti per confermare che l'anticorpo può rilevare il bersaglio di interesse e per escludere il legame indiscriminato da parte dell'anticorpo primario, dell'anticorpo secondario o di altri reggenti nel saggio10.
La maggior parte dei tessuti in patologia diagnostica e investigativa sono fissati in formalina tamponata neutra, disidratati in una serie di alcoli, eliminati in xilene e lavorati e incorporati in cera di paraffina. La fissazione della formalina lega le proteine e la fissazione e ogni fase aggiuntiva nella lavorazione dei tessuti possono influenzare direttamente le proteine e la capacità degli anticorpi di rilevarle 9,14. Pertanto, è importante che tutti i controlli utilizzati in un test IHC siano sottoposti alle stesse procedure di fissazione, elaborazione dei tessuti e incorporamento. Questo articolo descrive le considerazioni uniche per elaborare e incorporare cellule coltivate per fungere da controlli per lo sviluppo di saggi IHC in tessuti incorporati in paraffina fissati in formalina, con la metodologia incentrata principalmente sulla manipolazione e la lavorazione del pellet cellulare in un laboratorio di istologia.

<table><tbody><tr><td>Formalina tamponata neutra al 10%</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 mL</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>#0747-1886</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>95% Etanolo</td><td>Koptec</td><td>V1101</td><td></td></tr><tr><td>Bende per biopsia</td><td>Surgipath Medical Industries, Inc</td><td>#01090</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette sierologico pipetta 10mL</td><td>Corning</td><td>CLS4101</td><td></td></tr><tr><td>Flex 100</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>Flex 95</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>#R904012</td><td></td></tr><tr><td>Leica Automated Rotary Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatola, estremità arrotondate e coniche</td><td>Tedd Pella</td><td>#13510</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT imager per vetrini interi</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Infiltrazione/inclusione tissutale Paraffina</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Controller</td><td>CAPP</td><td>PA-100</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Alcool</td><td>Epredia</td><td>9111</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Sterling da 5" Punta da 2 mm con occhiello</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>#RS-9522</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio a carica positiva Superfrost Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr><tr><td>Cassette per tessuti; PrintMate Cassetta Scanalata</td><td>Epredia</td><td>B851120WH</td><td></td></tr><tr><td>TMA Tissue Grand Master</td><td>3DHistech LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td></td></tr></tbody></table>

elaborazione standardizzata per controlli immunoistochimici di pellet cellulari fissati in formalina e incorporati in paraffina

Standardized Processing for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Immunohistochemistry Controls

I controlli positivi e negativi con espressione nota di proteine bersaglio sono essenziali per lo sviluppo di saggi di immunoistochimica (IHC). Mentre i controlli tissutali sono utili per proteine ben caratterizzate con modelli di espressione tissutale e cellulare definiti, sono meno adatti per lo sviluppo iniziale di saggi IHC per proteine nuove, scarsamente caratterizzate o espresse ubiquitariamente. In alternativa, a causa della loro natura standardizzata, i pellet cellulari, comprese le linee cellulari tumorali con livelli definiti di espressione proteica o trascritta (ad esempio, alta, media e bassa espressione), linee cellulari trasfettate che sovraesprimono o linee cellulari con geni cancellati attraverso tecnologie di ingegneria cellulare come CRISPR, possono servire come controlli preziosi, specialmente per la caratterizzazione e la selezione iniziale degli anticorpi. Affinché questi pellet cellulari possano essere utilizzati nello sviluppo di saggi IHC per tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina, devono essere elaborati e incorporati in modo da ricapitolare le procedure utilizzate per la lavorazione dei tessuti. Questo protocollo descrive un processo per la creazione e l'elaborazione di controlli di pellet di celle fissati in formalina e incorporati in paraffina che possono essere utilizzati per lo sviluppo del metodo IHC.

Dopo l'aggiunta del gel a base di agarosio, il pellet cellulare deve formare una massa gelatinosa solida suscettibile di manipolazione (Figura 1B). Una volta incorporato, il pellet avrà una consistenza simile a un tessuto solido e dovrebbe essere relativamente facile da sezionare regolarmente su un microtomo. Una volta che i pellet cellulari sono incorporati, possono essere utilizzati negli esperimenti di istologia e IHC in modo identico ai tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina. Ciò include l'uso di epitopi indotti dal calore o il recupero dell'antigene enzimatico con metodi di rilevazione cromogenica indiretta (ad esempio, utilizzando un anticorpo secondario con perossidasi di rafano e rilevamento di diaminobenzidina come mostrato nelle figure 2 e 3) utilizzando piattaforme IHC commerciali9. Istologicamente, le cellule dovrebbero essere uniformemente disperse in tutta la sezione con un aggregazione cellulare minimo, sebbene le cellule aderenti possano mantenere le loro interazioni cellula-cellula nel pellet. Questa dispersione consente la distinzione tra le singole cellule, sebbene questa distinzione sia significativamente influenzata dalla dimensione della cella e dalla densità relativa all'interno del pellet di gel. Il nucleo, il citoplasma e la membrana cellulare sono più distinti e più facili da visualizzare dopo la dispersione (Figura 2). Nella Figura 2, tre linee cellulari sono immunomarcate per il fattore di trascrizione TEE. L'immunomarcatura viene visualizzata con il cromogeno della diaminobenzidina bruna (DAB). Le linee cellulari hanno diversi livelli di espressione del fattore di trascrizione TEE, che vanno da nessuna espressione (Figura 2A) a espressione debole (Figura 2B), a forte espressione (Figura 2C). In questo esempio, la marcatura è osservata nel nucleo, come ci si aspetterebbe da un fattore di trascrizione, ed è assente dal citoplasma e dalla membrana cellulare, che sono visibili ma mancano di etichettatura (Figura 2). I pellet cellulari possono essere incorporati in microarray di pellet cellulari (Figura 3) su vetrini standard da 23 mm x 75 mm x 1 mm. L'incorporazione dei pellet di cella in un microarray consente la valutazione di controlli con diversi livelli di espressione nello stesso vetrino. In questo esempio, le cellule staminali embrionali di topo carenti di PEG10 (a sinistra) fungono da controllo negativo e le cellule 293T che sovraesprimono PEG10 (a destra, immunomarcatura marrone) fungono da controllo positivo nel microarray (Figura 3). Non vi è alcuna variazione nelle procedure di tessuto e incorporamento per i pellet cellulari che saranno inclusi nei microarray e i microarray possono essere generati utilizzando metodi simili a quelli utilizzati per i tessuti19.
<img alt="Flusso di lavoro per l'elaborazione e l'incorporamento delle celle, diagramma che mostra i passaggi dalla preparazione del campione al sezionamento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Lavorazione di pellet di celle . (A) Le celle sono pellettate in tubi conici da 50 mL e miscelate con il gel. (B) Una volta solidificati, i pellet vengono tagliati in serie per adattarsi a una cassetta di tessuto di 26 mm x 26 mm x 5 mm. (C) I pellet cellulari sono avvolti in carta da biopsia prima di essere collocati nel processore tissutale. (D) Fino a tre pellet di celle possono essere raccolti in serie su un singolo vetrino istologico da 25 x 75 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Risultati dell'immunoistochimica; colorazione degli anticorpi in campioni di tessuto; marcatori cellulari etichettati A, B, C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Pellet cellulari con diversi livelli di espressione proteica o trascritta possono essere utilizzati per valutare la gamma dinamica del test. I pellet cellulari sono immunomarcati per il fattore di trascrizione TEAD e dimostrano diversi livelli di espressione di TEED. (A) Le cellule DAUDI mancano di espressione di TEAD e non hanno immunomarcazione nel citoplasma o nel nucleo. La macchia blu è la controcolorazione dell'ematossilina del nucleo. (B) Le cellule 293T mostrano una debole marcatura nucleare (cromogeno della diaminobenzidina bruna (DAB)) del fattore di trascrizione TEAD. (C) Le cellule Detroit 562 esprimono fortemente TEAD come dimostrato dall'intensa marcatura marrone nel nucleo. L'etichettatura all'interno del nucleo, ma non del citoplasma (regione da bianco sporco a grigia attorno al nucleo marrone), dimostra l'etichettatura appropriata del test immunoistochimico. Si noti che in tutte e tre le linee cellulari, le cellule sono disperse, consentendo la visualizzazione delle singole cellule, comprese le loro morfologie nucleari e citoplasmatiche. Barra di scala = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Processo di colorazione cellulare; immagine al microscopio che confronta campioni di tessuto; evidenzia le differenze nella densità cellulare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Il microarray di pellet di celle creato utilizzando più pellet cellulari con diversi livelli di espressione proteica consente la valutazione simultanea dei controlli in un singolo vetrino. Le cellule staminali embrionali di topo carenti di PEG10 (a sinistra) e le cellule 293T che sovraesprimono PEG10 (a destra) sono immunomarcate per PEG10. Mentre una forte marcatura (cromogeno DAB marrone) è osservata nelle cellule 293T che sovraesprimono PEG10, nessuna marcatura è evidente nelle cellule carenti di PEG10. Il blu rappresenta la controcolorazione dell'ematossilina. Barra di scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Presentato qui è un protocollo per la generazione di controlli del pellet cellulare fissati in formalina e incorporati in paraffina per l'immunoistochimica.

Elaborazione standardizzata per controlli immunoistochimici di pellet cellulari fissati in formalina e incorporati in paraffina

Positive and negative controls with known expression of target proteins are essential for the development of immunohistochemistry (IHC) assays. While ...

Controlli positivi e negativi del pellet cellulare ben caratterizzati con livelli definiti di espressione proteica o trascritta sono essenziali per lo sviluppo di saggi immunoistochimici. Questo protocollo descrive un processo per la creazione e l'elaborazione di controlli di pellet cellulari fissi con paraffina. Tali controlli possono essere utilizzati per caratterizzare la specificità di legame durante lo sviluppo di un nuovo saggio immunoistochimico.I saggi IHC sono fondamentali per i nostri sforzi di scoperta e sviluppo di biomarcatori in tutte le aree terapeutiche e lo sviluppo di controlli convalidati è essenziale per lo sviluppo di questi test. È essenziale riscaldare il gel a base di idrossietilagarosio ad almeno 40 gradi Celsius prima di aggiungerlo al pellet cellulare. Il gel deve essere ben miscelato con le cellule prima di solidificarsi.Inizia la fissazione del pellet di 293 celle aggiungendo 30 millilitri di formalina tamponata neutra al 10% a un pellet di celle da tre millilitri per creare un rapporto fissativo a cella di 10 a uno. Risospendere le celle invertendo ripetutamente il tubo da 50 millilitri strettamente tappato e lasciarle depositare durante la notte a temperatura ambiente. Per migliorare la fissazione, aumentare il rapporto superficie/volume invertendo il tubo il giorno successivo e risospendendo le celle.Dopo 24 ore di fissaggio, centrifugare il tubo a 930 volte G a cinque gradi Celsius per 10-15 minuti. Assicurarsi che il pellet cellulare sia visibile e rimuovere il fissativo travasandolo o aspirandolo con cura utilizzando una pipetta di trasferimento sterile. Aggiungere gel fuso a base di idrossietilagarosio a 40-60 gradi Celsius al pellet con un rapporto da uno a quattro gel a cellula.Utilizzare una sonda sterling pulita da cinque pollici e due millimetri con un occhio risciacquato con acqua di rubinetto per mescolare delicatamente il contenuto del tubo conico da 50 millilitri, creando una sospensione uniforme di cellule fisse nel gel fuso sul fondo. Dopo aver sospeso uniformemente le cellule fisse nel gel fuso, tappare il tubo cronico e posizionarlo sul ghiaccio bagnato per cinque-10 minuti. Una volta che il pellet di gel si solidifica, posizionare con attenzione una microspatola pulita lungo il lato del tubo e sfruttare delicatamente il pellet senza perforarlo.Posizionare il pellet solidificato sulla carta da biopsia. Utilizzando una microspatola pulita, tagliare il pellet cellulare in fette spesse da quattro a cinque millimetri per adattarle a una cassetta di tessuto da 26 millimetri per 26 millimetri per cinque millimetri. Posizionare le singole fette di pellet di gel al centro di un pezzo di carta da biopsia.Piegare i due lati opposti e avvolgere la fetta in carta prima di metterla in una cassetta di carta da 26 x 26 per cinque millimetri. Chiudere il coperchio. Posizionare la cassetta del pellet di cella tagliata nella storta del processore tissutale riempita con formalina tamponata neutra al 10% ed eseguire un breve programma di elaborazione.Per incorporare il pellet cellulare, posizionare le cassette lavorate nell'area di attesa del centro di incorporamento. Aprire il coperchio della cassetta del tessuto e aprire con attenzione la carta da biopsia. Posizionare il pellet cellulare in un piccolo stampo monouso da 15 x 15 millimetri con il lato tagliato verso il basso.Mentre si tiene delicatamente il pellet cellulare sul fondo dello stampo con una pinza, aggiungere un'infiltrazione tissutale di 62 gradi Celsius o incorporare la paraffina nello stampo, coprendo il pellet cellulare. Spostare lo stampo in un blocco freddo per solidificare la paraffina. Regolare il pellet cellulare mentre la paraffina si sta solidificando e fissarlo nella posizione appropriata sul fondo dello stampo.Rimuovere il coperchio dalla cassetta. Posizionare il lato inferiore della cassetta sopra lo stampo incorporato e aggiungere ulteriore paraffina fusa per coprire la cassetta. Quando la paraffina viene riempita sulla cassetta di tessuto, riportare lo stampo nel blocco freddo per la solidificazione.Prelevare le sezioni di paraffina preparate con il microtomo rotante dal bagno di flottazione su vetrini caricati positivamente. Posizionare la prima sezione nella parte superiore della diapositiva all'interno del bordo della vetrina e della colorazione, quindi posizionare in serie le sezioni successive una sotto l'altra. Una volta fatto, asciugare i vetrini inizialmente a 23 gradi Celsius per 24 ore, poi a 60 gradi Celsius per 30 minuti.Il pellet cellulare incorporato preparato con questo metodo ha mostrato una distribuzione uniforme delle cellule in tutta la sezione, con aggregazione minima delle cellule e interazioni nel pellet. Quando l'immunomarcatura è stata visualizzata con il diaminobenzene bruno, il cromogeno e tre linee cellulari sono stati osservati livelli variabili dell'espressione del fattore di trascrizione TEAD nel nucleo, che vanno da no, a debole, all'espressione forte. L'incorporazione dei pellet di cella in un microarray ha permesso la valutazione di controlli con diversi livelli di espressione nello stesso vetrino senza variazioni nelle procedure.Come mostrato in questo esempio, si può osservare un controllo negativo delle cellule staminali embrionali di topo carenti di PEG 10 e un controllo positivo delle cellule 293T che sovraesprimono PEG 10. Garantire che le cellule siano fissate adeguatamente e distribuite in modo omogeneo in tutto il pellet di gel crea un controllo uniforme del dosaggio standardizzato. I pellet cellulari possono essere utilizzati come controlli nei saggi di immunoistochimica a valle e ibridazione NC2 con metodi standard di recupero ed etichettatura dell'antigene.I controlli del pellet cellulare hanno permesso lo sviluppo di molti saggi immunoistochimici, in particolare per proteine nuove o minimamente caratterizzate. Servono come controlli ben definiti che possono aiutare a caratterizzare la specificità degli anticorpi.

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