Raccolta di dati dai cristalli delle macromolecole biologiche e completamente autonoma caratterizzazione
22 marzo 2019
Qui, descriviamo come utilizzare lo screening automatizzato e opzioni di raccolta di dati disponibili presso alcune beamlines di sincrotrone. Scienziati inviare campioni di cryocooled per il sincrotrone e le proprietà di diffrazione sono selezionate, gli insiemi di dati sono raccolti e trattati e, ove possibile, una soluzione di struttura avviene — tutto senza intervento umano.
La cristallografia a raggi X è la tecnica dominante per determinare le informazioni strutturali 3D dalle proteine. Le linee del fascio di sincrotrone sono necessarie per ottenere dati dai piccoli cristalli debolmente diffrattici prodotti dalle proteine. Massive one è una linea di travi unica perché automatizza completamente il processo di raccolta dei dati dalle macromolecole biologiche.
Dal montaggio di esempio, dalla posizione e dalla raccolta dei dati finali. L'automazione completa di questo tipo è molto importante in quanto consente ai ricercatori di trascorrere il loro tempo in laboratorio, invece di raccogliere dati sulla linea del fascio. La linea del fascio è anche intelligente e, in media, può raccogliere dati migliori rispetto a quando la linea del fascio è gestita dall'uomo.
Per iniziare questo protocollo, eseguire il montaggio cristallino e richiedere il tempo del fascio su Massive one come descritto nel protocollo di testo. Passare al sistema informativo per le linee del fascio di cristallografia proteica o al sito Web ISPyB. Scegli gli esperimenti MX, accedi con il numero dell'esperimento e la password.
Clicca sulla spedizione, aggiungi nuovo e fornisci le informazioni necessarie. Quindi fare clic su Salva. Fare clic su Aggiungi pacco e compilare le informazioni richieste.
Fare clic su Salva, quindi su Aggiungi contenitore. Assegnare il nome al codice a barre del disco e scegliere il disco spinale, quindi fare di nuovo clic su Salva. Fare clic sul simbolo del contenitore e modificare e compilare le informazioni necessarie relative ai campioni come il nome della proteina, il flusso di lavoro preferito e la posizione del cristallo, nel disco.
Scegli la proteina che è stata approvata dal gruppo di sicurezza ESRF. Immettere un nome di esempio univoco per identificare ogni singolo campione. Facoltativamente, scansionare il codice a barre del pin.
Anche il resto delle informazioni da includere è facoltativo. Per ogni singolo campione, immettere il tipo di esperimento. Questo definisce quale flusso di lavoro automatico verrà utilizzato per elaborare ogni cristallo.
Dato che i cristalli GCSH sono aghi, scegliere MX press P.Next, inserire un gruppo spaziale. Se presente, questo verrà utilizzato per i calcoli della strategia di raccolta dei dati e per le tubazioni automatiche di elaborazione dei dati disponibili. Immettere la risoluzione desiderata.
Questo definisce la distanza dal cristallo al rivelatore dalle scansioni iniziali della mesh, dalla caratterizzazione e dalla raccolta dei dati predefinita. Ora, impostare la risoluzione di soglia desiderata per impedire la raccolta di set di dati completi da cristalli che non si diffrazionano a questo limite. Ciò consente di risparmiare spazio di archiviazione dei dati e analizza il tempo.
Impostare la completezza richiesta. Quindi impostare la molteplicità richiesta. Se più di un cristallo è contenuto nel supporto del campione, impostare il numero massimo di cristalli da analizzare.
Il valore predefinito è uno o cinque per MX press P.È possibile selezionare anche la dimensione del fascio appropriata. Inserire il gruppo spaziale, se noto, nella colonna del gruppo spaziale force. Quindi impostare la sensibilità alle radiazioni dei cristalli.
Se lo si desidera, impostare l'angolo di rotazione totale da raccogliere per la raccolta completa dei set di dati. Una volta che tutte le informazioni sono state immesse nel sistema, salvare i valori. Clicca, torna alle spedizioni e premi invia la spedizione a ESRF.
Stampare l'etichetta di spedizione e inviare i campioni. Gli utenti devono organizzare un ritiro con un corriere utilizzando i dettagli dell'account ESRF. Il giorno dell'esperimento, i campioni vengono trasferiti al Massive one high capacity dew-er.
Gli scienziati beam line lanciano quindi la raccolta dei dati, che può essere seguita dagli utenti da remoto. Per ogni tipo di esempio diverso, gli utenti ricevono un messaggio di posta elettronica che informa che la raccolta dei dati è iniziata. L'esecuzione di tutti i passaggi in tutti i flussi di lavoro può essere seguita online e in tempo reale.
Questo è accessibile all'utente accedendo a ISPyB. I risultati possono anche essere visualizzati e scaricati. Per ogni campione analizzato, esaminare i risultati dell'esperimento automatico su ISPyB.
Clicca sulla sessione sperimentale desiderata su ID30A1. Selezionare la pipeline di elaborazione automatica preferita. Scarica i dati scritti nel gruppo spaziale corretto con la massima completezza e massima risoluzione.
Cliccando sugli ultimi risultati raccolti e quindi scaricando. Il flusso di lavoro MX press P è stato utilizzato dalla linea di fascio ESRF Massive one per montare completamente automaticamente, centrare nel fascio di raggi X, caratterizzare e raccogliere set di dati di diffrazione completa da una serie di cristalli di GCSH umano. I campioni sono stati montati e il ciclo analizzato per un'area da scansionare.
Dopo le analisi di diffrazione, sono stati selezionati quattro punti all'interno del cristallo per la raccolta dei dati. La determinazione manuale della struttura mediante sostituzione molecolare ha prodotto una mappa ad alta densità elettronica di alta qualità dopo un singolo ciclo di perfezionamento automatizzato. Per questo set di dati, la pipeline automatizzata ha tagliato i dati con una risoluzione di un punto tre due angstrom.
Tuttavia, gli utenti possono decidere di tagliare i dati a una risoluzione inferiore. La densità elettronica continua è visibile per l'intera catena degli amminoacidi a parte l'etichetta eterminale dell'istidina. Delle quattro sostituzioni che distinguono la GCSH umana e bovina, tre sono facilmente identificabili nella densità degli elettroni.
Questo è meno chiaro per l'acido aspartico per la sostituzione della lisina 125. Per il quale la densità elettronica della catena laterale è risolta solo parzialmente a causa della flessibilità. Il modello attualmente ottenuto ha un valore di lavoro R di 20 punti quattro per cento e un valore libero R del 23 punti otto per cento e può essere ulteriormente ottimizzato da cicli aggiuntivi di costruzione e perfezionamento di modelli automatizzati e manuali.
È importante adattare i requisiti al sistema. Ad esempio, l'impostazione della risoluzione già osservata su un valore noto può risparmiare tempo e garantire una migliore raccolta dei dati. La raccolta completamente automatica dei dati ha democratizzato la cristallografia e ora anche i piccoli laboratori possono intraprendere un progetto famoso quando questo era fattibile prima solo con un'enorme potenza dell'uomo.
Panoramica
Questo articolo descrive il processo di screening automatizzato e raccolta dati presso le linee di fascio dei sincrotroni per la cristallografia proteica. Il sistema completamente automatizzato consente ai ricercatori di raccogliere ed elaborare in modo efficiente i dati da campioni crioraffreddati senza intervento umano.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Cristallografia proteica
- Diffrazione a raggi X
- Automazione nella raccolta dati
Conoscenze di base
- La cristallografia a raggi X è essenziale per determinare le strutture proteiche.
- Le linee di fascio dei sincrotroni sono cruciali per ottenere dati da cristalli che diffrattano debolmente.
- L'automazione migliora l'efficienza e la qualità della raccolta dati.
- Massive one offre un flusso di lavoro completamente automatizzato per le macromolecole biologiche.
Obiettivo dello studio
- Dimostra il processo di raccolta dati automatizzata presso le linee di fascio dei sincrotroni.
- Evidenziare i vantaggi dell'automazione nella cristallografia proteica.
- Fornire un protocollo dettagliato da seguire per i ricercatori.
Metodi utilizzati
- Montaggio del campione e spedizione al sincrotrone.
- Utilizzo del sistema informativo ISPyB per la gestione degli esperimenti.
- Workflow automatizzati per la raccolta e l'elaborazione dei dati.
- Monitoraggio in tempo reale della raccolta dati e analisi dei risultati.
Risultati principali
- Raccolta con successo di dati di diffrazione di alta qualità da cristalli di GCSH umani.
- L'elaborazione automatizzata ha prodotto una mappa ad alta risoluzione della densità elettronica.
- Identificate differenze strutturali tra GCSH umano e bovino.
- Dimostrazione dell'efficacia dei workflow automatizzati in cristallografia.
Conclusioni
- L'automazione nella raccolta dati democratizza l'accesso alla cristallografia.
- I laboratori più piccoli possono ora intraprendere progetti complessi precedentemente limitati a strutture più grandi.
- L'adattamento dei parametri sperimentali può migliorare l'efficienza della raccolta dati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
