Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

Ciao e benvenuto nel Gruppo di Biologia Strutturale e Funzionale delle Membrane. Mi chiamo Martin Caffery. Questo è un altro di una serie di articoli sulla cristallizzazione delle proteine di membrana per la determinazione strutturata utilizzando il metodo della fase cubica in meso o lipica.

Nel primo articolo, Jo di 1 7 1 2, abbiamo dimostrato come viene preparata la fase cubica carica di proteine e come la fase misa viscosa e appiccicosa viene dispensata manualmente in piastre di cristallizzazione a sandwich di vetro per prove di cristallizzazione. Questo articolo video descriverà il metodo di raccolta e crioraffreddamento dei cristalli coltivati con il metodo in meso. Qui sono mostrati i materiali e le attrezzature necessarie per raccogliere e criogenicare i cristalli cresciuti nel meso.

Includono un quaderno di laboratorio in cui registrare informazioni sui cristalli e dettagli di raccolta per futuri riferimenti sicuri, occhiali di sicurezza, contenitori per rifiuti in vetro e metallo, la piastra di cristallizzazione a sandwich di vetro da cui verranno raccolti i cristalli. I cristalli contengono pozzetti sono contrassegnati in modo leggibile, uno strumento da taglio in vetro per l'apertura dei pozzetti di cristallizzazione dei tessuti e una bottiglia d'acqua pinzette curve soluzione di schermo precipitante, una micropipetta e punte criogeniche per la raccolta di cristalli, una bacchetta magnetica, un pok per la conservazione criogenico raffreddato loop contenente cristalli. Un esecutore di schiuma riempito con azoto liquido per il crioraffreddamento, le pinze per cristalli, un esecutore di trasporto o stoccaggio e un microscopio per la raccolta.

In preparazione per la raccolta, il raccoglitore di schiuma deve essere riempito con azoto liquido e posizionato accanto al microscopio dove deve avvenire la raccolta in anticipo. Il disco di stoccaggio con l'estremità aperta verso l'alto deve essere immerso nell'azoto liquido nell'esecutore e lasciato raffreddare un anello criogenico di dimensioni che corrispondono al cristallo da raccogliere deve essere fissato su un micro supporto sulla bacchetta magnetica con tutti i materiali e le attrezzature in posizione. Il nostro prossimo compito è identificare piastre e pozzetti che contengono cristalli.

Possiamo farlo in due modi. Il metodo più semplice e diretto consiste nell'ispezionare i pozzetti a mano utilizzando un microscopio a luce normale e a luce polarizzata. Il secondo metodo me si avvale di un imager in cui le lastre vengono schermate automaticamente con luce normale e polarizzata.

Le immagini digitali vengono registrate dall'imager e valutate sul monitor di un computer. I pozzetti con cristalli per la raccolta devono essere etichettati in modo chiaro. I commenti sulle dimensioni, la qualità e la posizione dei cristalli nel misage devono essere registrati sul taccuino o su un computer.

Questo aiuterà nella fase di raccolta. Qui, una piastra contenente cristalli per la raccolta viene rimossa dall'imager che apre il pozzetto. Le piastre in cui crescono i cristalli con il metodo meso finale sono piastre sandwich di vetro del tipo mostrato qui. Per accedere alla malattia e ai cristalli in cui si trovano, è necessario aprire il pozzo.

Questo viene fatto utilizzando un utensile da taglio per vetro per tagliare il vetro di copertura superiore che sigilla il pozzo, che può quindi essere rimosso. Esistono diversi approcci per eseguire questa operazione. Quello da utilizzare è dettato dal tipo di malattia in cui il cristallo si trova a crescere.

Questa può essere la fase cubica molto viscosa e appiccicosa, o la variante più fluida indicata come fase spugna. In questo articolo video, mostriamo come aprire i pozzi e raccogliere cristalli da entrambi questi materiali ospitanti. In questa sequenza video, dimostriamo due modi per incidere il vetro di copertura su un pozzo contenente la fase cubica viscosa.

L'incisione e il taglio sono mostrati in dettaglio osservandoli con un microscopio ottico. Iniziamo esaminando un singolo pozzetto di cristallizzazione e identificando le sue diverse parti. La prima freccia rossa indica il bolo di mease che contiene i cristalli.

Per inciso, i cristalli non sono visibili in questa particolare sequenza. La seconda freccia indica la soluzione precipitante che circonda la malattia. La terza freccia punta al perimetro del pozzo.

La quarta freccia indica il distanziatore a doppia asta su cui si trova il vetro di copertura utilizzando il tagliavetro. Il vetro di copertura è leggermente inciso con due cerchi concentrici situati appena fuori dal perimetro del pozzo. Il tagliavetro viene quindi utilizzato per rompere il vetro nello spazio tra i due cerchi incisi.

Allo scopo di rilasciare il vetro di copertura interno, questo genera molti frammenti di vetro e polvere, che possono essere rimossi con un tovagliolo umido e di carta. Il vetro di copertura liberato poggia sul distanziale lungo il suo bordo circolare. Il vetro di copertura viene rimosso afferrandolo con una pinzetta a punta fine e inclinandolo lontano e fuori dal pozzo.

In questo caso, la fase cubica rimane bloccata e in posizione alla base del pozzo. Una parte del precipitante viene rimossa con il vetro di copertura, ma una frazione considerevole di precipitante rimane in posizione attorno al bolo di masticazione. Ingrandendo, otteniamo una visione più chiara della secca cubica, che ora è pronta per l'uso nella raccolta dei cristalli.

Nella sequenza successiva, mostriamo un secondo modo per aprire un pozzo di cristallizzazione contenente la fase cubica viscosa. In questo caso, nel vetro di copertura su un lato del pozzetto vengono realizzate ulteriori linee diritte e a coppa che si estendono attraverso il pozzo stesso. Ciò consente un più facile accesso e rimozione del vetro di copertura da parte delle pinzette.

In questa particolare dimostrazione, il vetro di copertura si rompe e nel liberare il vetro di copertura dallo spazio appiccicoso o dalla superficie, il vetro di copertura stesso si muove e il precipitante si separa dalla fase cubica. Quando il vetro di copertura viene sollevato, parte del precipitante va con esso. L'inserto mostra una vista ingrandita del processo.

Ora ci ritroviamo con un bolo esposto di mease senza alcun precipitante circostante per evitare che la mease si secchi e subisca un cambiamento di fase, che potrebbe danneggiare i cristalli. Il precipitante fresco viene aggiunto sopra il bolo utilizzando un micro preparato. Il bolo è ora pronto per essere utilizzato nella raccolta dei cristalli.

La fase di spugna è un po' meno indulgente da lavorare a causa della sua capacità di fluire. Se quel flusso si traduce nella fase di spugna, il contatto con il perimetro della popolarità del pozzo lo tirerà fuori e i cristalli andranno persi. Un esempio di ciò che accade è mostrato nel prossimo videoclip.

Inizia con uno zoom avanti sulla fase della spugna e poi passando avanti e indietro tra la luce polarizzata normale e quella incrociata. I cristalli che possono essere individuati con una certa difficoltà in condizioni di luce normale sono chiaramente visibili tra i polarizzatori incrociati come flessione luminosa su uno sfondo nero. In preparazione per l'apertura del pozzo, il vetro di copertura viene inciso e tagliato come descritto sopra.

Nel processo, tuttavia, il vetro di copertura si rompe dove non dovrebbe. Alcune manipolazioni vengono eseguite al fine di continuare il processo di apertura del pozzo, ma il precipitante si sposta nella direzione della fessura e alla fine viene a contatto con il distanziatore, e per fortuna con il precipitante va parte della fase di spugna, e naturalmente il suo carico. Naturalmente, i cristalli in questa particolare sequenza, i polarizzatori al microscopio non sono completamente incrociati e i cristalli possono essere visti come oggetti luminosi nello stesso momento in cui il pozzetto e il suo contenuto rimangono visibili.

Nella clip successiva, mostriamo come il problema viene risolto rimuovendo prima il precipitante in eccesso. Iniziamo zoomando sulla fase di spugna e individuiamo un cristallo, sia una luce normale che tra i polarizzatori incrociati, un segmento di occhiali di copertura incornato e tagliato, e poi rimosso con cura da sopra. La luce polarizzata viene utilizzata ancora una volta per tenere d'occhio il cristallo, che si illumina piacevolmente.

Un pezzo di carta velina asciutta viene introdotto attraverso l'apertura nel vetro di copertura e nel pozzetto fino a toccare appena la soluzione precipitante. La soluzione viene eliminata con cura fino a quando non è quasi tutta sparita e la fase di spugna inizia a muoversi nella direzione dello stoppino. La rimozione del tessuto provoca la ritrazione del precipitante rimanente e della fase di spugna con i cristalli ancora in posizione sotto il vetro di copertura.

Una ripetizione al rallentatore di quest'ultima sequenza è mostrata qui per chiarezza. Il resto del vetro di copertura è incornato e tagliato. Come descritto in precedenza, il vetro di copertura viene ora sollevato con le pinzette.

L'inserto mostra una vista ingrandita del processo. In questo caso particolare, la fase di spugna spacca alcuni resti nel pozzetto e alcuni si attaccano al vetro di copertura. Si scopre che il cristallo si trova nel bolo sul vetro di copertura con i polarizzatori a croce.

Il cristallo è chiaramente visibile nella fase di spugna, ma poiché è presente pochissimo precipitante, inizia a subire una transizione di fase probabilmente dovuta all'essiccazione. Questo può essere visto come un anello di frange biologiche che migra verso il centro del bolo. Aggiungendo precipitante al bolo, il processo può essere interrotto e invertito in preparazione per la fase successiva, che consiste nella raccolta dei cristalli.

Dopo aver aperto il pozzo ed esposto la fase di Misa ospitante, il passo successivo del processo è la raccolta dei cristalli. Nelle clip seguenti, mostriamo esempi di raccolta dalla fase cubica e dalla fase di spugna. La fase mea nel pozzetto appena aperto viene esaminata al microscopio per individuare i cristalli adatti.

Passare avanti e indietro tra la luce normale e quella polarizzata può aiutare notevolmente questo processo. Le soluzioni precipitanti dovrebbero essere a portata di mano e disponibili da aggiungere al bolo per rallentare o fermare l'essiccazione. Un crio circuito montato viene quindi utilizzato per sondare la fase di visto appena esposta alla ricerca di cristalli per pescare i cristalli e quindi immergerli nel crio circuito in azoto liquido nel dur immediatamente dopo la raccolta.

In quanto segue, mostriamo la raccolta prima dalla fase cubica viscosa e appiccicosa in questa sequenza di raccolta fino a quattro frange di Biore, e i cristalli possono essere visti nel bolo della fase cubica utilizzando la luce polarizzata. Il ciclo criogenico entra da destra, raccoglie il cristallo con il minor numero possibile di aderenze, viene immediatamente crioraffreddato e il circuito viene posizionato nel disco di stoccaggio sotto azoto liquido. Il processo di raccolta viene ripetuto tre volte in questa clip.

Ogni volta che il polarizzatore viene utilizzato per controllare la posizione del cristallo. Poiché non è possibile cercare il cristallo nel ciclo criogenico dopo la raccolta, è una buona idea controllare la fase mesa da cui è stato raccolto il cristallo per verificare che non sia più lì, suggerendo che è stato raccolto con successo. Nella sequenza successiva, viene mostrata la raccolta dalla fase di spugna più fluida, come con la fase cubica, poiché una piccola parte della fase di spugna dovrebbe essere raccolta e rimanere con il cristallo.

Più c'è nel ciclo criogenico che circonda il cristallo, più difficile sarà localizzare il cristallo a occhio. Per la raccolta dei dati di diffrazione e la maggiore dispersione di fondo, contribuirà durante la misurazione della diffrazione. Nella sequenza successiva, mostriamo il processo di crioraffreddamento, che dovrebbe avvenire immediatamente.

Il cristallo viene raccolto nel minor tempo possibile tra l'evento di raccolta effettivo e l'immersione in azoto liquido. Dopo aver immerso l'anello montato nell'azoto liquido, viene posizionato in una delle fessure di supporto del disco di stoccaggio nella porta, posizione numero uno in questo caso, e rilasciato dalla bacchetta magnetica. A questo punto, la posizione e i dettagli dei cristalli raccolti e crioraffreddati dovrebbero essere registrati sul taccuino e/o sul computer.

Quando il disco nel cassetto della schiuma è pieno, o hai finito di raccogliere per la giornata, trasferisci il disco in un portadisco riposto in un deposito o in un trasporto J riempito di azoto liquido. Le prossime due immagini sono di cristalli criogenici raffreddati in criocicli che sono stati raccolti. Seguendo il protocollo di cui sopra, i cristalli possono essere visti chiaramente all'interno della fase meza nel loop.

In questo caso, tuttavia, il cristallo non è visibile e dovrebbe essere localizzato mediante innalzamento di diffrazione. Il passo successivo nel processo complessivo di determinazione strutturata utilizzando la cristallografia macromolecolare è quello di raccogliere una frazione di dati sui cristalli raccolti, come dimostrato in questo articolo. Questo di solito viene fatto utilizzando la radiazione X di sincrotrone ed è il fulcro di un articolo separato di questa serie.