Name: Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 45 s
Description: Impara le tecniche di raccolta e crioconservazione di cristalli di proteine di membrana cresciute in fasi lipidiche cubiche e spugnose per la cristallografia a raggi X. Questo metodo essenziale preserva l'integrità strutturale per l'analisi.

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Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte sono della membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti, e soprattutto per Jingquan Tan e Joseph Lyons, estendiamo i nostri più sentiti ringraziamenti e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e il 7PQ COST e azioni Marie Curie (CM0902 e Pief-GA-2009 -235.612).

1. Laboratorio Set-up pre-raccolta <ol><li> In preparazione per la raccolta, compila il asciutta schiuma Dewar con azoto liquido e posizionarlo accanto al microscopio in cui la raccolta è quello di prendere posto. </li><li> Immergere il disco di memoria, aprire finiscono, in azoto liquido all&#39;interno del Dewar schiuma e lasciarlo raffreddare completamente. </li><li> Garantire un micro-montaggio di una dimensione che corrisponde il cristallo per essere raccolto su un magnete (Figura 5). È importante avere a disposizione un numero di ricambio rilevatori magnetici precaricato con micro-supporti per le situazioni in cui è necessario raccogliere cristalli diversi dai uno bolo. Bacchette di ricambio dovrebbero essere disponibili in qualsiasi momento. </li><li> Posizionare una micropipetta, suggerimenti e la soluzione precipitante che è stato utilizzato per la crescita di cristalli vicino al microscopio raccolta. Può essere necessario per coprire la mesofase e l&#39;essiccamento quando il bene viene aperto. </li><li> Hanno un quaderno e penna sul banco vicino e / oil computer aperto. Questi saranno utilizzati per registrare le osservazioni riguardanti la aspetto, la qualità, la posizione, il numero della disco, ecc, di cristalli in cui sono raccolte, crio-raffreddato e messo in deposito. </li><li> Se un assistente è disponibile per aiutare con la raccolta che la persona deve capire chiaramente il protocollo che sarà seguito, l&#39;ordine in cui le varie fasi si svolgeranno, e il loro ruolo nel processo globale. </li></ol> Con tutti i materiali e delle attrezzature in atto il nostro compito successivo è quello di: 2. Identificare Piatti e Wells che contengono cristalli <ol><li> Il metodo più semplice e diretto per la ricerca di cristalli raccoglibile è di ispezionare pozzi a mano utilizzando un microscopio con normale e con luce polarizzata incrociata. Regolazione dell&#39;intensità luminosa della luce del microscopio può aiutare con localizzazione cristalli. </li><li> In alternativa, un riproduttore di immagini in cui vengono proiettati automaticamente con piastre normale e attraversato polarizzared luce, può essere usato per cercare cristalli. </li><li> Valutare a occhio registrate immagini digitali su un monitor di computer. </li><li> Contrassegnare chiaramente quei pozzi con i cristalli per i commenti di raccolta e registrazione sulla qualità dimensione e la posizione dei cristalli nel mesofase all&#39;interno del notebook o su un computer. </li><li> Rimuovere la piastra che contiene cristalli per la raccolta dal sensore CCD. </li></ol> 3. L&#39;apertura di un bene con mesofase cubica. Metodo 1 Le piastre in cui i cristalli crescono dal metodo in meso sono lastre a sandwich di vetro (Figura 2). Per accedere mesofase ei cristalli in esso, è necessario aprire il pozzo. Questo viene fatto utilizzando un utensile di taglio per tagliare il vetro coverglass superiore che sigilla il pozzo, che può poi essere rimosso. Esistono diversi approcci per il taglio e la rimozione del coverglass da cristallizzazione in un pozzo. Quella da utilizzare è dettata dal tipo of mesofase in cui il cristallo è trovato crescere. Questa può essere la fase molto viscoso e appiccicoso cubica (Figura 3A) o la sua variante più fluido, la fase spugna (Figura 3B). In questo articolo vi mostriamo il video come aprire pozzi e per raccogliere i cristalli da entrambi questi materiali di hosting. <ol><li> Mettere il panino lastra di vetro cristallizzazione sul palcoscenico di un microscopio ottico. </li><li> Utilizzando un punteggio di taglio di vetro lo strumento coverglass leggermente con due cerchi concentrici situati sopra il distanziale e appena fuori il perimetro del pozzo. Con un utensile di taglio nuovo, punteggio richiede minima pressione applicata. Sostituire l&#39;utensile con una nuova quando la pressione necessaria per punteggio aumenta anche frazionata, questo si verifica in genere dopo l&#39;apertura di 10 pozzi. </li><li> Rompere il vetro nello spazio tra i due cerchi ottenuto al fine di rilasciare il coprioggetto interna. Questo genera un sacco di frammenti di vetro e polvere. Cancellare via con un panno umidotovagliolo di carta. </li><li> Rimuovere il coprioggetto liberata da presa con una pinzetta a punta sottili e inclinando lontano da dentro e fuori dal pozzo. In questo caso, la fase cubica rimane bloccato in posizione e sulla piastra di base del pozzo. </li><li> Lo zoom per avere una visione più chiara del mesofase cubica che ora è pronto per l&#39;uso nella raccolta cristallo. </li></ol> 4. L&#39;apertura di un Bene con mesofase Cubic. Metodo 2 <ol><li> Utilizzando il piano di taglio dell&#39;utensile punteggio rette parallele nella coverglass ad un lato del bene e che si estendono nello stesso pozzo. Ciò consente un più facile accesso alle pinzette e rimozione del coprioggetto. </li></ol> In questa dimostrazione particolare, il coprioggetto crepe a liberare il coprioggetto dalla superficie adesiva distanziale. Nel processo, il coverglass sposta in posizione e il precipitante separa dalla fase cubica. Quando il coverglass viene sollevato alcune del precipitante va con esso. Si sono lasciati con un b espostoOlus di mesofase senza precipitante circostante. Immediatamente, aggiungere 1 precipitante microlitri fresca sopra il bolo con una micropipetta per evitare mesofase si secchi e subendo un cambiamento di fase che può danneggiare i cristalli. Il bolo è pronto per essere utilizzato in cristallo raccolta. 5. L&#39;apertura di un bene con la fase spugna. Senza successo La fase di spugna è meno tollerante a lavorare a causa della sua capacità di flusso. Se che i risultati di flusso nella fase spugna contattando il perimetro della capillarità ben sguainerò mesofase ei cristalli verranno perse. Un esempio di questo si verifichi è mostrato in questo video. <ol><li> Zoom sulla fase spugna e passare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare i cristalli in fase di spugna. </li><li> In preparazione per l&#39;apertura del punteggio bene e tagliare il coprioggetto come descritto nella Sezione 3. Nel processo, il coprioggetto crepe. Nel tentativo dizione per aprire la ben precipitanti gli spostamenti in direzione della fessura e alla fine entra in contatto con il distanziatore. Con il precipitante va una parte della fase spugna e il suo carico di cristalli che sono persi. </li></ol> In questa particolare sequenza, i polarizzatori sul microscopio non sono completamente attraversato ed i cristalli possono essere visti come oggetti luminosi al tempo stesso che il bene e suoi contenuti rimangono visibili. 6. L&#39;apertura di un bene con la fase spugna. Con successo <ol><li> Zoom sulla fase spugna e individuare un cristallo, sia in condizioni normali e incrociati luce polarizzata. </li><li> Punteggio, tagliare e rimuovere una sezione del coprioggetti che copre il bene, come al punto 4.1. Incompleto attraversato luce polarizzata viene utilizzato per tenere traccia del cristallo. </li><li> Introdurre un pezzo di carta velina secco attraverso l&#39;apertura nel coprioggetto e nel pozzo fino a sfiorare la soluzione precipitante. Wick via la soluzione attentamente fino a quando non è quasi tutto andato e quindi rimuovere il tessuto. Questo fa sì che il precipitante rimanente e la fase spugna, con il cristallo ancora al suo posto, per ritrarre sotto il coprioggetto. </li><li> Punteggio, tagliare e rimuovere con una pinzetta il resto del coprioggetto, come al punto 4.1. In questo caso, la fase di spugna divide, alcuni rimane nel pozzo e alcuni bastoni al coprioggetto. Il cristallo è nel bolo sul coprioggetto. Perché c&#39;è molto poco presente precipitante, la fase di spugna inizia a subire una transizione di fase probabilmente a causa di essiccazione. Questo può essere visto come un anello di birifrangenza che migra verso il centro del bolo. Immediatamente aggiungere precipitante al bolo per fermare la transizione. Il bolo è ora pronto per l&#39;uso in cristallo raccolta. </li></ol> 7. Raccolta e Cryo-Cristalli di raffreddamento dalla fase cubica <ol><li> Andare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare cristalli nel bolo fase cubica nel pozzo aperto. In tla sequenza video fino a quattro cristalli birifrangenti può essere visto in bolo fase cubica incrociato con luce polarizzata. </li><li> Utilizzare un montato crio-loop (Figura 5) per sondare mesofase appena esposto per cristalli, per ripescare cristalli e poi immergeteli, contenuta nella crio-loop, in azoto liquido nella Dewar immediatamente dopo la raccolta. Idealmente, la raccolta e lo snap-raffreddamento dovrebbe avvenire in un unico movimento continuo e rapido. Come mesofase poco aderente possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Nella nostra esperienza, crio-protettivo non è necessaria con in meso-cresciuti cristalli. </li><li> Poiché non è possibile cercare il cristallo in crio-loop immediatamente dopo la raccolta ispezionare il bolo mesofase utilizzato per la raccolta di verificare che il cristallo non c&#39;è più suggerendo che è stato raccolto con successo. </li></ol> 8. Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento dalla fase spugna <ol><li> Andare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare cristalli nel bolo spugna fase nel pozzo aperto. In questa sequenza video molti cristalli birifrangenti può essere visto nel bolo incrociate sotto luce polarizzata. </li><li> Utilizzare un montato crio-loop (Figura 5) per ripescare cristalli dalla fase spugna e immergetele, contenuta nel o sul cryoloop, in azoto liquido nella Dewar immediatamente dopo la raccolta. Come per la raccolta dalla fase cubica, idealmente, la crio-raffreddamento di processo dovrebbe avvenire subito il cristallo viene raccolto con il minor tempo possibile, che intercorre tra l&#39;evento di raccolta reale e immergersi in azoto liquido. In fase di spugna poco aderente possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Come già detto, crio-protettivo non è necessaria con in meso-cristalli coltivati. </li></ol> 9. Memorizzazione di cristalli in Dewars <ol><li> Dopo aver immerso il montato in loop in ni liquidotrogen porlo in uno degli slot di tenuta del disco di memorizzazione nella Dewar schiuma. Tutte le manipolazioni sono fatte con il ciclo, la parte superiore della bacchetta magnetica e il disco immerso in azoto liquido. </li><li> Registrare la posizione e dettagli del raccolto e crio-raffreddato cristallo nel notebook e / o sul computer. </li><li> Quando il disco nel Dewar schiuma è pieno o la raccolta per il giorno è completato il trasferimento del disco in un supporto puck archiviato in una memoria o un trasporto Dewar contenente azoto liquido. I cristalli possono essere spediti in Dewars trasporto verso l&#39;impianto di sincrotrone per la raccolta dei dati di diffrazione. </li></ol> 10. Risultati rappresentativi Gli obiettivi delle attività di raccolta e di crio-raffreddamento dimostrato qui ci sono di trasferire un cristallo dal mesofase ospita in crio-loop, per vetrificare il cristallo in loop e di collocarlo in conservazione in azoto liquido in un Dewar. La situazione ideale è dove la raccolta e la cryo-raffreddamento è fatto in modo tale che la qualità diffrazione del cristallo è conservato nel processo. Come mesofase meno possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Questo per rendere la localizzazione del cristallo e centrandola nel fascio di raggi X molto meno impegnativo, per velocizzare crio-raffreddamento al fine di vetrificazione, e di minimizzare interferire dispersione di fondo della mesofase durante la raccolta dei dati di diffrazione. Alcuni esempi di crio-raffreddati campioni in cui il cristallo può e non può essere visto sono mostrati in Figura 6. In cui il cristallo non può essere visto da occhio di solito è necessario ricorrere a rastering diffrazione per trovare il cristallo e per centrarlo nella trave di raccolta dati 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di una membrana biologica che mostra il doppio strato lipidico e su cui are trova una varietà di proteine. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A pieno carico e sigillato a 96 pozzetti a piastra di vetro cristallizzazione. Ogni pozzetto contiene 50 fase cubica nl e 1 ul di soluzione precipitante. Per chiarezza, la fase cubica è stato macchiato con il Sudan rosso e la soluzione precipitante include blu di metilene. Da riferimento 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cristalli di proteine ​​di membrana che crescono nel mesofase lipidico. A. La fase cubica con un cristallo di batteriorodopsina da H. halobium. B. La fase di spugna che contiene un cristallo del BtuB vitamina B12 recettore / trasportatore, da E. coli. Da riferimento 25. Le fasi cubi e la spugna sono contrastanti appearances come è evidente dal confronto pannelli A e B. La fase cubica in A è molto viscoso e mantiene la sua forma originale. Esso non scorre. Questo è particolarmente evidente ai bordi del bolo mesofase che hanno un aspetto irruvidita. Per contratto, la fase di spugna è molto meno viscoso e non scorre. Così, la fase di spugna riesce a mantenere la sua forma originale ed i suoi bordi sono caratteristicamente liscia. Precipitanti che includono jeffammine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiolo, pentaeritritolo propossilato, butandiolo, esandiolo e può risultare in una transizione dalla fase cubica a spugna 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. L&#39;organigramma riassume i passaggi necessari per la raccolta di produzione, e la crio-raffreddamento in cristalli membrana meso-coltivate proteina (A). Solo i passi immersi nel rosso tratteggiatolinea, e descritto in dettaglio in (B), sono trattati in questo articolo JoVE. Pannello A è da riferimento 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Un vuoto crio-loop montato su un perno che è tenuto in posizione su un magnete. Viste estese del perno (A) e micro-mount (B) di questo importante strumento per la raccolta e crio-raffreddamento vengono visualizzati. Il loop vuota alla fine del montaggio in micro-B è di 30 micron di diametro. Pur non avendo provato altri tipi di loop ampiamente, troviamo che il MiTeGen loop opera presentata bene con entrambe le fasi cubiche e spugna. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Cristalli di Figura 6. Raccolti e crio-raffreddato di proteine ​​di membrana in crio-loop come si vede con un filtro in linea microscopio su una linea di luce di sincrotrone. A, B. Esempi di cristalli raccolte (citocromo ossidasi Caa3 34 (A), diacilglicerolo chinasi, DgkA (B)), dove i cristalli (freccia blu) sono visibili attraverso la crio-mesofase raffreddato su un crio-loop. C. Esempio di dove il cristallo raccolto non è visibile in crio-mesofase raffreddato su un crio-loop. La punta del ciclo viene identificato con una freccia rossa. L&#39;adesione crio-raffreddato mesofase è identificato con una freccia blu.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo il video abbiamo dimostrato come i cristalli coltivati ​​in un mesofase lipidico sono stati raccolti e crio-raffreddata in preparazione per l&#39;uso nella raccolta dei dati di diffrazione e, infine, per la determinazione della struttura. Mesofase hosting può essere la fase viscoso e appiccicoso cubica o la fase spugna più fluido 4. Come le lastre di vetro a sandwich sono aperte e come i cristalli sono raccolti molto dipende dal tipo di mesofase. E &#39;importante quindi sapere quale dei due è quello che fare con anticipo. L&#39;identità del lipide hosting e il precipitante utilizzati sono importanti in questo senso, e l&#39;aspetto fisico del bolo mesofase nella cristallizzazione bene può essere usato per distinguerli (Figura 3). Raccolta da entrambi i tipi mesofase è stato illustrato in questo articolo. Raccolta piccoli cristalli da un mesofase lipidica in superfici di vetro di vetro è un faticoso processo che richiede tempo, abilità, compeience, pazienza e una mano ferma. E &#39;importante mettere da parte una quantità di tempo adeguato per la raccolta e per impostare il laboratorio in modo che tutte le forniture e le attrezzature sono a portata di mano in anticipo. Una seconda persona con raccolta non è essenziale, ma è consigliabile. Quella persona può aiutare con la fornitura di pre-marcate le piastre per l&#39;individuo a fare la raccolta e l&#39;immissione anelli montati crio-raffreddati con cristalli raccolti nel disco di archiviazione. L&#39;assistente può anche svolgere un ruolo importante di supporto nel documentare osservazioni sui cristalli effettuate durante la raccolta che potrebbe rivelarsi cruciale durante la raccolta dei dati di diffrazione. In assenza di un assistente, un comando vocale audio-dispositivo di registrazione può essere vantaggiosamente utilizzato per la documentazione. Dopo il protocollo descritto in questo articolo vi aiuterà a ottenere il visualizzatore installato e funzionante con la raccolta di cristallo. Tuttavia, è importante sottolineare che il processo non è semplice e che practice è necessario prima di lanciarsi nella raccolta preziosi cristalli di proteine ​​di membrana. Si raccomanda pertanto che le targhe di prova con cristalli di proteine ​​che non rappresentano un particolare valore essere sperimentato prima. Ciò fornirà il neofita preziosa esperienza nel taglio del vetro, rimuovendo frammenti di vetro, sollevando il coprioggetto da oltre mesofase, utilizzando la funzione polarizzante sul microscopio per vedere cristalli e di rintracciarli durante la raccolta, movimentazione e infine i diversi tipi di mesofasi e la raccolta da loro. La trama del mesofase, e per estensione la facilità con cui i cristalli possono essere raccolti, cambia con il tempo durante la cristallizzazione. E &#39;importante quindi di praticare la raccolta con cristalli di minor valore, ma con quelli che sono cresciuti nelle stesse condizioni come quelle di maggior valore. È possibile far crescere cristalli di lisozima e taumatina dal meso o in lipidica metodo fase cubica 28 e questi dovrebbero essere consideEred a titolo di guadagnare familiarità con i materiali e il metodo. Si dovrebbe anche prendere in considerazione di lavoro con privo di proteine ​​mesofase primo a conoscere dei suoi capricci. Le procedure hanno dimostrato qui erano tutti fatto in un confortevole 20 ° C o giù di lì. È possibile far crescere cristalli dal metodo in meso a temperature inferiori. Così, monoolein come lipidi hosting in uno stato di fase metastabile può essere utilizzato a 4 ° C 1,2,29,30. Un&#39;alternativa è quella di utilizzare il razionalmente 7,9 MAG per cristallizzazione a bassa temperatura 31. Facciamo crysallogenesis bassa temperatura di routine con gli obiettivi di alcune proteine ​​di membrana. In questo caso, la crescita dei cristalli e la raccolta è fatta in un walk-in frigorifero a 4 ° C. Lavorare in queste condizioni ha le sue sfide non ultimo dei quali è la necessità di un abbigliamento caldo e confortevole. Il passo successivo nel processo generale di determinazione della struttura con cristalli macromolecolaritallography è quello di raccogliere dati di diffrazione su cristalli raccolti e snap-raffreddato, come illustrato in questo articolo. Nel meso-grown cristalli sono solitamente di piccole dimensioni. Tuttavia, utile raccolta dati di diffrazione è stato possibile con cristalli aventi una dimensione massima di 20 micron 9. A questo scopo, micro-beam X-radiazione di sincrotrone viene utilizzata ed è al centro di un articolo separato JoVE in questa serie 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Componenti </td></tr><tr><td> Pinzette curve </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Puntali monouso </td><td> Gilson </td><td> Vario </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Schiuma dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Vetro e metallo Contenitori per rifiuti </td><td> Daniels Sanità </td><td> DD479OL </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Loop raccolta </td><td> MiTeGen </td><td> Vario </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Raccolta microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Vario </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Spinta magneticabottone campione bacchetta di caricamento </td><td> Hampton Ricerca / dimensioni molecolari </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Puck originale (per l&#39;utilizzo con SLA stile robot solo) </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-035 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Dispositivi di pipettaggio </td><td> Gilson </td><td> Vario </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Soluzioni precipitante </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-030 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Puck Cane spedizione ripiani (originali ALS-style) con manico a gancio e asta di chiusura </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-029 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Acqua depurata </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Occhiali di sicurezza </td><td&gt; Varie </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Basi Pin campione - magnetico (senza rame) </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-015 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Spedizione dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Tessuti </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Tungsteno-carburo di vetro taglierina (Punta a tracciare TCT) </td><td> Strumenti Silverline (Yeovil, Regno Unito) </td><td> 633657 </td><td> Strumento </td></tr></tbody></table>

cristalli di raccolta e di cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Un percorso importante per capire come le proteine ​​funzionano ad un livello meccanicistico è quello di avere la struttura della proteina bersaglio disponibile, idealmente a risoluzione atomica. Attualmente, vi è solo un modo per acquisire informazioni come applicato alle proteine ​​integrali di membrana (Figura 1), ed i complessi che formano, e questo metodo è macromolecolare cristallografia a raggi X (MX). Per fare MX cristalli qualità di diffrazione sono necessari che, nel caso delle proteine ​​di membrana, non formano facilmente. Un metodo per cristallizzare proteine ​​di membrana che prevede l&#39;utilizzo di mesofasi lipidiche, in particolare le fasi cubi e spugna 1-5, ha guadagnato una notevole attenzione a causa del ritardo per i successi che ha avuto nella proteina-recettore accoppiato campo G 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Tuttavia, il metodo, d&#39;ora in poi denominato in meso o lipidica metodo fase cubica, viene fornito con il proprio tecnicosfide. Questi derivano, in parte, a causa della natura generalmente viscoso e appiccicoso della mesofase lipidico in cui i cristalli, che sono spesso microcristalli, crescono. Manipolando cristalli diventa difficile a causa e in modo particolare durante la raccolta 22,23. Sorgono problemi anche nella fase che precede la raccolta che richiede che le lastre di vetro sandwich in cui i cristalli crescono (Figura 2) 24,25 sono aperte per esporre il bolo mesofase, ed i cristalli in esso, per la raccolta, crio-raffreddamento e X eventuali diffrazione raccolta dati. Le varianti mesofase cubi e spugna (Figura 3), da cui cristalli devono essere raccolti hanno reologie profondamente diversi 4,26. La fase cubica è viscoso e appiccicoso simile a un dentifricio spessore. Per contro, la fase spugna è più fluido con una spiccata tendenza a flusso. Di conseguenza, i diversi approcci per l&#39;apertura di pozzi cristallizzazione containing cristalli crescono nel cubo e la fase spugna sono chiamati a effetti diversi metodi sono necessari per la raccolta di cristalli dai due tipi mesofase. Protocolli per fare proprio che sono state perfezionate e attuate nella membrana Biologia Strutturale e Funzionale (MS &amp; FB) del Gruppo, e sono descritte in dettaglio in questo articolo JoVE (Figura 4). Alcuni esempi sono riportati di situazioni in cui i cristalli sono raccolti con successo e crio-raffreddato. Forniamo anche esempi di casi in cui sorgono problemi che portano alla perdita irrimediabile di cristalli e descrivere come questi problemi possono essere evitati. In questo articolo il Viewer è dotato di passo-passo le istruzioni per l&#39;apertura di pozzi di cristallizzazione a sandwich di vetro, per la raccolta e per la crio-raffreddamento cristalli di proteine ​​di membrana che crescono in cubi e nelle fasi spugna.

Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine ​​coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l&#39;uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

Un percorso fondamentale per comprendere come le proteine funzionino a livello meccanicistico consiste nell'avere a disposizione la struttura della proteina bersaglio, idealmente a...

Salve e benvenuti al gruppo di Biologia Strutturale e Funzionale delle Membrane. Mi chiamo Martin Caffery. Questo è un altro articolo di una serie pubblicata da JOVE sulla cristallizzazione delle proteine di membrana per la determinazione strutturale mediante il metodo in meso o della fase cubica lipidica.Nel primo articolo, Jo del 1 7 1 2, abbiamo dimostrato come si prepara la fase cubica ricca di proteine e come la fase viscosa e appiccicosa di misa viene dispensata manualmente in piastre di cristallizzazione a sandwich in vetro per i saggi di cristallizzazione. Questo articolo video descriverà il metodo di raccolta e raffreddamento criogenico dei cristalli ottenuti con il metodo in meso. Di seguito sono riportati i materiali e l'attrezzatura necessari per la raccolta e il raffreddamento criogenico dei cristalli cresciuti in meso.Comprendono un taccuino di laboratorio in cui registrare informazioni sui cristalli e sui dettagli del prelievo per futuri riferimenti, occhiali di protezione, contenitori per rifiuti di vetro e metallo, la piastra di cristallizzazione a sandwich di vetro da cui verranno prelevati i cristalli. I pozzetti contenenti cristalli vengono contrassegnati in modo leggibile, uno strumento di taglio in vetro per aprire i pozzetti di cristallizzazione, tessuto e una bottiglia d'acqua, pinzette curve, una soluzione tampone per la schermatura del precipitante, una micropipetta e relative punte, loop criogenici per il prelievo dei cristalli, un'asta magnetica, un supporto per immagazzinare i loop criogenici contenenti cristalli, un contenitore in schiuma riempito con azoto liquido per il raffreddamento criogenico dei cristalli, pinze, un contenitore per il trasporto o lo stoccaggio e un microscopio per il prelievo.In previsione del raccolto, il contenitore schiuma deve essere riempito con azoto liquido e posizionato accanto al microscopio nel punto in cui avverrà il raccolto, con sufficiente anticipo. Il puck di stoccaggio, con l'estremità aperta rivolta verso l'alto, deve essere immerso nell'azoto liquido nel contenitore e lasciato raffreddare; un loop criogenico di dimensioni adeguate al cristallo da raccogliere deve essere fissato su un supporto microscopico applicato alla bacchetta magnetica, con tutti i materiali e le attrezzature pronti. Il nostro prossimo compito consiste nell'identificare le piastre e i pozzetti che contengono cristalli.È possibile procedere in uno dei due modi seguenti. Il metodo più semplice e diretto consiste nell'esaminare manualmente le pozzette utilizzando un microscopio con luce normale e con luce polarizzata. Il secondo metodo sfrutta un'apparecchiatura di imaging in cui le piastre vengono analizzate automaticamente con luce normale e polarizzata.Le immagini digitali vengono registrate dall'imager e valutate su un monitor del computer. I pozzetti contenenti cristalli da raccogliere devono essere etichettati chiaramente. Osservazioni sulle dimensioni, qualità e posizione dei cristalli nell'immagine devono essere annotate sul taccuino o su un computer.Questo sarà utile durante la fase di raccolta. Qui, una piastra contenente cristalli da raccogliere viene rimossa dall'apparecchio di imaging; si aprono così le camere in cui i cristalli crescono mediante il metodo meso-end. Le piastre utilizzate sono piastre in vetro a sandwich del tipo mostrato in figura. Per accedere al mease e ai cristalli in esso contenuti, è necessario aprire la camera.Questo viene eseguito utilizzando uno strumento per il taglio del vetro per tagliare il vetro superiore che sigilla la pozzetta, il quale può quindi essere rimosso. Esistono diversi approcci per farlo. La scelta del metodo dipende dal tipo di mease in cui il cristallo sta crescendo.Questa può essere la fase cubica molto viscosa e appiccicosa, oppure la sua variante più fluida denominata fase spugna. In questo articolo video, mostriamo come aprire i pozzetti e raccogliere i cristalli da entrambi questi materiali ospitanti. In questa sequenza video, dimostriamo due modi per incidere il vetrino coprioggetto di un pozzetto contenente la fase cubica viscosa.La segnatura e il taglio sono mostrati in dettaglio osservandoli al microscopio ottico. Cominciamo esaminando una singola pozzetta di cristallizzazione e identificandone le diverse parti. La prima freccia rossa indica il bolus di mease che contiene i cristalli.Per inciso, i cristalli non sono visibili in questa particolare sequenza. La seconda freccia indica la soluzione precipitante che circonda la goccia. La terza freccia indica il perimetro del pozzetto.La quarta freccia indica lo spaziatore doppio su cui poggia il vetrino coprioggetti, utilizzando il tagliavetro. Il vetrino coprioggetti viene inciso leggermente con due cerchi concentrici posizionati appena al di fuori del perimetro della pozzetta. Successivamente, il tagliavetro viene utilizzato per frantumare il vetro nella zona compresa tra i due cerchi incisi.Per rilasciare il vetrino interno, si generano numerosi frammenti di vetro e polvere, che possono essere rimossi con un panno di carta umido. Il vetrino liberato poggia sul distanziatore lungo il suo bordo circolare. Il vetrino viene rimosso afferrandolo con una pinzetta a punta fine e inclinandolo per staccarlo dal pozzetto.In questo caso, la fase cubica rimane bloccata e in posizione alla base del pozzetto. Parte del precipitante viene rimossa insieme al vetrino da copertura, ma una frazione considerevole di precipitante rimane in posizione attorno al bolo di mease. Ingrandendo l'immagine, si ottiene una visione più chiara della mease cubica, che ora è pronta per essere utilizzata nel raccolto dei cristalli.Nella sequenza successiva, mostriamo un secondo metodo per aprire un pozzetto di cristallizzazione contenente la fase cubica viscosa. In questo caso, vengono realizzate ulteriori linee di incisione dritte e a coppa sul vetrino coprioggetto da un lato del pozzetto, estendendosi attraverso lo stesso pozzetto. Ciò consente un accesso più agevole con le pinzette e la rimozione del vetrino coprioggetto.In questa particolare dimostrazione, il vetrino coprioggetto si incrina e, quando si stacca il vetrino dalla superficie adesiva, il vetrino stesso si sposta e il precipitato si separa dalla fase cubica. Quando il vetrino viene sollevato, parte del precipitato lo accompagna. L'inserito mostra una vista ingrandita del processo.Ora siamo rimasti con un bollo di mease esposto, privo di precipitante circostante che lo protegga dall'essiccamento e da un eventuale cambiamento di fase, il quale potrebbe danneggiare i cristalli. Del precipitante fresco viene aggiunto sopra il bollo utilizzando un micro preparato. Il bollo è ora pronto per essere utilizzato nel raccolto dei cristalli.La fase spugna è leggermente meno tollerante durante la manipolazione a causa della sua capacità di fluire. Se tale flusso provoca il contatto della fase spugna con il bordo del pozzetto, questa verrà aspirata e i cristalli andranno perduti. Un esempio di questo fenomeno è mostrato nel prossimo filmato.Inizia con un ingrandimento sulla fase della spugna, seguito dall'alternanza tra luce normale e luce polarizzata incrociata. I cristalli, individuabili con una certa difficoltà in luce normale, risultano chiaramente visibili tra polarizzatori incrociati come bagliori luminosi su uno sfondo nero. In previsione dell'apertura del pozzetto, il vetrino coprioggetto viene intaccato e tagliato come descritto in precedenza.Nel processo, tuttavia, il vetrino di copertura si incrina nel punto sbagliato. Vengono effettuate alcune manipolazioni al fine di proseguire l'apertura della camera, ma il precipitante si sposta in direzione della crepa e alla fine entra in contatto con lo spaziatore; per di più, inevitabilmente, insieme al precipitante fuoriesce anche parte della fase spugna e ovviamente il suo contenuto. Naturalmente, in questa particolare sequenza, i polarizzatori del microscopio non sono completamente incrociati, e i cristalli risultano visibili come oggetti luminosi mentre al contempo rimangono visibili la camera e il suo contenuto.Nel prossimo filmato, mostriamo come il problema viene risolto rimuovendo innanzitutto l'eccesso di precipitante. Iniziamo ingrandendo la fase della spugna e identifichiamo un cristallo, sia con luce normale che tra polarizzatori incrociati; un segmento delle lamelle viene forato e tagliato, quindi rimosso con attenzione dall'alto. La luce in parte polarizzata viene utilizzata nuovamente per tenere sotto controllo il cristallo, che si illumina chiaramente.Un pezzo di carta da filtro secca viene inserito attraverso l'apertura nella lamellina e all'interno della pozzetta fino a quando tocca appena la soluzione precipitante. La soluzione viene assorbita con attenzione fino a quando è quasi del tutto scomparsa e la fase spugnosa inizia a muoversi nella direzione dello stoppino. Rimuovendo la carta da filtro, il precipitante residuo e la fase spugnosa, con i cristalli ancora al loro posto, si ritirano sotto la lamellina.Una ripetizione al rallentatore di quest'ultima sequenza è mostrata qui per chiarezza. La parte restante del vetrino viene sagomata e tagliata. Come descritto in precedenza, il vetrino viene ora sollevato con le pinzette.L'inserto mostra una vista ingrandita del processo. In questo caso particolare, la fase spugnosa lascia alcuni residui nel pozzetto e parte aderisce al vetrino coprioggetto. Risulta che il cristallo si trova nel bolo sul vetrino coprioggetto con i polarizzatori incrociati.Il cristallo è chiaramente visibile nella fase spugna, ma poiché è presente una quantità molto ridotta di precipitante, inizia a subire una transizione di fase, probabilmente a causa dell'essiccazione. Questo fenomeno si osserva come un anello di frange di birefringenza che migra verso il centro del bolus. Aggiungendo precipitante al bolus, il processo può essere arrestato e invertito, in preparazione al passo successivo, ovvero il recupero dei cristalli.Dopo aver aperto il pozzetto ed esposto la fase Misa ospitante, il passo successivo del processo consiste nel raccogliere i cristalli. Nei filmati seguenti mostriamo esempi di raccolta dalla fase cubica e dalla fase spugna. La fase mea nel pozzetto appena aperto viene esaminata al microscopio per individuare cristalli adatti.Passare ripetutamente dalla luce normale a quella polarizzata può notevolmente facilitare questo processo. Le soluzioni di precipitante devono essere pronte e disponibili per essere aggiunte al bolus al fine di rallentare o arrestare l'essiccazione. Successivamente, si utilizza un cryo loop montato per esplorare la fase appena esposta alla ricerca di cristalli, prelevarli e quindi immergerli immediatamente nel cryo loop in azoto liquido contenuto nel dur subito dopo il raccolto.Nel seguito, mostriamo innanzitutto il recupero dalla fase cubica viscosa e appiccicosa in questa sequenza di raccolta fino a quattro frange Biore, e i cristalli possono essere osservati nel bolo di fase cubica utilizzando luce polarizzata. Il loop criogenico proviene da destra, raccoglie il cristallo con la minima quantità possibile di mezzo aderente, viene immediatamente raffreddato criogenicamente e il loop viene posizionato nella piastrina di stoccaggio sotto azoto liquido. Il processo di raccolta viene ripetuto tre volte in questo filmato.Ogni volta che si utilizza il polarizzatore per verificare la posizione del cristallo. Poiché non è possibile cercare il cristallo nel loop criogenico dopo il raccolto, è consigliabile controllare la fase mesa da cui il cristallo è stato prelevato, per accertarsi che non sia più presente, indicando così un raccolto avvenuto con successo. Nella sequenza successiva viene mostrato il prelievo dalla fase spugna, più fluida, come avviene anche con la fase cubica, raccogliendo la minor quantità possibile di fase spugna in modo che ne rimanga poca attorno al cristallo.Più soluzione è presente nell'ansa criogenica attorno al cristallo, più difficile sarà individuare il cristallo ad occhio nudo. Per la raccolta dei dati di diffrazione, maggiore sarà lo scattering di fondo che contribuirà durante la misurazione della diffrazione. Nella sequenza successiva mostriamo il processo di raffreddamento criogenico, che deve avvenire immediatamente.Il cristallo viene raccolto nel minor tempo possibile tra l'effettivo prelievo e l'immersione in azoto liquido. Dopo aver immerso l'anello montato in azoto liquido, questo viene posizionato in uno degli alloggiamenti del portacampioni situato sulla porta, in questo caso nella posizione numero uno, e rilasciato dalla bacchetta magnetica. A questo punto, posizione e dettagli dei cristalli raccolti e raffreddati criogenicamente devono essere registrati sul taccuino e/o sul computer.Quando il disco nel cassetto della schiuma è pieno, oppure si è terminata la raccolta per la giornata, trasferire il disco in un contenitore portadischi a scaffale all'interno di un contenitore J per stoccaggio o trasporto riempito di azoto liquido. Le prossime due immagini mostrano cristalli raffreddati a criotemperatura in anelli criogenici che sono stati raccolti. Seguendo il protocollo sopra descritto, i cristalli risultano chiaramente visibili all'interno della fase mezza nell'anello.In questo caso, tuttavia, il cristallo non è visibile e dovrebbe essere localizzato mediante diffrazione. Il passaggio successivo nel processo complessivo di determinazione della struttura mediante cristallografia macromolecolare consiste nel raccogliere dati di diffrazione sui cristalli raccolti come illustrato in questo articolo. Questa operazione viene solitamente eseguita utilizzando radiazione X di sincrotrone ed è l'argomento di un articolo jove a parte di questa serie.

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Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

I protocolli di descrivere le fasi essenziali per ottenere cristalli di diffrazione qualità di una proteina di membrana a partire dalla ricostituzione della proteina in una fase lipidica cubi (LCP), trovando condizioni iniziali con LCP-FRAP pre-cristallizzazione analisi, la creazione di processi di cristallizzazione LCP e cristalli di raccolta .

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile che mantengono proteine ​​di membrana (MP) all'interno di un doppio strato lipidico, ma hanno un comportamento unico che facilita la fase di high-throughput screening da robot cristallizzazione. Questa tecnica ha prodotto con successo un certo numero di strutture ad alta risoluzione da entrambe le fonti procariote ed eucariote. Questo video descrive i protocolli per la generazione della miscela lipidica bicelle, incorporando i deputati nella miscela...

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Qui è descritto un approccio robotico per alta produttività cristallizzazione di proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici destinati determinazione della struttura macromolecolare usando cristallografia a raggi X. Tre robot capaci di gestire la viscoso e appiccicoso proteina-carico mesofase solidale al metodo vengono introdotti.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Gli studi strutturali sulle biomacromolecole mediante cristallografia richiedono cristalli di alta qualità. Qui dimostriamo un protocollo che può essere utilizzato da OptiCrys (uno strumento completamente automatizzato sviluppato nel nostro laboratorio) e/o pulsanti di microdialisi per la coltivazione di cristalli di grande qualità basati sulla conoscenza del diagramma di fase di cristallizzazione.

Ottimizzazione della crescita del cristallo per la cristallografia macromolecolare neutronica

Lo scopo di questo articolo è quello di dare allo spettatore una solida comprensione di come trasformare il loro protocollo di diffusione del vapore di piccoli volumi, per la crescita di grandi cristalli proteici singoli, in un metodo di microcristallizzazione batch di grandi volumi per la cristallografia seriale.

Ottimizzazione della crescita dei cristalli di endotiapepsina per esperimenti di cristallografia seriale

I monostrati lipidici sono stati utilizzati come base per la formazione di cristalli proteici bidimensionali (2D) per studi strutturali per decenni. Sono stabili all'interfaccia aria-acqua e possono fungere da materiale di supporto sottile per l'imaging elettronico. Qui presentiamo i passaggi comprovati sulla preparazione di monostrati lipidici per studi biologici.

Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Il protocollo presentato descrive un approccio semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione delle proteine e la crescita dei cristalli utilizzando una piastra di dialisi ad alto rendimento a 96 pozzetti. L'uso di tubi dializzatori per la crescita su larga scala di microcristalli è dimostrato anche per la cristallografia seriale e le applicazioni MicroED.

Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

Presentiamo un protocollo per la cristallizzazione delle proteine utilizzando l'impianto di cristallizzazione nel complesso di ricerca di Harwell e la successiva raccolta di dati cristallografici a raggi X in situ dai cristalli all'interno delle piastre presso la linea di luce della cristallografia macromolecolare versatile in situ (VMXi) di Diamond. Descriviamo i requisiti dei campioni, i protocolli di cristallizzazione e le linee guida per la raccolta dei dati.

Cristallizzazione e raccolta dati a temperatura ambiente in situ utilizzando l'impianto di cristallizzazione di Harwell e Beamline VMXi, sorgente luminosa diamantata

Impara le tecniche di raccolta e crioconservazione di cristalli di proteine di membrana cresciute in fasi lipidiche cubiche e spugnose per la cristallografia a raggi X. Questo metodo essenziale preserva l'integrità strutturale per l'analisi.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare (Video) | JoVE Journal

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

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