Name: Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Scopri la caratterizzazione della differenziazione dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq. Questo metodo in vitro per inibizione da contatto facilita studi sulla biologia cutanea e analisi epigenomiche su larga scala.

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Questa ricerca è stata sostenuta dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Borsa di studio della Radboud University (H.Z.); e sovvenzione del Consiglio delle borse di studio cinesi 201406330059 (J.Q.).

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<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+equivalents%3A+skin+from+reconstructions+as+models+to+study+skin+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases.</a> British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).</li>
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<li>Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((clusterProfiler%3A+an+R+package+for+comparing+biological+themes+among+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters.</a> Omics. 16 (5), 284-287 (2012).</li>
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<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
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<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro descrive un metodo per indurre la differenziazione dei cheratinociti umani e la successiva caratterizzazione usando analisi RNA-seq. Nella letteratura attuale, molti studi sulla differenziazione dei cheratinociti umani usano altri due metodi, con un'alta concentrazione di calcio o con siero come metodi per indurre ladifferenziazione 2,3,23. Una relazione precedente ha confrontato attentamente questi tre diversi<sup...

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell'epidermide1,2,3,4. La stratificazione dell'epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell'aria 3D2,3,5,6,7. Sebbene i modelli 3D siano diventati sempre più importanti per valutare la struttura e la funzione epidermica, i modelli di differenziazione 2D sono ancora ampiamente utilizzati, a causa della loro convenienza e della possibilità di generare un gran numero di cellule per le analisi.
Varie condizioni sono state applicate per indurre la differenziazione dei cheratinociti in 2D, tra cui l'aggiunta di siero, alta concentrazione di calcio, temperatura più bassa e inibizione dei recettori del fattore di crescita epidermico2,3. Ognuno di questi metodi è stato convalidato da una serie di geni marcatori di differenziazione dei cheratinociti e si è dimostrato efficace nel valutare la differenziazione dei cheratinociti, anche in condizioni patologiche. Tuttavia, queste condizioni di induzione mostrano anche differenze nella loro efficienza di differenziazione e cinetica quando vengono esaminati pannelli specificidi geni marcatori 2,3.
Uno di questi metodi prevede l'inibizione del contatto dei cheratinociti e l'esaurimento dei fattori di crescita nel mezzodi coltura 8. È stato dimostrato che i cheratinociti possono differenziarsi spontaneamente quando le cellule raggiungono la piena densità.  Escludere i fattori di crescita nel mezzo di coltura può migliorare ulteriormente la differenziazione. Il metodo che combina l'inibizione del contatto e l'esaurimento dei fattori di crescita ha dimostrato di generare cheratinociti differenziati con modelli di espressione genica simili alla normale epidermide stratificata quando si utilizzano diversi marcatori epidermici3, suggerendo che questo modello è adatto per studiare la normale differenziazione dei cheratinociti. Recentemente, sono state riportate due analisi complete dell'espressione genica della differenziazione dei cheratinocitiutilizzando questo modello 9,10. I ricercatori hanno convalidato questo modello a livello molecolare e hanno dimostrato che può essere utilizzato per studiare la differenziazione dei cheratinociti normale e masabile.
Questo protocollo descrive la procedura per il metodo di differenziazione in vitro e l'analisi molecolare di cellule differenziate utilizzando RNA-seq. Illustra anche la caratterizzazione del trascritoma delle cellule nel giorno di differenziazione 0 (fase di proliferazione), giorno 2, giorno 4 e giorno 7 (differenziazione precoce, media e tardiva, rispettivamente). È dimostrato che i cheratinociti differenziati mostrano schemi di espressione genica che assomigliano in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per esaminare se questo metodo può essere utilizzato per lo studio della patologia cutanea, abbiamo applicato la stessa pipeline sperimentale e di analisi per indagare i cheratinociti che portano mutazioni del fattore di trascrizione p63 che derivano da pazienti con ectrodattilia, displasia ectodermica e sindrome labbro/palatoschisi (CEE)11,12. Questo protocollo si concentra sulla differenziazione in vitro dei cheratinociti e sulla successiva analisi bioinformatica dell'RNA-seq. Altri passaggi della procedura completa come l'estrazione dell'RNA, la preparazione del campione RNA-seq e la costruzione della biblioteca, sono ben documentati e possono essere facilmente seguiti, specialmente quando si utilizzano molti kit commerciali comunemente usati. Pertanto, questi passaggi sono descritti solo brevemente nel protocollo. I dati mostrano che questa pipeline è adatta per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

<table><tbody><tr><td>Bioanalizzatore 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Estratto ipofisario bovino (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 Sistema in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR Macchina</td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>Etanolammina >= 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Chip di DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortison</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Sintesi iScript cDNA</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Library Quant Kit</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>Kit di misurazione a bassa concentrazione</td></tr><tr><td>KAPA RNA HyperPrep Kit con RiboErase</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>Kit RNAseq</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratinocyte Medium Growth BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (modello)</td><td>Nanodrop e Qbit per misure di DNA e RNA</td></tr><tr><td>Codici a barre NEXTflex DNA -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp primer lunghi</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi rna-seq

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

I cheratinociti primari umani sono spesso usati come modelli in vitro per studi sulla differenziazione epidermica e sulle malattie correlate. Sono stati riportati metodi per la differenziazione in vitro dei cheratinociti coltivati in modo sommerso bidimensionale (2D) utilizzando varie condizioni di induzione. Qui descritta è una procedura per il metodo di differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D per inibizione del contatto e successiva caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq. In breve, i cheratinociti vengono coltivati in un mezzo cheratinocita definito integrato con fattori di crescita fino a quando non sono completamente confluenti. La differenziazione è indotta da stretti contatti tra i cheratinociti e ulteriormente stimolata escludendo i fattori di crescita nel mezzo. Usando analisi RNA-seq, è dimostrato che entrambi 1) cheratinociti differenziati mostrano firme molecolari distinte durante la differenziazione e 2) il modello di espressione genica dinamica assomiglia in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per quanto riguarda il confronto con la normale differenziazione dei cheratinociti, i cheratinociti che trasportano mutazioni del fattore di trascrizione p63 mostrano morfologia alterata e firme molecolari, coerenti con i loro difetti di differenziazione. In conclusione, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D e la sua caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione all'analisi bioinformatica dei dati RNA-seq. Poiché l'estrazione dell'RNA e le procedure RNA-seq sono state ben documentate, non è al centro di questo protocollo. La procedura sperimentale di differenziazione dei cheratinociti in vitro e di pipeline di analisi bioinformatica può essere utilizzata per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Differenziazione normale dei cheratinociti e analisi RNA-seq In questo esperimento, le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione e le analisi RNA-seq. La figura 1 riassume la procedura sperimentale di differenziazione e i risultati dell'analisi RNA-seq. Una panoramica delle procedure di differenziazione in vitro dei cheratinociti normali e dei cambiamenti della morfologia cellulare durante la differenziazione è illustra...

Qui è presentata una procedura graduale per la differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto seguita dalla caratterizzazione a livello molecolare mediante analisi RNA-seq.

Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

In questo protocollo descriviamo una procedura contenente due parti. In primo luogo, un metodo di differenziazione dei cheratinociti 2D monostrato in vitro per inibizione del contatto. In secondo luogo, la sua caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq.Il metodo di differenziazione in vitro 2D è semplice e facile da eseguire. Può essere usato per studiare la differenziazione epidermica, specialmente quando è necessario un gran numero di cellule. Ad esempio, nell'analisi epigenomica.La pipeline dettagliata di analisi RNA-seq è chiara e trasparente per i ricercatori con competenze bioinformatiche di base e può essere utilizzata per qualsiasi analisi RNA-seq di massa. Quando si esegue il protocollo di differenziazione per la prima volta, tenere presente che la densità di semina può essere complicata. Prova più densità di semina per scoprire quale funziona meglio con la tua linea cellulare.Inizia preparando il mezzo di crescita dei cheratinociti o kgm e 500 millilitri ciascuno di mezzo di proliferazione e mezzo di differenziazione secondo le direzioni manoscritte. Semina cheratinociti primari ad una densità da 5 a 20.000 cellule per centimetro squadrato e aggiungi abbastanza mezzo di proliferazione per coprire le cellule. Due giorni dopo la semina, rinfrescare le cellule con il mezzo di proliferazione.Controllare regolarmente le cellule al microscopio e aggiornare il mezzo a giorni diversi. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, indurre la differenziazione cambiando il mezzo nel mezzo di differenziazione. Per raccogliere le cellule per ulteriori analisi dell'RNA, lavare le cellule due volte con DPBS e quindi aggiungere il buffer di lisi.Raccogli le cellule nei giorni di differenziazione zero, due, quattro e sette. Dopo l'isolamento dell'RNA, verrà convertito il cDNA a doppio filamento e le librerie RNA-seq saranno preparate per il sequenziamento di nuova generazione. Dopo il sequenziamento, le letture della sequenza verranno scaricate e mappate sul genoma umano.Dopo aver scaricato e installato i pacchetti R, generare la tabella degli account dal file readspergene.out. tab e scrivere un file di dati di esempio contenente tutti i nomi di file, il giorno della differenziazione e altri dati di esempio pertinenti. Fare riferimento, ad esempio, ai file di codifica supplementari.Utilizzare quindi la tabella count e i dati di esempio per generare un oggetto deseq2 contenente sia i dati countable che sample. Per la normalizzazione dell'espressione genica, normalizzare la tabella di conteggio nell'oggetto deseq2 utilizzando la normalizzazione deseq2RLD o VST. Mentre la normalizzazione RLD è preferita, la normalizzazione VST è molto più veloce.Utilizzare la funzione dist in R per tracciare la distanza del campione in base alle intensità di conteggio delle lette normalizzate, quindi eseguire il clustering hclust in base alla distanza del campione. Quindi, tracciare la mappa termica utilizzando la funzione pheatmap. Infine, generate un'analisi dei componenti principali o un grafico PCA delle intensità di conteggio delle lette normalizzate utilizzando la funzione plotPCA di deseq2.PCA funge da strumento nell'analisi esplorativa dei dati e può essere utilizzato per visualizzare la distanza e la connessione tra diversi campioni. Eseguire un'analisi dell'espressione genica altamente variabile con la funzione rowVars che estrae i primi 500 geni altamente variabili ordinando la varianza tra campioni da diversi punti di tempo. Questi geni hanno la più alta deviazione standard della loro intensità normalizzata attraverso i giorni di differenziazione.Eseguire il clustering k-means sui geni altamente variabili per raggrupparli in base a diversi modelli di espressione. Visualizza i geni in una mappa termica con il pacchetto pheatmap. L'intensità tracciata nella mappa termica è l'intensità normalizzata deseq2 con il valore mediano sottratto.Generare un elenco di geni di sfondo espressi che includa tutti i geni con più di 10 conteggi in un singolo campione e fare una lista con i geni di ogni ammasso. Infine, eseguire l'analisi dell'ontologia genica utilizzando GOrilla. Usa l'elenco dei geni di fondo come set di sfondo e l'elenco dei geni altamente variabili negli ammassi come set di destinazione, quindi fai clic sui termini GO arricchiti di ricerca.In alternativa, gli utenti R più avanzati possono utilizzare il cluster di pacchettiProfiler per automatizzare l'analisi dell'arricchimento dei termini GO. Le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione nelle analisi RNA-seq. L'analisi dei componenti principali ha mostrato che i cheratinociti sottoposti a differenziazione avevano profili di espressione genica generali collegati ma distinti.I geni altamente variabili sono stati raggruppati per visualizzare la dinamica e i modelli di espressione genica durante la differenziazione. Ogni gruppo di geni era rappresentato dai geni distintivi della differenziazione dei cheratinociti e l'annotazione gene ontologia mostrava una chiara differenza nelle funzioni geniche. Nel secondo esperimento, la morfologia cellulare e le differenze di espressione genica sono state confrontate tra cheratinociti da controlli sani e linee cellulari derivate da pazienti portatori di mutazioni P63.L'analisi dei componenti principali ha mostrato che le linee cellulari di controllo seguivano chiaramente un modello di differenziazione, ma il modello di espressione genica delle cellule mutanti durante la differenziazione rimane in gran parte simile a quello delle cellule prolifere o indifferenziate. Nell'analisi del clustering, i geni nell'ammasso uno sono stati downregolati nelle cellule di controllo e parzialmente deregolamentati nelle cellule del paziente che trasportano mutazioni R204W e R279H, ma sono rimasti alti nelle cellule che trasportano R304W. Questi geni probabilmente svolgono un ruolo nella proliferazione cellulare, come dimostrato dall'analisi dell'ontologia genica.I geni dell'ammasso due sono stati introdotti per la prima volta e successivamente deregolamentati nelle cellule di controllo. Questi geni sono probabilmente coinvolti nella differenziazione dei cheratinociti poiché la differenziazione epidermica e le funzioni di cheratinizzazione sono state altamente arricchite per questo ammasso. I geni dell'ammasso tre sono stati indotti solo alla fine della differenziazione nelle cellule di controllo, il che indica che possono svolgere un ruolo nello strato più esterno dell'epidermide.Quando si analizzano i dati RNA-seq, è importante sapere in anticipo cosa aspettarsi. Questo ti aiuterà sia nell'interpretare il controllo di qualità e il grafico PCA che nel valutare se i tuoi risultati hanno senso. I nostri metodi possono essere utilizzati per studiare la trascrizione genica sia in biologia epidermica che in altri sistemi biologici.

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