Name: Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Scopri la caratterizzazione della differenziazione dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq. Questo metodo in vitro per inibizione da contatto facilita studi sulla biologia cutanea e analisi epigenomiche su larga scala.

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Questa ricerca è stata sostenuta dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Borsa di studio della Radboud University (H.Z.); e sovvenzione del Consiglio delle borse di studio cinesi 201406330059 (J.Q.).

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<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
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<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
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<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro descrive un metodo per indurre la differenziazione dei cheratinociti umani e la successiva caratterizzazione usando analisi RNA-seq. Nella letteratura attuale, molti studi sulla differenziazione dei cheratinociti umani usano altri due metodi, con un'alta concentrazione di calcio o con siero come metodi per indurre ladifferenziazione 2,3,23. Una relazione precedente ha confrontato attentamente questi tre diversi<sup...

I cheratinociti primari umani derivati dalla pelle umana sono spesso usati come modello cellulare per studiare la biologia dell'epidermide1,2,3,4. La stratificazione dell'epidermide può essere modellata dalla differenziazione dei cheratinociti, sia in modo monostrato sommerso 2D che nel modello organotipico di sollevamento dell'aria 3D2,3,5,6,7. Sebbene i modelli 3D siano diventati sempre più importanti per valutare la struttura e la funzione epidermica, i modelli di differenziazione 2D sono ancora ampiamente utilizzati, a causa della loro convenienza e della possibilità di generare un gran numero di cellule per le analisi.
Varie condizioni sono state applicate per indurre la differenziazione dei cheratinociti in 2D, tra cui l'aggiunta di siero, alta concentrazione di calcio, temperatura più bassa e inibizione dei recettori del fattore di crescita epidermico2,3. Ognuno di questi metodi è stato convalidato da una serie di geni marcatori di differenziazione dei cheratinociti e si è dimostrato efficace nel valutare la differenziazione dei cheratinociti, anche in condizioni patologiche. Tuttavia, queste condizioni di induzione mostrano anche differenze nella loro efficienza di differenziazione e cinetica quando vengono esaminati pannelli specificidi geni marcatori 2,3.
Uno di questi metodi prevede l'inibizione del contatto dei cheratinociti e l'esaurimento dei fattori di crescita nel mezzodi coltura 8. È stato dimostrato che i cheratinociti possono differenziarsi spontaneamente quando le cellule raggiungono la piena densità.  Escludere i fattori di crescita nel mezzo di coltura può migliorare ulteriormente la differenziazione. Il metodo che combina l'inibizione del contatto e l'esaurimento dei fattori di crescita ha dimostrato di generare cheratinociti differenziati con modelli di espressione genica simili alla normale epidermide stratificata quando si utilizzano diversi marcatori epidermici3, suggerendo che questo modello è adatto per studiare la normale differenziazione dei cheratinociti. Recentemente, sono state riportate due analisi complete dell'espressione genica della differenziazione dei cheratinocitiutilizzando questo modello 9,10. I ricercatori hanno convalidato questo modello a livello molecolare e hanno dimostrato che può essere utilizzato per studiare la differenziazione dei cheratinociti normale e masabile.
Questo protocollo descrive la procedura per il metodo di differenziazione in vitro e l'analisi molecolare di cellule differenziate utilizzando RNA-seq. Illustra anche la caratterizzazione del trascritoma delle cellule nel giorno di differenziazione 0 (fase di proliferazione), giorno 2, giorno 4 e giorno 7 (differenziazione precoce, media e tardiva, rispettivamente). È dimostrato che i cheratinociti differenziati mostrano schemi di espressione genica che assomigliano in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per esaminare se questo metodo può essere utilizzato per lo studio della patologia cutanea, abbiamo applicato la stessa pipeline sperimentale e di analisi per indagare i cheratinociti che portano mutazioni del fattore di trascrizione p63 che derivano da pazienti con ectrodattilia, displasia ectodermica e sindrome labbro/palatoschisi (CEE)11,12. Questo protocollo si concentra sulla differenziazione in vitro dei cheratinociti e sulla successiva analisi bioinformatica dell'RNA-seq. Altri passaggi della procedura completa come l'estrazione dell'RNA, la preparazione del campione RNA-seq e la costruzione della biblioteca, sono ben documentati e possono essere facilmente seguiti, specialmente quando si utilizzano molti kit commerciali comunemente usati. Pertanto, questi passaggi sono descritti solo brevemente nel protocollo. I dati mostrano che questa pipeline è adatta per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

<table><tbody><tr><td>Bioanalizzatore 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>Estratto ipofisario bovino (BPE)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>CFX96 Sistema in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR Macchina</td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>Etanolammina >= 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>Chip di DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortison</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td></td><td>Parte del bulletKit</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Kit</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Sintesi iScript cDNA</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Library Quant Kit</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>Kit di misurazione a bassa concentrazione</td></tr><tr><td>KAPA RNA HyperPrep Kit con RiboErase</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>Kit RNAseq</td></tr><tr><td>KGM Gold Keratinocyte Medium Growth BulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX (modello)</td><td>Nanodrop e Qbit per misure di DNA e RNA</td></tr><tr><td>Codici a barre NEXTflex DNA -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp primer lunghi</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico Chip</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi rna-seq

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

I cheratinociti primari umani sono spesso usati come modelli in vitro per studi sulla differenziazione epidermica e sulle malattie correlate. Sono stati riportati metodi per la differenziazione in vitro dei cheratinociti coltivati in modo sommerso bidimensionale (2D) utilizzando varie condizioni di induzione. Qui descritta è una procedura per il metodo di differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D per inibizione del contatto e successiva caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq. In breve, i cheratinociti vengono coltivati in un mezzo cheratinocita definito integrato con fattori di crescita fino a quando non sono completamente confluenti. La differenziazione è indotta da stretti contatti tra i cheratinociti e ulteriormente stimolata escludendo i fattori di crescita nel mezzo. Usando analisi RNA-seq, è dimostrato che entrambi 1) cheratinociti differenziati mostrano firme molecolari distinte durante la differenziazione e 2) il modello di espressione genica dinamica assomiglia in gran parte alle cellule durante la stratificazione epidermica. Per quanto riguarda il confronto con la normale differenziazione dei cheratinociti, i cheratinociti che trasportano mutazioni del fattore di trascrizione p63 mostrano morfologia alterata e firme molecolari, coerenti con i loro difetti di differenziazione. In conclusione, questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi per la differenziazione dei cheratinociti in vitro 2D e la sua caratterizzazione molecolare, con particolare attenzione all'analisi bioinformatica dei dati RNA-seq. Poiché l'estrazione dell'RNA e le procedure RNA-seq sono state ben documentate, non è al centro di questo protocollo. La procedura sperimentale di differenziazione dei cheratinociti in vitro e di pipeline di analisi bioinformatica può essere utilizzata per studiare eventi molecolari durante la differenziazione epidermica in cheratinociti sani e materici.

Differenziazione normale dei cheratinociti e analisi RNA-seq In questo esperimento, le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione e le analisi RNA-seq. La figura 1 riassume la procedura sperimentale di differenziazione e i risultati dell'analisi RNA-seq. Una panoramica delle procedure di differenziazione in vitro dei cheratinociti normali e dei cambiamenti della morfologia cellulare durante la differenziazione è illustra...

Qui è presentata una procedura graduale per la differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani per inibizione del contatto seguita dalla caratterizzazione a livello molecolare mediante analisi RNA-seq.

Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...

In questo protocollo descriviamo una procedura contenente due parti. In primo luogo, un metodo di differenziazione dei cheratinociti 2D monostrato in vitro per inibizione del contatto. In secondo luogo, la sua caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq.Il metodo di differenziazione in vitro 2D è semplice e facile da eseguire. Può essere usato per studiare la differenziazione epidermica, specialmente quando è necessario un gran numero di cellule. Ad esempio, nell'analisi epigenomica.La pipeline dettagliata di analisi RNA-seq è chiara e trasparente per i ricercatori con competenze bioinformatiche di base e può essere utilizzata per qualsiasi analisi RNA-seq di massa. Quando si esegue il protocollo di differenziazione per la prima volta, tenere presente che la densità di semina può essere complicata. Prova più densità di semina per scoprire quale funziona meglio con la tua linea cellulare.Inizia preparando il mezzo di crescita dei cheratinociti o kgm e 500 millilitri ciascuno di mezzo di proliferazione e mezzo di differenziazione secondo le direzioni manoscritte. Semina cheratinociti primari ad una densità da 5 a 20.000 cellule per centimetro squadrato e aggiungi abbastanza me

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La pelle umana agisce come una prima linea di difesa contro l'ambiente esterno. Presentiamo un metodo per isolare i keratinocytes umani primari da pelle adulta. Questi keratinocytes isolato sono utili in numerose configurazioni sperimentali e sono un modello altamente adatto per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Qui descriviamo un protocollo per la coltivazione sistematica di sferoidi epidermici in coltura di sospensione 3D. Questo protocollo ha applicazioni ad ampio raggio per l'uso in una varietà di tipi di tessuto epiteliale e per la modellazione di diverse malattie e condizioni umane.

Creazione di un sistema di coltura sferoide epidermica ad alto rendimento per modellare la plasticità delle cellule staminali dei cheratinociti

Scopri la caratterizzazione della differenziazione dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq. Questo metodo in vitro per inibizione da contatto facilita studi sulla biologia cutanea e analisi epigenomiche su larga scala.

Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

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