Caratterizzazione della differenziazione in vitro dei cheratinociti primari umani mediante analisi RNA-Seq

In questo protocollo descriviamo una procedura contenente due parti. In primo luogo, un metodo di differenziazione dei cheratinociti 2D monostrato in vitro per inibizione del contatto. In secondo luogo, la sua caratterizzazione molecolare da parte dell'RNA-seq.

Il metodo di differenziazione in vitro 2D è semplice e facile da eseguire. Può essere usato per studiare la differenziazione epidermica, specialmente quando è necessario un gran numero di cellule. Ad esempio, nell'analisi epigenomica.

La pipeline dettagliata di analisi RNA-seq è chiara e trasparente per i ricercatori con competenze bioinformatiche di base e può essere utilizzata per qualsiasi analisi RNA-seq di massa. Quando si esegue il protocollo di differenziazione per la prima volta, tenere presente che la densità di semina può essere complicata. Prova più densità di semina per scoprire quale funziona meglio con la tua linea cellulare.

Inizia preparando il mezzo di crescita dei cheratinociti o kgm e 500 millilitri ciascuno di mezzo di proliferazione e mezzo di differenziazione secondo le direzioni manoscritte. Semina cheratinociti primari ad una densità da 5 a 20.000 cellule per centimetro squadrato e aggiungi abbastanza mezzo di proliferazione per coprire le cellule. Due giorni dopo la semina, rinfrescare le cellule con il mezzo di proliferazione.

Controllare regolarmente le cellule al microscopio e aggiornare il mezzo a giorni diversi. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, indurre la differenziazione cambiando il mezzo nel mezzo di differenziazione. Per raccogliere le cellule per ulteriori analisi dell'RNA, lavare le cellule due volte con DPBS e quindi aggiungere il buffer di lisi.

Raccogli le cellule nei giorni di differenziazione zero, due, quattro e sette. Dopo l'isolamento dell'RNA, verrà convertito il cDNA a doppio filamento e le librerie RNA-seq saranno preparate per il sequenziamento di nuova generazione. Dopo il sequenziamento, le letture della sequenza verranno scaricate e mappate sul genoma umano.

Dopo aver scaricato e installato i pacchetti R, generare la tabella degli account dal file readspergene.out. tab e scrivere un file di dati di esempio contenente tutti i nomi di file, il giorno della differenziazione e altri dati di esempio pertinenti. Fare riferimento, ad esempio, ai file di codifica supplementari.

Utilizzare quindi la tabella count e i dati di esempio per generare un oggetto deseq2 contenente sia i dati countable che sample. Per la normalizzazione dell'espressione genica, normalizzare la tabella di conteggio nell'oggetto deseq2 utilizzando la normalizzazione deseq2RLD o VST. Mentre la normalizzazione RLD è preferita, la normalizzazione VST è molto più veloce.

Utilizzare la funzione dist in R per tracciare la distanza del campione in base alle intensità di conteggio delle lette normalizzate, quindi eseguire il clustering hclust in base alla distanza del campione. Quindi, tracciare la mappa termica utilizzando la funzione pheatmap. Infine, generate un'analisi dei componenti principali o un grafico PCA delle intensità di conteggio delle lette normalizzate utilizzando la funzione plotPCA di deseq2.

PCA funge da strumento nell'analisi esplorativa dei dati e può essere utilizzato per visualizzare la distanza e la connessione tra diversi campioni. Eseguire un'analisi dell'espressione genica altamente variabile con la funzione rowVars che estrae i primi 500 geni altamente variabili ordinando la varianza tra campioni da diversi punti di tempo. Questi geni hanno la più alta deviazione standard della loro intensità normalizzata attraverso i giorni di differenziazione.

Eseguire il clustering k-means sui geni altamente variabili per raggrupparli in base a diversi modelli di espressione. Visualizza i geni in una mappa termica con il pacchetto pheatmap. L'intensità tracciata nella mappa termica è l'intensità normalizzata deseq2 con il valore mediano sottratto.

Generare un elenco di geni di sfondo espressi che includa tutti i geni con più di 10 conteggi in un singolo campione e fare una lista con i geni di ogni ammasso. Infine, eseguire l'analisi dell'ontologia genica utilizzando GOrilla. Usa l'elenco dei geni di fondo come set di sfondo e l'elenco dei geni altamente variabili negli ammassi come set di destinazione, quindi fai clic sui termini GO arricchiti di ricerca.

In alternativa, gli utenti R più avanzati possono utilizzare il cluster di pacchettiProfiler per automatizzare l'analisi dell'arricchimento dei termini GO. Le linee cheratinociti derivate da cinque individui sono state utilizzate per la differenziazione nelle analisi RNA-seq. L'analisi dei componenti principali ha mostrato che i cheratinociti sottoposti a differenziazione avevano profili di espressione genica generali collegati ma distinti.

I geni altamente variabili sono stati raggruppati per visualizzare la dinamica e i modelli di espressione genica durante la differenziazione. Ogni gruppo di geni era rappresentato dai geni distintivi della differenziazione dei cheratinociti e l'annotazione gene ontologia mostrava una chiara differenza nelle funzioni geniche. Nel secondo esperimento, la morfologia cellulare e le differenze di espressione genica sono state confrontate tra cheratinociti da controlli sani e linee cellulari derivate da pazienti portatori di mutazioni P63.

L'analisi dei componenti principali ha mostrato che le linee cellulari di controllo seguivano chiaramente un modello di differenziazione, ma il modello di espressione genica delle cellule mutanti durante la differenziazione rimane in gran parte simile a quello delle cellule prolifere o indifferenziate. Nell'analisi del clustering, i geni nell'ammasso uno sono stati downregolati nelle cellule di controllo e parzialmente deregolamentati nelle cellule del paziente che trasportano mutazioni R204W e R279H, ma sono rimasti alti nelle cellule che trasportano R304W. Questi geni probabilmente svolgono un ruolo nella proliferazione cellulare, come dimostrato dall'analisi dell'ontologia genica.

I geni dell'ammasso due sono stati introdotti per la prima volta e successivamente deregolamentati nelle cellule di controllo. Questi geni sono probabilmente coinvolti nella differenziazione dei cheratinociti poiché la differenziazione epidermica e le funzioni di cheratinizzazione sono state altamente arricchite per questo ammasso. I geni dell'ammasso tre sono stati indotti solo alla fine della differenziazione nelle cellule di controllo, il che indica che possono svolgere un ruolo nello strato più esterno dell'epidermide.

Quando si analizzano i dati RNA-seq, è importante sapere in anticipo cosa aspettarsi. Questo ti aiuterà sia nell'interpretare il controllo di qualità e il grafico PCA che nel valutare se i tuoi risultati hanno senso. I nostri metodi possono essere utilizzati per studiare la trascrizione genica sia in biologia epidermica che in altri sistemi biologici.