Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Questo protocollo è significativo perché stiamo imparando che le glia sono eterogenee a livello regionale, morfologicamente, funzionalmente e geneticamente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile studiare tre sottogruppi di glia separati da quattro regioni distinte del sistema nervoso centrale. A dimostrare questa procedura saremo io e Rachel Tinky, una studentessa laureata nel mio laboratorio.

Usa le forbici sottili per tagliare lo strato cutaneo lungo la linea mediana della testa del cucciolo, iniziando caudalmente e muovendosi rostralmente fino a raggiungere il muso. Evitare di tagliare in profondità il cranio per evitare danni ai tessuti. Inclinando la testa verso il basso, tirare lo strato cutaneo su ciascun lato del cranio e utilizzare le forbici a molla per praticare un'incisione lungo la linea mediana del cranio, a partire dal forame magno.

Separa le metà del cranio con una pinza a punta fine esponendo la corteccia, il cervelletto e il tronco encefalico. Una volta esposto, sollevare delicatamente il cervello dal cranio e metterlo in una capsula di Petri di 10 centimetri con 10 millilitri di PBS e soluzione antibiotica. Assicurarsi che il cervello rimanga integro con il cervello posteriore attaccato.

Pizzica il cervelletto con una pinza a punta ricurva fine. Mettere in un tubo conico da 15 millilitri designato con ghiaccio. Separa il mesencefalo dalla corteccia.

Rimuovere le meningi corticali e metterle in un tubo conico designato. Il tessuto deve essere attentamente esaminato per garantire la completa rimozione delle meningi. Se le cellule meningee rimangono nella coltura, possono essere dannose per la crescita delle cellule gliali.

Per sezionare il midollo spinale, posizionarlo con il lato ventrale rivolto verso l'alto e utilizzare le forbici a molla fine per tagliare le vertebre, alternando i lati sinistro e destro fino a quando il tessuto del midollo spinale non è esposto. Rimuovere delicatamente il midollo spinale e le meningi e posizionarli nell'apposito tubo conico su ghiaccio. Aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05% con EDTA 0,53 millimolare a ciascuna provetta con tessuto.

Triturare la miscela con una pipetta da 10 millilitri circa 20 volte. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica vuota da 50 millilitri. Incubare la soluzione a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 15 minuti.

Agitare delicatamente i lisati dopo otto minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere cinque millilitri di MGM e 200 microlitri di DNasi I uno a ciascuna provetta per una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro. Triturare ogni lisato 10 volte con una pipetta da 10 millilitri.

Quindi lasciare riposare la sospensione cellulare per tre minuti a temperatura ambiente per consentire al tessuto non dissociato di depositarsi sul fondo del tubo. Trasferire le sospensioni cellulari in nuove provette coniche da 50 millilitri lasciando dietro di sé il tessuto non dissociato. Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di MGM e triturarlo 20 volte Piastra le sospensioni cellulari su palloni T25 rivestiti e incuba le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Sostituire il supporto dopo 24 ore per rimuovere i detriti cellulari. Per eseguire l'isolamento delle cellule precursori degli oligodendrociti, agitare le cellule per 15 ore, quindi rimuovere il surnatante dal pallone e impiattarlo su una capsula di Petri sterile. Incubare il surnatante a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 30 minuti.

Agitare dopo 15 minuti per rimuovere le microglia rimanenti. Rimuovere il surnatante cellulare non aderente, contare le cellule e piastarle su una superficie rivestita di poli-D-lisina alla concentrazione desiderata. Rimettere le cellule nell'incubatrice per almeno un'ora.

Quindi aspirare delicatamente il 95% del terreno e aggiungere lentamente il terreno OPC caldo, pipettandolo contro la parete del pozzetto per ridurre al minimo l'interruzione degli OPC. Questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che la segnalazione dell'interferone gamma influenza la differenziazione e la maturazione dell'OPC. Senza il recettore dell'interferone gamma, le OPC corticali non si differenziano in oligodendrociti mielinizzanti maturi dice prontamente, il che è evidenziato dall'assenza di colorazione MBP.

È stata analizzata anche l'espressione di GFAP. Le cellule carenti di interferone gamma esprimono fortemente la GFAP, suggerendo che potrebbero adottare un fenotipo astrocitico. L'eterogeneità regionale nelle cellule del SNC è evidenziata dalla diversa morfologia degli astrociti nella corteccia, nel cervelletto, nel tronco encefalico e nel midollo spinale.

Gli astrociti della stessa regione possono anche mostrare eterogeneità morfologica, supportando l'idea che questo sottotipo gliale sia altamente dinamico. Sono state esplorate anche le risposte regionali delle OPC alla stimolazione differenziale delle citochine. La segnalazione delle citochine influenza in modo significativo il comportamento delle cellule staminali e immunitarie e può influenzare il modo in cui le OPC si differenziano in oligodendrociti mielinizzanti maturi.

Dopo l'isolamento delle cellule gliali regionali, le cellule possono essere utilizzate in una varietà di condizioni sperimentali e acide utilizzando diverse tecniche, tra cui l'immunoistochimica, la PCR quantitativa in tempo reale e il Western blotting.