Previsione dell'amputazione mediante cellule progenitrici mononucleari circolanti locali in pazienti trattati con angioplastica con ischemia degli arti critici

Sebbene l'angioplastica migliori il flusso sanguigno nell'ischemia critica degli arti, alcuni pazienti progrediranno comunque verso l'amputazione degli arti. Rispetto alla prognosi basata sui fattori di rischio tradizionali e sulle caratteristiche vascolari intrinseche, il numero di MPC locali può essere più predittivo dell'esito clinico, per quanto riguarda la disfunzione endoteliale e l'amputazione degli arti. Il numero di MPC locali rappresenta un indicatore promettente della prognosi di eventi vascolari, come l'ischemia, la cardiopatia e l'ischemia degli arti inferiori, con potenziali applicazioni nella stratificazione del rischio e nell'applicazione della prevenzione.

A dimostrare le procedure saranno Eduardo Vera-Gómez, Alejandro Hernández-Patricio, Carolina Aranda-Rodríguez, Juan Ariel Gutierrez-Buendia, Atzin Sua Ruiz-Hernández, Mario Antonio Tellez-González e Gabrielle Alexandra Dominguez-Perez. I dottori di ricerca dei laboratori di metabolismo sperimentale e rigenerazione tissutale saranno Gabrielle Hernandez-De Rubin e Oscar Antonio Loman-Zuniga. E questi dal reparto di chirurgia vascolare.

Per determinare l'afta epizootica pre e post angioplastica, utilizzare un trasduttore lineare vascolare per misurare il diametro dell'arteria brachiale del paziente. Successivamente, posizionare, il bracciale di uno sfigmomanometro sopra il sito di misurazione nell'avambraccio, e insufflare il bracciale 50 millimetri di mercurio sopra la pressione arteriosa sistolica per cinque minuti prima di sgonfiarsi. Entro 60 secondi dallo sgonfiaggio, misurare nuovamente il diametro dell'arteria brachiale e utilizzare l'equazione per stimare l'afta epizootica.

Per valutare la gravità clinica dell'ischemia degli arti, secondo la classificazione di Rutherford, posizionare un ago calibro 18 nel vaso sanguigno nel sito inguinale selezionato e posizionare un introduttore sopra l'ago. Far avanzare un filo guida flessibile nell'introduttore e sostituire la guida con un introduttore a sei francesi. Utilizzando la guida fluoroscopica, iniettare il mezzo di contrasto per identificare la traiettoria dell'arteria e i siti vascolari ostruiti.

Introdurre due fili guida di navigazione francesi da 0,014 e due fili guida di supporto francesi da 0,014 nella nave e far avanzare i cavi guida fino al sito bloccato. Quindi, introdurre un catetere da cinque francesi e poi un catetere da tre francesi e raccogliere 10 millilitri di sangue dal sito più vicino all'ostruzione vascolare. Posizionare il campione sul ghiaccio e far avanzare nuovamente un filo guida.

Quando il filo guida è in posizione, introdurre un catetere a palloncino per angioplastica, contenente un palloncino gonfiabile situato all'estremità del catetere, e far avanzare il catetere a palloncino per angioplastica fino al sito della lesione. Gonfiare il palloncino contro la placca di blocco, situata sulla parete vascolare, e verificare il ripristino del flusso sanguigno. 30 minuti dopo aver eseguito l'angioplastica, far avanzare un catetere nel sito più vicino al blocco vascolare e raccogliere 10 millilitri di sangue.

Quindi, rimuovere tutti i fili guida e fornire le cure post-operatorie appropriate. Due settimane dopo l'angioplastica, valutare la gravità clinica dell'ischemia dell'arto, la risoluzione del dolore a riposo, l'ischemia inferiore e la conservazione funzionale del piede, secondo la classificazione di Rutherford, e identificare quei casi che richiedono un'amputazione maggiore a causa di un esito sfavorevole. Entro un'ora dalla raccolta, trasferire sei millilitri di ciascun campione di sangue raccolto in nuove provette da 15 millilitri e diluire i campioni con un rapporto di uno a uno in PBS.

Aggiungere due millilitri di terreno a gradiente di densità a ciascuna delle tre provette e aggiungere tre aliquote di uguale volume di sangue diluito a ciascuna provetta fino a non più di tre quarti di riempimento. Separare le cellule del sangue mediante centrifugazione a gradiente di densità e utilizzare una pipetta per raccogliere le cellule dell'interfaccia degli strati risultanti. Estrarre le cellule di ciascun campione in una singola provetta da 15 millilitri e lavare ogni campione sei volte, con due millilitri di PBS per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere l'MPC contenente pellet in un millilitro di PBS per campione per il conteggio e aggiungere una volta 10 alle sei cellule per provetta al numero appropriato di provette per citometria a flusso da cinque millilitri per campione. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e risospendere ogni campione di cellula in 100 microlitri del cocktail di anticorpi di interesse per 10 secondi, prima di incubare le cellule per 20 minuti a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce. Al termine dell'incubazione, utilizzare anticorpi di controllo isotipo-corrispondenti per impostare i cancelli di scatter diretti e laterali appropriati per l'analisi e utilizzare una provetta contenente un numero elevato di cellule CD45 e CD34 positive per il gate delle NPC.

Per selezionare i fenotipi immunologici doppi positivi, creare nuovi appezzamenti e identificare le cellule KDR, CD133 e CD184 positive, CD34 positive, CD45 positive, quindi eseguire il gate per identificare le principali sottopopolazioni di MPC. Il numero di MPC può quindi essere correlato con il valore basale di afta epizootica e il delta post-angioplastica dell'afta epizootica e la percentuale di pazienti che richiedono un'amputazione maggiore dell'arto inferiore. In questa analisi rappresentativa, 30 giorni dopo l'angioplastica degli arti inferiori, il numero basale di MPC CD45 positivi, CD34 positivi, KDR positivi, correlava negativamente con l'afta epizootica.

Mentre la variazione delle MPC CD45 positive, CD34 positive, CD133 positive, CD184 positive, dopo angioplastica, è significativamente correlata con il miglioramento dell'afta epizootica. Nei pazienti che si sono evoluti all'amputazione degli arti sono stati osservati anche un aumento del numero basale di sottopopolazioni CD45 positive, CD34 positive, KDR positive, nonché una riduzione post-angioplastica delle cellule MPC CD45 positive, CD34 positive, CD133 positive, CD184 positive, durante l'approccio vascolare, assicurarsi di raccogliere il sangue dal sito più vicino all'ostruzione vascolare.