Caricamento criogenico del campione in uno spettrometro a risonanza magnetica nucleare ad angolo magico che preserva la vitalità cellulare

La sensibilità della spettroscopia NMR MAS assistita da DNP ci permette di caratterizzare le proteine all'interno di cellule intatte alla loro concentrazione endogena. Questa applicazione richiede un'attenta gestione dei campioni. Alcune morfologie e cellule sono vitali quando vengono trasferite criogenicamente nello spettrometro utilizzando questo protocollo.

L'introduzione del rotore freddo può causare l'accumulo di umidità e ghiaccio, che può impedire meccanicamente la rotazione del campione. Questa dimostrazione guiderà gli esperimenti per eseguire il trasferimento criogenico con sicurezza. Per iniziare, posiziona un cuscino ricavato da un pezzo di fazzoletto o tovagliolo di carta sotto il coperchio e sul fondo della fiala criogenica.

Posizionare il rotore in zaffiro da 3,2 millimetri nella fiala criogenica imbottita con la carta velina, con l'estremità contrassegnata rivolta verso il fondo della fiala. Congelare lentamente il rotore mettendo la fiala in un contenitore di raffreddamento a velocità controllata e posizionare il contenitore in un congelatore a 80 gradi Celsius per un minimo di tre ore. Trasferire la fiala criogenica contenente il rotore congelato in un piccolo pallone sottovuoto riempito di azoto liquido.

Utilizzare il pallone a vuoto per trasportare il campione allo spettrometro. Riempire un pallone sottovuoto asciutto, isolato termicamente e a bocca larga con 500 millilitri in un litro di azoto liquido. Prelevare la fiala criogenica dal pallone di trasferimento e tenerla appena sopra la superficie dell'azoto liquido per proteggerla dall'atmosfera.

Tenendo la fiala criogenica con la bocca della fiala rivolta leggermente verso il basso, svitare il tappo e lasciare che il rotore scivoli nel bagno di azoto liquido. Pre-raffreddare una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri immergendola nell'azoto liquido. Sotto la superficie del bagno di azoto liquido, utilizzare una pinzetta per trasferire il rotore nella provetta della microcentrifuga con la punta di azionamento rivolta verso il fondo della provetta e i segni rivolti verso l'apertura.

Usa una pinzetta per tenere per il collo il tubo contenente il rotore sotto l'azoto liquido. Con un secondo paio di pinzette, tenere il raccoglitore di campioni NMR sopra la superficie dell'azoto liquido inclinato ad angolo acuto rispetto alla provetta della microcentrifuga. Per trasferire il rotore dal raccoglitore di campioni NMR allo spettrometro NMR, posizionare la criocamera in modalità di espulsione premendo eject.

Inserire l'estremità aperta del raccoglitore di campioni NMR nella provetta della microcentrifuga mentre è ancora sotto la superficie dell'azoto liquido. Sollevare sia la provetta per microcentrifuga che il raccoglitore di campioni NMR per consentire al rotore di cadere nel raccoglitore di campioni. Scuotere il raccoglitore di campioni e il tubo se il rotore si blocca sul bordo.

Lasciare la provetta per microcentrifuga vuota sopra il raccoglitore di campioni NMR per proteggere il rotore dall'aria. Rimuovere l'altro raccoglitore di campioni vuoto dalla sonda e appoggiarlo sul pavimento. Trasferire il raccoglitore di campioni NMR contenente il rotore nell'altra mano.

Quindi rimuovere la provetta da microcentrifuga e inserirla immediatamente nella sonda. Segnalare alla persona che utilizza l'armadio criogenico di premere, arrestare, espellere e inserire. Ruotare il campione alla velocità di rotazione desiderata regolando il cuscinetto e la pressione del flusso di azionamento.

Versare 500 millilitri in un litro di azoto liquido in un pallone sottovuoto a bocca larga e posizionare il bagno sotto lo spettrometro. Immergere la fiala criogenica vuota contenente un pezzo di carta velina nel bagno di azoto liquido. Ridurre la velocità di rotazione a zero kilohertz riducendo il flusso di gas di azionamento e di rilevamento ed espellere il rotore passando alla modalità di espulsione.

Mantenendo attiva la modalità di espulsione, rimuovere il raccoglitore di campioni dalla sonda e far cadere il rotore direttamente nel pallone di schiuma a bocca larga contenente azoto liquido. Utilizzando una pinzetta pre-raffreddata, trasferire il rotore nella fiala criogenica pre-raffreddata sotto la superficie dell'azoto liquido. Pre-raffreddare il tappo criogenico della fiala immergendolo nell'azoto liquido.

Rimuovere la fiala contenente il rotore e l'azoto liquido dal bagno e tappare la provetta con il tappo pre-raffreddato. Immergere nuovamente la fiala criogenica in azoto liquido. Il campione può essere trasferito in un deposito di azoto liquido a lungo termine o disimballato immediatamente per ulteriori analisi.

L'inserimento criogenico di campioni pre-congelati di cellule di mammifero nello spettrometro NMR supporta la vitalità durante l'esperimento NMR. Utilizzando questo protocollo, la permeabilità al blu di tripano delle cellule di mammifero dopo MAS NMR è simile a quella delle cellule non esposte ad alcun cambiamento di temperatura. Se le cellule vengono congelate lentamente, quindi riscaldate a temperatura ambiente prima dell'inserimento, la vitalità cellulare diminuisce a meno del 10%Nel frattempo, l'inserimento criogenico di campioni congelati di cellule di mammifero supporta la vitalità cellulare durante l'esperimento NMR.

Quando si tenta di eseguire il protocollo, richiedere assistenza per premere l'espulsione e far girare il campione verso l'alto in modo che il campione possa essere introdotto nella sonda prima che si riscaldi, assicurandosi che non venga introdotta umidità nella sonda e con la certezza che lo spettrometro funzionerà a freddo per molte settimane. Questo protocollo è applicabile a qualsiasi sistema in cui le fluttuazioni di temperatura potrebbero compromettere l'integrità del campione, come le reazioni di congelamento o la caratterizzazione di intermedi di reazione intrappolati, l'enzimologia e il ripiegamento delle proteine.