Cristallografia neutronica Raccolta ed elaborazione dei dati per la modellazione degli atomi di idrogeno nelle strutture proteiche

La cristallografia a neutroni è una tecnica strutturale per determinare le posizioni degli atomi di idrogeno nelle macromolecole biologiche. Le strutture neutroniche rivelano gli stati di protonazione e gli orientamenti delle molecole d'acqua per chiarire i meccanismi di reazione e le interazioni di legame. A differenza della diffrazione dei raggi X, la diffrazione dei neutroni ha il vantaggio di essere una tecnica non distruttiva.

Le proteine con gruppi fotosensibili o metallosensori possono essere studiate senza subire danni da radiazioni. Per eseguire la cristallografia delle proteine neutroniche, grandi cristalli di proteine fragili sono montati in capillari di quarzo per la raccolta di dati a temperatura ambiente. Il montaggio capillare in cristallo non viene eseguito di routine, il che rende istruttiva la dimostrazione di questa tecnica.

Per la raccolta dei cristalli, aprire la scatola sandwich sigillata contenente i cristalli proteici in una lastra di vetro siliconata di grande volume a nove pozzetti e utilizzare una micropipetta per trasferire da 10 a 20 microlitri dalla soluzione del serbatoio di cristallizzazione su un vetrino. Valutare i cristalli con un microscopio. Utilizzare un microloop di dimensioni adeguate per raccogliere un cristallo e posizionare il cristallo nella goccia della soluzione del serbatoio.

Per il montaggio su cristallo, prendere un capillare di quarzo di due millimetri di diametro e 50 millimetri di lunghezza, aspirare il tampone del serbatoio con una pipetta e riempire un'estremità del capillare con il tampone del serbatoio. Utilizzare un anello di montaggio per posizionare delicatamente il cristallo nel tampone del serbatoio all'interno del capillare di quarzo. Picchiettare il tubo per spostare il tampone del serbatoio e il cristallo lungo il capillare e utilizzare una pipetta lunga e sottile per aspirare la soluzione intorno al cristallo.

Utilizzare uno stoppino di carta sottile per asciugare accuratamente il cristallo e asciugare le pareti dei capillari e aggiungere da 20 a 50 microlitri di soluzione tampone deuterata all'estremità del capillare. Usa una lancia riscaldante per sciogliere una porzione di cera d'api e inserisci delicatamente il capillare nella cera d'api fusa fino a formare una chiusura ermetica. Sostituire il tampone deuterato con 20-50 microlitri di tampone deuterato fresco al secondo, sesto e decimo giorno dopo il montaggio del cristallo e richiudere il capillare con cera d'api fresca fusa dopo ogni scambio di vapore, come dimostrato.

Dopo almeno due settimane di scambio di vapore, utilizzare lo stucco per fissare il capillare di quarzo sul bastoncino del campione del goniometro del diffrattometro di neutroni IMAGINE che è stato fissato allo stadio del campione dello strumento e abbassare il campione e il bastoncino nell'area del fascio di neutroni e del rivelatore. Aprire il programma di acquisizione dati sul computer di controllo Beamline e fare clic sulla scheda di configurazione per impostare la strategia di raccolta dei dati e inserire i parametri dell'esperimento, incluso il nome dello strumento e il nome delle immagini da raccogliere. Fare clic sulla scheda Raccogli e immettere i parametri di raccolta dei dati, inclusi il tempo di esposizione e il numero di fotogrammi da raccogliere.

All'interno dell'interfaccia utente grafica dell'ottica, fare clic su 2,78 per il minimo lambda e 4,5 per il massimo lambda per impostare il quasi intervallo per la raccolta dei dati. Fare clic su Avvia scansione per avviare la raccolta dei dati. Dopo la raccolta dei dati sui neutroni, raccogliere un set di dati di raggi X corrispondente sullo stesso cristallo alla stessa temperatura.

Prima della raccolta dei dati criogenici, rimuovere la soluzione del serbatoio dalla scatola del sandwich e riempire la scatola del sandwich con una soluzione tampone del serbatoio deuterata, lasciare equilibrare per una settimana e ripetere tre volte. Dopo altri tre cicli di scambio della soluzione del serbatoio, raccogliere il cristallo con un microloop e immergerlo in una soluzione crioprotettiva per due ore prima di montare il cristallo in un microloop collegato a una montatura in cristallo criogenico. Immergere il cristallo montato e la montatura criogenica nell'azoto liquido.

Quando il cristallo è congelato, montarlo sullo stadio del campione del diffrattometro a neutroni macromolecolari dotato di un flusso criogenico. Verificare che il cristallo sia montato e centrato per la raccolta dei dati, completare le informazioni sulla proposta e fare clic sull'icona della cartella per caricare la tabella della strategia di raccolta dati, quindi fare clic su Invia per avviare la raccolta dei dati. I neutroni diffratti diventeranno visibili in tempo reale non appena vengono rilevati dai rivelatori a tempo di volo MaNDi.

Per il perfezionamento congiunto dei dati a raggi X e neutroni, aprire prima CCP4 e selezionare converti per modificare estendere il programma MTZ per abbinare i flag di dati liberi R dei dati neutronici a quelli dei dati a raggi X. Importa il file di riflessione dei dati neutronici in formato MTZ. Seleziona importa dati R liberi da un altro file MTZ e importa il file MTZ a raggi X.

Assegna un nome al nuovo file MTZ corrispondente e fai clic su Esegui. Quindi, apri il pacchetto software Phoenix e in perfezionamento, fai clic su set pronto. Caricare il file delle coordinate proteiche, selezionare per aggiungere idrogeni al modello se assenti e selezionare HD nei siti scambiabili, H altrove dal menu a discesa.

Seleziona Aggiungi deuterio alle molecole di solvente e fai clic su Esegui per iniziare. Per l'affinamento della struttura, nella scheda di affinamento, apri la fenice. Programma di raffinazione per impostare il raffinamento utilizzando sia i dati a raggi X che i neutroni.

Nella scheda di configurazione, inserire il file PDB dalla struttura a raggi X risolta. Carica il file MTZ dai dati dei neutroni. Assegna i dati del file MTZ come dati di neutroni in neutrone libero da neutroni R.

Carica il file MTZ dai dati a raggi X e assegnalo come dati a raggi X e raggi X R gratuito. Nelle impostazioni di perfezionamento, verificare che la strategia di perfezionamento standard sia selezionata e aumentare il numero di cicli a cinque. Seleziona tutti i parametri, avanzati e idrogeni.

Cambia il modello di raffinazione dell'idrogeno in individuale e disattiva l'ADP di guida della forza, quindi cerca il nucleare. Seleziona usa le distanze nucleari da X-HD. Fare clic su Esegui per avviare il perfezionamento.

Per la costruzione di modelli a Phoenix, fare clic su Apri in Coot. In Coot, visualizza le mappe di densità elettronica della densità elettronica dei raggi X e della lunghezza di diffusione dei neutroni. Selezionare il display manager ed eliminare la mappa di densità della lunghezza di diffusione dei neutroni 2FOFC.

Seleziona apri MTZ e seleziona apri MTZ e apri il file mtz dei dati neutronici. Per entrambe le opzioni di ampiezza e fase, selezionare no_fill_neutron dati dai menu a discesa per aprire le mappe di densità della lunghezza di diffusione dei neutroni non riempite. Eseguire l'ispezione visiva dei residui per determinare se il modello si adatta ai dati e analizzare i picchi della mappa di densità della differenza dei siti scambiabili idrogeno-deuterio per determinare l'orientamento e l'occupazione corretti.

Riorientare le molecole d'acqua secondo le mappe SLD neutroniche e le interazioni del legame idrogeno. Regolare lo stato di protonazione e l'orientamento dei siti scambiabili idrogeno-deuterio del residuo proteico secondo le mappe SLD neutroniche. Esegui ulteriori cicli di costruzione e perfezionamento del modello interattivo per ottenere una struttura completa.

I cristalli proteici idrogenati cresciuti in tampone a base d'acqua misurano circa 1.000 per 900 micron. I cristalli possono essere montati in capillari di quarzo per lo scambio di vapore con tampone a base di ossido di deuterio per tre settimane prima della raccolta dei dati di diffrazione neutronica. I dati di diffrazione dei neutroni sono stati raccolti per diversi giorni con una risoluzione di 2,30 angstrom e un set di dati di diffrazione dei raggi X è stato raccolto sullo stesso cristallo.

Le mappe di densità della lunghezza di diffusione dei neutroni FO meno FC forniscono informazioni preziose sull'orientamento dei residui come la paragina e i picchi positivi nelle mappe di densità di densità di diffusione dei neutroni FO meno FC sono anche molto informative nel determinare gli stati di protonazione dei residui con gruppi titolabili come l'istidina. Le sovrapposizioni di mappe di densità della lunghezza di scattering di elettroni e neutroni per le molecole d'acqua indicano che, mentre le interazioni dei legami idrogeno possono essere dedotte dai dati a raggi X, i neutroni forniscono informazioni chiare sulle posizioni di questi legami idrogeno. Le mappe di omissione della lunghezza di diffusione dei neutroni possono essere utilizzate per determinare gli orientamenti dei gruppi funzionali della catena laterale idrogeno-deuterio.

Le mappe di densità della lunghezza di scattering dei neutroni, in cui gli atomi di idrogeno non scambiabili sono legati al carbonio, appaiono incomplete rispetto alle loro controparti della mappa di densità elettronica a causa della cancellazione della densità. È quindi preferibile eseguire un raffinamento congiunto di un campione con dati sia a raggi X che a neutroni, in cui i dati a raggi X possono essere utilizzati per determinare la posizione della spina dorsale proteica. La cristallografia delle proteine neutroniche richiede cristalli di grandi dimensioni.

È necessario prestare attenzione durante la manipolazione e il montaggio dei cristalli per evitare di danneggiare i cristalli che possono facilmente rompersi, compromettendo la qualità dei dati. La cristallografia delle proteine neutroniche fornisce informazioni sul meccanismo di reazione delle proteine, rivelando potenzialmente residui cataliticamente rilevanti o molecole d'acqua il cui ruolo può essere ulteriormente sondato mediante cinetica, mutagenesi o spettroscopia.