Determinazione del livello di espressione della proteina in cellule coltivate di immunocitochimica su blocchi di paraffina celle
20 maggio 2018
Attualmente, macchiatura immunofluorescente su celle fisse è il metodo di scelta per la determinazione dei livelli di espressione della proteina quando informazioni morfologiche sono anche necessari. Questo protocollo presentato qui fornisce un metodo alternativo di immunocitochimica su blocchi di paraffina delle cellule.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di analizzare l'espressione di marcatori di proliferazione di interesse mediante analisi immunocitochimiche e istologiche di blocchi cellulari tromboplastina-plasma incorporati in aggregati di tessuto. Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave sulla patologia clinica del blocco cellulare da parte dei tessuti. Il vantaggio principale di questo metodo alternativo per l'analisi immunocitochimica di blocchi cellulari inclusi in paraffina è la semplicità tecnica delle procedure.
Quando una piastra da 100 millimetri di coltura cellulare HeLa raggiunge la confluenza, sostituire il surnatante con 10 millilitri di terreno di coltura cellulare HeLa senza FBS e rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 48 ore, lavare le cellule con due millilitri di PBS seguito dall'incubazione in due millilitri di EDTA allo 0,25% più tripsina per due o tre minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con cinque millilitri di terreno completo e trasferire la soluzione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri.
Raccogliere le cellule mediante centrifugazione seguita da due lavaggi in due millilitri di PBS freddo per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, sostituire il surnatante con un millilitro di etanolo al 95% e miscelare il pellet vortex. Quindi posizionare le celle fissate sul ghiaccio.
Per preparare un blocco di cellule di paraffina, dopo aver raccolto il plasma EDTA dal sangue di un donatore sano, centrifugare i campioni e trasferire da 200 a 400 microlitri di aliquote di plasma surnatante in singole provette per microfughe. Quindi aggiungere circa 200 microlitri di plasma, circa 200 microlitri di tromboplastina e circa 200 microlitri di cloruro di calcio molare 025 alle cellule HeLa fisse. Lasciare che le miscele formino coaguli cellulari a temperatura ambiente per dieci minuti, quindi lavare i coaguli due volte con un millilitro di PBS decantando completamente i coaguli su singoli pezzi di carta da filtro inumidita con formalina dopo il secondo lavaggio.
Avvolgere i coaguli nella carta da filtro e utilizzare un set di spilli per posizionare i panni in singole cassette di fazzoletti al centro di altri quattro pezzi di carta inumidita in formalina. Quindi posizionare le cassette di tessuto in barattoli di vetro contenenti 50 millilitri di formalina tamponata per la fissazione notturna della formalina a quattro gradi Celsius. La mattina successiva caricare le cassette in un processatore di tessuti per la rimozione dell'acqua durante la notte e il condizionamento cellulare fisso.
Almeno un'ora prima della fine della procedura di lavorazione, accendere una stazione di inclusione riscaldata per sciogliere la paraffina. Quando la stazione di inclusione e il coagulo sono pronti, confermare la presenza di paraffina fusa nello stampo metallico e trasferire un coagulo cellulare formato nella paraffina. Posiziona una nuova cassetta di fazzoletti senza coperchio nello stampo di metallo e copri la cassetta con altra paraffina fusa.
Lasciare solidificare la paraffina in una piastra fredda per 30-60 secondi. Quindi separare la cassetta di fazzoletti dallo stampo di metallo. Per preparare le sezioni per l'analisi immunocitochimica, individuare il coagulo cellulare in un blocco di cellule di paraffina e utilizzare un microtomo per tagliare il blocco in fette spesse tre o quattro micrometri.
Posizionare le sezioni di paraffina su vetrini rivestiti di soluzione salina e posizionare i vetrini in un forno a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quando le sezioni hanno aderito ai vetrini, deparaffinizzare i vetrini in 15 millilitri di xilene per quattro minuti, seguiti dalla disidratazione delle sezioni con incubazioni sequenziali di etanolo discendenti di due minuti. Dopo l'incubazione con etanolo all'80%, sciacquare le sezioni in acqua corrente per 10 minuti e far bollire i vetrini in un barattolo contenente 40 millilitri di tampone di recupero tris-EDTA per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini recuperati dall'antigene sotto l'acqua corrente seguita da un'incubazione di 10 minuti in etanolo al 95% a quattro gradi Celsius. Dopo l'asciugatura all'aria, utilizzare una penna idrofobica per circondare l'area di colorazione delle cellule su ciascun vetrino. Lavare i vetrini in TBS-T seguito da incubazione in blocco di perossido di idrogeno per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere qualsiasi attività residua della perossidasi.
Lavare i vetrini tre volte in TBS-T per due minuti a ogni lavaggio, quindi etichettare le sezioni con 100 microlitri di miscela di anticorpi primari dal kit di colorazione immunocitochimica di interesse per un'ora, seguita da cinque lavaggi TBS-T di due minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i vetrini nell'enhancer anticorpale primario del kit per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Al termine dell'incubazione, lavare le sezioni quattro volte in TBS-T aggiungendo circa 200 microlitri di anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano dopo l'ultimo lavaggio per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.
Lavare le sezioni potenziate cinque volte in TBS-T fresco, quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di diaminobenzidina per sezione per tre minuti. Lavare i vetrini due volte in TBS-T ed etichettare le sezioni con 100 microlitri di soluzione di ematossilina per un minuto. Quindi lavare i vetrini ancora una volta in TBS-T e incubare i vetrini in etanolo al 95% per due minuti, seguiti da un'immersione in etanolo fresco al 95% e due immersioni in etanolo al 100%.
Incubare le sezioni disidratate di etanolo in 40 millilitri di xilene in un barattolo di vetro per cinque minuti e lasciare asciugare i vetrini all'aria. Quindi montare un vetrino coprioggetto su ogni vetrino e osservare i campioni al microscopio ottico. La colorazione con ematossilina ed eosina del tessuto incluso nella paraffina, come appena dimostrato, si rivela principalmente nei nuclei intatti e nel citoplasma, suggerendo un'eccellente conservazione morfologica dei campioni cellulari con questo metodo.
I blocchi cellulari mal preparati, tuttavia, mostrano una scarsa morfologia e un'etichettatura irregolare anche se i campioni sono colorati correttamente. La proteina due associata al citoscheletro è tipicamente osservata all'interno della cromatina condensata, del fuso mitotico e del citoplasma. Solo le cellule con colorazione della proteina 2 associata al citoscheletro nella cromatina condensata sono cellule mitotiche, mentre poche cellule positive della proteina due associate al citoscheletro si trovano all'interno della popolazione di colture cellulari HeLa affamate di siero.
La maggior parte delle cellule HeLa altamente mitotiche sono anche Ki-67 positive e la colorazione Ki-67 è visibile nei nuclei cellulari. Solo circa la metà delle cellule HeLa affamate di siero esprime questo marcatore di proliferazione. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei ore se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di diluire le cellule a una densità appropriata per produrre un buon coagulo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi citofluorimetrica delle cellule fissate, per rispondere a ulteriori domande sulla fase del ciclo cellulare durante la sincronizzazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a un futuro nel campo della patologia epatica per esplorare il profilo di espressione nella linea cellulare preservando le informazioni morfologiche nelle cellule in coltura.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'immunocitochimica e preparare blocchi di tromboplastina plasmatica dalle cellule in coltura. Non dimenticare che lavorare con reagenti pericolosi come lo xilene può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare guanti e un camice da laboratorio dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'analisi immunocitochimica di marcatori di proliferazione mediante blocchi cellulari inclusi in paraffina. Il protocollo sottolinea la semplicità tecnica pur fornendo informazioni morfologiche affidabili.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunocitochimica
- Analisi istologica
- Tecniche di coltura cellulare
Sfondo
- La colorazione immunofluorescente è comunemente utilizzata per l'analisi dell'espressione proteica.
- Metodi alternativi possono semplificare il processo mantenendo l'accuratezza.
- La comprensione della proliferazione cellulare è fondamentale in patologia clinica.
- I blocchi cellulari inclusi in paraffina permettono studi morfologici dettagliati.
Scopo dello studio
- Analizzare i marcatori di proliferazione nelle colture cellulari.
- Fornire un protocollo semplificato per l'analisi immunocitochimica.
- Valutare la conservazione morfologica dei campioni cellulari.
Metodi Utilizzati
- Coltura cellulare e trattamento con tromboplastina-plasma.
- Preparazione di blocchi cellulari in paraffina a partire da cellule fissate.
- Taglio di sezioni dai blocchi in paraffina per l'analisi immunocitochimica.
- Colorazione e microscopia per valutare la morfologia cellulare e l'espressione dei marcatori.
Risultati principali
- Dimostrata efficace conservazione della morfologia cellulare.
- Identificate cellule mitotiche mediante colorazione specifica delle proteine.
- Mostrata correlazione tra i modelli di colorazione e la proliferazione cellulare.
- Evidenziati i vantaggi dell'uso di campioni inclusi in paraffina.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un'alternativa affidabile per lo studio della proliferazione cellulare.
- La semplicità tecnica aumenta l'accessibilità per i ricercatori.
- Mantiene dati morfologici di alta qualità insieme all'analisi dell'espressione proteica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'immunocitochimica su blocchi cellulari in paraffina rappresenta un'alternativa tecnicamente semplice alla colorazione immunofluorescente per l'analisi dell'espressione proteica, preservando al contempo le informazioni morfologiche. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e lo sviluppo di saggi, consentendo una rilevazione affidabile di marcatori di proliferazione in cellule coltivate in condizioni controllate. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, mantenendo il contesto architetturale insieme ai dati quantitativi sull'espressione proteica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rilevazione di marcatori della proliferazione come CKAP2 e Ki-67 in contesti cellulari definiti.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico correlando i profili di espressione proteica con l'attività mitotica e le risposte alla privazione di siero.
- Valore scientifico: Facilita la chiarificazione dei percorsi metabolici preservando la localizzazione subcellulare delle proteine associate al citoscheletro nella cromatina condensata e nel citoplasma.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante un'inclusione e sezionamento paraffinico costante di grumi cellulari.
- Valore operativo: Promuove la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso la formazione standardizzata di grumi plasma-tromboplastina e il relativo trattamento istologico.
- Valore scientifico: Evidenzia la prontezza per lo screening generando output quantitativi da colorazioni immunocitochimiche basate su DAB, compatibili con l'analisi al microscopio ottico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discute la rilevanza per le malattie attraverso la correlazione tra i modelli di colorazione in vitro e quelli osservati nei tessuti tumorali inclusi in paraffina.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica, mantenendo una fedeltà morfologica paragonabile a quella della colorazione immunoistochimica nei tessuti.
- Valore scientifico: Si concentra sul valore predittivo di riduzione del rischio, consentendo la valutazione di condizioni di coltura modificate (ad esempio, pre-incubazione senza siero) pur preservando le informazioni architetturali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si colloca all'interno del continuum della scoperta, dall'Early Discovery all'Identificazione del Lead, sostenendo la verifica delle ipotesi e lo sviluppo di saggi allineati ai biomarcatori solo quando i marcatori di proliferazione sono rilevanti per il bersaglio terapeutico.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi mediante il rilevamento di cellule mitotiche attraverso la colorazione di CKAP2 e Ki-67 nel cromatina condensato.
- Screening: Descrive la preparazione del saggio mediante sezionamento standardizzato (3-4 μm) e recupero dell'antigene utilizzando tampone tris-EDTA prima della colorazione immunocitochimica.
- Analisi: Mette in evidenza misurazioni come l'intensità del segnale cromogeno DAB e la controcolorazione con ematossilina, che consentono il confronto dell'espressione proteica tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica dimostrando la somiglianza dei profili di colorazione con l'analisi immunohistochimica in tessuti tumorali in paraffina.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per diversi marcatori di proliferazione e modelli di linee cellulari oltre alle cellule HeLa.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie al rilevamento accurato di marcatori di proliferazione con localizzazione subcellulare preservata.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante la formazione di coaguli di tromboplastina-plasma ed elaborazione automatizzata dei tessuti.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nell'analisi del ciclo cellulare mediante convalida con doppio marcatore.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio, consentendo la valutazione degli effetti del composto sull'indice mitotico in condizioni di coltura definite.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in tecniche istologiche, validazione degli anticorpi e microscopia ottica.
- Esigenze relative a strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi microtomo, processore per tessuti, stazione riscaldata per inclusione e capacità di manipolazione del xilene.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per la formazione del coagulo, l'adesione dei sezioni e la coerenza dei protocolli di colorazione tra laboratori.
- Considerazioni sull'adattamento in diversi sistemi modello, in particolare per l'ottimizzazione della densità cellulare e della formazione del coagulo in linee cellulari diverse dalle HeLa.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura: blocchi cellulari mal preparati mostrano una morfologia scadente e un'etichettatura irregolare anche con una corretta colorazione.
