Determinazione dell'efficienza di accoppiamento degli aploidi in Saccharomyces cerevisiae

Questo protocollo è un metodo semplice per quantificare l'efficienza con cui diversi ceppi e specie di lievito si accoppiano tra loro. Il metodo proposto è semplice, robusto ed efficiente. Il metodo può essere esteso a qualsiasi ceppo di lievito.

Il metodo descritto in questo studio può essere utilizzato per capire come avviene la speciazione nel lievito. Inoltre, i ceppi che descriviamo possono essere particolarmente utili per progettare esperimenti con il flusso genico. Il punto di forza del metodo è che è davvero semplice.

Alcuni piccoli aggiustamenti come il tempo di incubazione potrebbero essere necessari a seconda del particolare ceppo utilizzato. Inizia a far rivivere gli aploidi A e Alpha dalle scorte congelate strisciando l'inoculo di lievito su un destrosio peptone estratto di lievito o piastra di agar YPD. Lasciarli crescere per 48 ore a 30 gradi Celsius per ottenere singole colonie.

Dopo l'incubazione, inoculare singole colonie dalla piastra YPD e cinque millilitri di terreno YPD e incubare a 30 gradi Celsius per 48 ore con agitazione a 250 giri / min. Le cellule sono nella fase stazionaria di crescita dopo questo periodo di incubazione. Su una nuova piastra YPD, disegna la griglia dell'efficienza di accoppiamento come un rettangolo di 1 per 1,5 centimetri diviso in tre scatole, ciascuna con una dimensione di 1 per 0,5 centimetri.

Inoculare cinque microlitri della coltura YPD dei due tipi di accoppiamento sui rettangoli più a sinistra e più a destra. Questo volume corrisponde a circa 5 volte 10 alla quinta cellula aploide in ogni sezione. Incubare le piastre per 24 ore a 30 gradi Celsius.

Per mescolare un numero uguale di cellule di lievito, rimuovere circa 1/3 della crescita del lievito sviluppata nelle scatole esterne utilizzando uno stuzzicadenti sterile e risospendere le cellule rimosse in 20 microlitri di acqua in una fiala sterile da 1,5 millilitri. Segui questo per ogni aploide. Quindi, diluire cinque microlitri di questa sospensione in due millilitri di acqua e misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro a 600 nanometri.

In base al valore della densità ottica e al numero di celle per millilitro a una densità ottica, aggiungere i volumi richiesti di entrambi gli aploidi in una fiala fresca e sterile da 1,5 millilitri. Mescolare bene con una pipetta. Il volume finale di questa sospensione è generalmente di circa sei-otto microlitri.

Quindi, inoculare questa sospensione nella griglia centrale. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius per sette ore, permettendo agli aploidi di accoppiarsi. Dopo sette ore di incubazione, raschiare le cellule dal rettangolo centrale usando uno stuzzicadenti o una punta di pipetta e diluire in due millilitri di acqua sterile.

Effettuare ulteriori diluizioni e quindi distribuire la sospensione cellulare su agar YPD per ottenere singole colonie. Dopo la placcatura, incubare le piastre YPD a 30 gradi Celsius per 36-48 ore per sviluppare singole colonie. Assicurarsi che alcune centinaia di singole colonie siano ottenute da ogni esperimento di accoppiamento per lo screening per garantire la significatività statistica dei dati.

Per identificare le colonie diploidi sulla piastra, trasferire le singole colonie striandole singolarmente su una piastra a doppio drop-out, priva degli amminoacidi per cui i ceppi sono auxotrofi. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per 48 ore e calcolare l'efficienza di accoppiamento, nu. La robustezza del protocollo ha permesso una facile differenziazione dell'efficienza di accoppiamento tra i due ceppi, SK1AM e ScAM.

Mentre i ceppi SK1 si accoppiavano con un'efficienza molto elevata, i ceppi ScAM si accoppiavano con un'efficienza relativamente inferiore. L'efficienza di accoppiamento dei ceppi ScAM è diminuita significativamente quando l'ambiente non conteneva glucosio come fonte primaria di carbonio, indicando che l'accoppiamento è un processo energeticamente costoso e la crescita su fonti di carbonio alternative riduce qualitativamente l'efficienza dell'accoppiamento. Quando è stato permesso di accoppiarsi per periodi di tempo diversi, non è stato osservato alcun accoppiamento per le prime quattro o cinque ore.

I primi diploidi sono apparsi solo dopo quattro o cinque ore, indicando che questo è il tempo necessario per completare il processo di accoppiamento nell'ambiente dato. Successivamente, l'efficienza di accoppiamento è aumentata rapidamente. Oltre le sette ore, i calcoli dell'efficienza di accoppiamento sono stati influenzati dal fatto che la crescita mitotica è iniziata sulla piastra.

Assicurarsi che lo stesso numero di entrambi gli aploidi sia misto. Deviazioni da questo porterebbero a variazioni nelle ripetizioni indipendenti del protocollo. In che modo il flusso genico influisce sull'adattamento e sulla speciazione è una questione aperta.

Poiché i marcatori auxotrofi sono inseriti accanto al locus MAT nei nostri ceppi, questo aiuta a risolvere questa importante domanda.