L'uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Lo scopo della seguente procedura è quello di dimostrare come sostenere i lisosomi di due tipi di campioni, embrioni di topo e cellule staminali differenziate con colorante lyo tracker per rilevare modelli di morte cellulare. Per preparare i campioni di embrioni, gli embrioni vengono prima isolati chirurgicamente e posti in un piatto per preparare cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali vengono utilizzate per creare corpi embrionali.

Questi corpi embrionali vengono coltivati in sospensione e poi cresciuti come monostrato su un vetrino da camera. Gli embrioni venduti in monostrato possono essere incubati in ot tracker rosso e vengono quindi risciacquati e fissati i campioni possono quindi essere fotografati per esaminare e quantificare i risultati della colorazione ottenuti che mostrano Liso Tracker. La colorazione è una procedura semplice che può essere utilizzata per saggiare la morte cellulare negli embrioni e nelle cellule in coltura.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'analisi dei tunnel è che, poiché il colorante tracker OT è una piccola molecola, il tessuto spesso può essere analizzato rapidamente e facilmente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui modelli di morte cellulare programmata negli embrioni di topo e nelle colture differenziate, può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto come gli embrioni di pollo e le cellule staminali adulte differenzianti. Accoppia giovani topi femmine con un maschio maschio e la mattina seguente, controlla la presenza di un tappo vaginale, che indica che l'accoppiamento è avvenuto.

Il mezzogiorno del giorno in cui appare il tappo vaginale è effettivamente di 0,5 giorni. Dopo il cotus nel giorno embrionale di interesse, sopprimere la femmina secondo i protocolli approvati e rimuovere l'utero in una capsula di Petri di 10 centimetri con il BSS di Hank e sciacquare via il sangue. Separare gli embrioni e rimuoverli dall'utero.

Rimuovere le membrane embrionali in eccesso e fare almeno un risciacquo con la BSS di Hank per rimuovere i tessuti estranei e il sangue. Tenere gli embrioni sezionati sul ghiaccio durante la pulizia. Gli altri.

Preparare cinque millilitri di soluzione per la colorazione degli embrioni Liso tracker. Questo è un volume sufficiente per una o due raccolte di embrioni. Mescolare delicatamente la soluzione per disperdere il colorante, quindi trasferire uniformemente gli embrioni nella soluzione e incubarli a 37 gradi Celsius per 45 minuti.

Dopo l'incubazione, sciacquare delicatamente gli embrioni nel BSS di Hank quattro volte per cinque minuti ogni lavaggio. È importante fare i risciacqui delicatamente per non danneggiare il tessuto. Togliete il liquido, facendo lentamente molta attenzione a dove si trovano gli embrioni delicati, e lasciando sempre una parte del liquido che li ricopre.

Quindi fissare gli embrioni in 4% di para formaldeide durante la notte del giorno successivo. Sciacquare gli embrioni una volta nella BSS di Hank per 10 minuti per rimuovere il fissativo. Ora disidratare i tessuti attraverso una serie di metanolo per eliminare la colorazione di fondo.

Questo passaggio migliora il rapporto segnale/rumore durante l'imaging prima della conservazione. Se necessario, raccogliere un campione di tessuto da ogni embrione per l'analisi genetica. Successivamente, reidratare il campione di tessuto prima della genotipizzazione.

Separare gli embrioni in singole provette con etichette che corrispondano al campione di tessuto. Ora è possibile conservare gli embrioni isolati a tempo indeterminato in metanolo a meno 20 gradi Celsius. Protetto dalla luce.

Inizia preparando i corpi degli embrioni con il metodo della goccia sospesa. Con una densità iniziale di 500 cellule per goccia da 20 microlitri dopo tre giorni, trasferire i corpi embrionali in colture in sospensione su piastre di Petri non aderenti da 10 centimetri. Coltivali per cinque giorni, cambiando i media ogni due giorni dopo cinque giorni.

Trasferire i corpi embrionali su vetrini gelatinizzati a otto camere, posizionando uno o due corpi embrionali in ciascuna camera. Coltivare i corpi degli embrioni per altri 10 giorni. Cambiando il terreno a giorni alterni dopo 10 giorni, aspirare delicatamente il terreno esistente e aggiungere 300 microlitri di soluzione colorante per cellule tracker Lyo in ciascuna camera.

Fare attenzione a pipettare manualmente il terreno, posizionando il puntale della pipetta nell'angolo della camera. In questo modo, non rimuoverai accidentalmente il, attaccando ancora ogni corpo dalla superficie del vetro. Quando si riaggiunge il terreno, posizionare la punta della pipetta nell'angolo della camera e riaggiungere il terreno molto lentamente.

Incubare le camere a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi sciacquarli due volte con DPBS per cinque minuti per risciacquo. Ora fissare le cellule in paraldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il fissativo con DPBS in due risciacqui di cinque minuti. Per montare gli embrioni, posizionarli in un vetrino a depressione profonda o in un piccolo scudo infettatore con piastra di Petri. Preparare i campioni cellulari per la microscopia aspirando il DPBS.

Rimuovere la camera dal vetrino e lasciarla asciugare all'aria per circa cinque minuti. Copri con un foglio per proteggere il fluoro. Quindi aggiungere un mezzo di montaggio acquoso come lo scudo vettoriale con dappy e posizionare un vetrino coprioggetti sulla parte superiore.

Ora il vetrino è stato montato ed è pronto per l'imaging. Visualizzate i campioni con un microscopio da dissezione o composto dotato di un filtro ad asta, a domino o rosso Texas. La colorazione è in genere abbastanza brillante, quindi di solito non sono necessarie lunghe esposizioni in modalità manuale.

Scatta foto digitali di tutti i campioni nelle stesse condizioni di esposizione. Per quantificare le immagini, aprile in Adobe Photoshop o in un programma di imaging simile. Per determinare la quantità di colorazione del lyo tracker, selezionare il canale rosso.

Notare il numero di pixel per l'intera immagine come rivelato dalla funzione istogramma. Soglia successiva, l'immagine in modo tale che la colorazione rossa sia ora rappresentata da pixel bianchi. In questo modo l'immagine viene convertita in bianco e nero.

Scegli un livello di soglia e usa questo livello per tutte le immagini nel set. Seleziona i pixel bianchi utilizzando lo strumento gamma di colori e utilizza la funzione istogramma per ottenere il conteggio totale dei pixel bianchi. Usa il canale blu per contare il numero di nuclei nel campo.

Può essere utile tenere traccia del conteggio annotando l'immagine, registrare i valori e utilizzarli per calcolare il livello medio di colorazione per cella. Ripetere l'analisi con la stessa impostazione di soglia per tutte le immagini rimanenti. Per campionare lyo tracker è stato utilizzato per colorare embrioni mutanti sonic hedgehog.

Poiché il tracker ly O è una piccola molecola altamente diffusibile, le aree profonde all'interno del meen di un intero embrione, come colorato a 10,5 giorni dopo la morte cellulare programmata di cotus o PCG, è stato notevolmente aumentato negli embrioni mutanti nulli di riccio sonico, in particolare nell'arto e così potrebbero le regioni. Le gemme degli arti sono state riprodotte in supporti a foro a un ingrandimento maggiore per valutare il modello generale. Le parti sezionate sono state anche sezionate con un microtono vibrante.

La punta della freccia indica un aumento della colorazione nella punta distale nulla del riccio sonico nelle sezioni ottenute con un tunnel di criostato La colorazione è stata utilizzata in combinazione con OT Tracker in queste fette, sebbene non vi sia una stretta correlazione uno-a-uno tra il lyo tracker e la colorazione del tunnel, le regioni generali della PCD si sovrappongono considerevolmente a un ingrandimento più elevato. È possibile vedere la puntura che si è colorata positivamente con il test del tunnel, ma non la puntura del die otra che si colora solo con il die lyra e la puntura che ha una colorazione sovrapposta. Dopo 10 giorni di coltura del corpo embrionale, le cellule si sono differenziate in una varietà di tipi di cellule, tra cui neuroni, cellule muscolari e cardiomiociti.

Nella normale coltura di cellule ES differenziate, ci sono alcune cellule che sono state sottoposte a PCD come rilevato con saggi di lyo tracker e tunnel. Successivamente, le cellule sono state trattate con perossido di idrogeno per indurre la morte cellulare da stress ossidativo. Una bassa dose di perossido di idrogeno ha aumentato sia il tracciatore di liofilia che la colorazione del tunnel rispetto a nessun trattamento.

Simile ai risultati nell'embrione, entrambe le colorazioni etichettavano cellule comuni e uniche. Un'alta dose di perossido di idrogeno ha provocato un restringimento cellulare e una più diffusa positività OT tracker e tunnel. Per confronto, la fame sierica è stata utilizzata per indurre l'autofagia dopo un'ora di fame sierica.

La colorazione del tracker OT è aumentata. Tuttavia, la positività dei tunnel è rimasta a livelli normali. Pertanto, sebbene la reer sia facile e utile, è importante seguire con ulteriori test per determinare se la colorazione rappresenta l'apoptosi o l'autofagia dopo che i campioni sono stati quantificati.

Utilizzando il semplice metodo Photoshop dimostrato in precedenza, i risultati hanno confermato che l'aumento delle concentrazioni di perossido di idrogeno ha portato a un livello più elevato di colorazione del tracciatore di lisa Una volta padroneggiata, questa procedura di colorazione può essere eseguita in meno di due ore se eseguita correttamente Seguendo questa procedura. Altri metodi come l'immunocolorazione NX in five o lc three possono essere eseguiti per confermare il tipo di morte cellulare. Non dimenticare che attualmente il verde Trecker funziona solo su cellule vive, quindi il rosso Reca è l'opzione migliore per i campioni che richiedono la fissazione.