L'uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Lo scopo della seguente procedura è dimostrare come mantenere i lisosomi di due tipi di campioni, embrioni di topo e cellule staminali differenziate, utilizzando il colorante lyo tracker per rilevare i modelli di morte cellulare. Per preparare i campioni embrionali, gli embrioni vengono innanzitutto isolati chirurgicamente e posizionati in una piastra per preparare le cellule differenziate. Le cellule staminali embrionali vengono utilizzate per creare corpi embrionali.

Questi corpi embrionali vengono coltivati in sospensione e successivamente cresciuti come monocito su una camera da coltura. Il monocito embrionale può essere incubato con ot tracker red e quindi i campioni vengono risciacquati e fissati, dopodiché possono essere fotografati per esaminare e quantificare i risultati della colorazione, che mostrano Liso Tracker. La colorazione è una procedura semplice che può essere utilizzata per saggiare la morte cellulare programmata negli embrioni e nelle cellule in coltura.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi del tunnel, è che, essendo il colorante OT tracker una molecola di piccole dimensioni, è possibile analizzare rapidamente e facilmente tessuti spessi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui modelli di morte cellulare programmata negli embrioni di topo e nelle colture differenziate, può essere applicato anche ad altri tipi di tessuto, come gli embrioni di pollo e le cellule staminali adulte in differenziamento. Accoppiare topi femmine giovani con un maschio riproduttore e, nelle mattine successive, verificare la presenza di un tappo vaginale, che indica che l'accoppiamento è avvenuto.

A mezzogiorno del giorno in cui appare il tappo vaginale corrisponde effettivamente a 0,5 giorni. Dopo il coito al giorno embrionale di interesse, eutanasia la femmina seguendo protocolli approvati ed asporta l'utero in una piastra di Petri da 10 centimetri contenente Hank's BSS, quindi rimuovi qualsiasi traccia di sangue. Separa gli embrioni ed estraili dall'utero.

Rimuovere le membrane extraembrionali e eseguire almeno un risciacquo con Hank's BSS per eliminare i tessuti e il sangue in eccesso. Mantenere gli embrioni dissezionati sul ghiaccio durante la pulizia. Gli altri.

Preparare cinque millilitri di soluzione di colorazione per embrioni con Liso tracker. Questo volume è sufficiente per una o due raccolte di embrioni. Mescolare delicatamente la soluzione per disperdere il colorante, quindi trasferire gli embrioni nella soluzione e incubarli a 37 gradi Celsius per 45 minuti.

Dopo l'incubazione, risciacquare delicatamente gli embrioni in Hank's BSS quattro volte, per cinque minuti ogni lavaggio. È importante eseguire i risciacqui con delicatezza per non danneggiare il tessuto. Rimuovere il liquido lentamente, prestando particolare attenzione alla posizione degli embrioni delicati e lasciando sempre una parte di liquido che li ricopra.

Quindi fissare gli embrioni in paraformaldeide al 4% durante la notte. Il giorno successivo, risciacquare gli embrioni una volta in Hank's BSS per 10 minuti per rimuovere il fissativo. A questo punto disidratare i tessuti mediante una serie di metanolo per eliminare la colorazione di fondo.

Questo passaggio migliora il rapporto segnale-rumore durante l'acquisizione delle immagini prima dello stoccaggio. Se necessario, raccogliere un campione di tessuto da ciascun embrione per l'analisi genetica. Successivamente, reidratare il campione di tessuto prima del genotipaggio.

Separare gli embrioni in provette individuali con etichette corrispondenti al campione di tessuto. Ora è possibile conservare gli embrioni isolati indefinitamente in metanolo a meno 20 gradi Celsius, al riparo dalla luce.

Cominciare preparando i corpi embrionali mediante il metodo della goccia sospesa. Con una densità iniziale di 500 cellule per goccia di 20 microlitri, dopo tre giorni trasferire i corpi embrionali in colture in sospensione su piastre di Petri non aderenti da 10 centimetri. Coltivarli per cinque giorni, sostituendo il mezzo ogni due giorni a partire dal quinto giorno.

Trasferire i corpi embrionali su vetri portaoggetto con otto camere gelatinizzati, posizionando uno o due corpi embrionali in ogni camera. Coltivare i corpi embrionali per altri 10 giorni. Dopo 10 giorni, cambiare il mezzo ogni due giorni: aspirare delicatamente il mezzo esistente e aggiungere 300 microlitri di soluzione di colorazione cellulare Lyo tracker in ogni camera.

Attenzione a pipettare manualmente il mezzo posizionando la punta della pipetta nell'angolo della camera. In questo modo, non si rischia di rimuovere accidentalmente ogni corpo, mentre si sta ancora attaccando alla superficie di vetro. Quando si aggiunge nuovamente il mezzo, posizionare la punta della pipetta nell'angolo della camera e reinserire il mezzo molto lentamente.

Incubare le camere a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, lavarle due volte con DPBS per cinque minuti per ogni lavaggio. A questo punto, fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il fissativo con DPBS mediante due risciacqui di cinque minuti ciascuno. Per montare gli embrioni, posizionarli su un vetrino con cavità profonda o su una piccola capsula di Petri con schermo protettivo. Preparare i campioni cellulari per la microscopia aspirando il DPBS.

Rimuovere la camera dal vetrino e lasciarla asciugare all'aria per circa cinque minuti. Coprire con della pellicola per proteggere il fluorocromo. Quindi aggiungere un mezzo di montaggio acquoso, come Vector Shield con DAPI, e posizionare un coprioggetto sulla parte superiore.

Ora il vetrino è stato montato ed è pronto per l'acquisizione delle immagini. Visualizzare i campioni con un microscopio stereoscopico o ottico dotato di filtro per rodamina, domine o Texas red. La colorazione è tipicamente molto intensa, quindi di solito non sono necessarie lunghe esposizioni in modalità manuale.

Scattare foto digitali di tutti i campioni nelle stesse condizioni di esposizione. Per quantificare le immagini, aprirle in Adobe Photoshop o in un programma di elaborazione immagini simile. Per determinare la quantità di colorazione con il marcatore lyo, selezionare il canale rosso.

Prendere nota del numero di pixel per l'intera immagine, come mostrato dalla funzione istogramma. Successivamente, applicare una soglia all'immagine in modo che la colorazione rossa sia ora rappresentata da pixel bianchi. Questo converte l'immagine in bianco e nero.

Scegliere un livello di soglia e utilizzare questo livello per tutte le immagini del set. Selezionare i pixel bianchi utilizzando lo strumento di selezione dell'intervallo cromatico e utilizzare la funzione istogramma per ottenere il conteggio totale dei pixel bianchi. Utilizzare il canale blu per contare il numero di nuclei nel campo.

Può essere utile conservare una registrazione del conteggio annotando l'immagine, registrando i valori e utilizzandoli per calcolare il livello medio di colorazione per cellula. Ripetere questa analisi con la stessa impostazione della soglia per tutte le restanti immagini. Per il campionamento, è stato utilizzato ly o tracker per colorare gli embrioni mutanti per sonic hedgehog.

Dato che il tracciante ly O è una piccola molecola altamente diffusibile, le aree profonde all'interno del mesoderma di un intero embrione colorate a 10,5 giorni post coito hanno mostrato un aumento notevole della morte cellulare programmata o PCG negli embrioni mutanti null per sonic hedgehog, in particolare nelle regioni degli arti e del tronco. I primordi degli arti sono stati osservati in preparati interi con un ingrandimento maggiore per valutare il modello complessivo. Le porzioni dissezionate sono state inoltre sezionate mediante microtomo a vibrazione.

La punta della freccia indica una colorazione aumentata nella punta distale null per sonic hedgehog in sezioni ottenute con un criostato; la colorazione tunnel è stata utilizzata in combinazione con OT Tracker in queste fette. Sebbene non vi sia una correlazione rigorosamente uno-a-uno tra il marcatore lyo e la colorazione tunnel, le regioni generali di morte cellulare programmata (PCD) si sovrappongono notevolmente a ingrandimento maggiore. È possibile osservare punti che risultano positivi al saggio tunnel ma non al colorante otra, punti che si colorano solo con il colorante lyra e punti che mostrano una colorazione sovrapposta. Dopo 10 giorni di coltura di embrioni in blocco, le cellule si sono differenziate in una varietà di tipi cellulari, inclusi neuroni, cellule muscolari e cardiomiociti.

Nella coltura normale di cellule staminali differenziate, sono presenti alcune cellule che hanno subito morte cellulare programmata (PCD), come rilevato mediante saggi con lyo tracker e tunnel. Successivamente, le cellule sono state trattate con perossido di idrogeno per indurre la morte cellulare da stress ossidativo. Una bassa dose di perossido di idrogeno ha aumentato sia la colorazione con lyo tracker che quella con tunnel, rispetto all'assenza di trattamento.

In modo simile ai risultati ottenuti nell'embrione, entrambi i coloranti hanno evidenziato cellule comuni e uniche. Una dose elevata di perossido di idrogeno ha determinato un ridimensionamento cellulare e una maggiore diffusione della positività al tracciante OT e al test TUNEL. A scopo comparativo, la privazione di siero è stata utilizzata per indurre l'autofagia dopo un'ora di privazione di siero.

La colorazione con OT tracker è aumentata. Tuttavia, la positività al test TUNEL è rimasta a livelli normali. Pertanto, anche se la rilevazione è semplice e utile, è importante eseguire ulteriori saggi per determinare se la colorazione indica apoptosi o autofagia dopo la quantificazione dei campioni.

Utilizzando il semplice metodo di Photoshop illustrato in precedenza, i risultati hanno confermato che concentrazioni crescenti di perossido di idrogeno hanno determinato un livello più elevato di colorazione con Lys Tracker. Una volta acquisita padronanza, questa procedura di colorazione può essere eseguita in meno di due ore se effettuata correttamente seguendo questo protocollo. Altri metodi, come l'immunomarcatura con NX in five o LC3, possono essere eseguiti per confermare il tipo di morte cellulare. Non dimenticare che attualmente Tracker green funziona solo su cellule vive, quindi Reca red rappresenta la migliore opzione per campioni che richiedono fissazione.