Name: Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Scopri il protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLECs) da topi con purezza superiore al 95%. Questo metodo facilita lo studio delle funzioni cellulari e delle implicazioni cliniche nel sistema nervoso centrale.

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Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), della Natural Science Foundation della provincia dello Yunnan (202001AS070045, 202301AY070001-011) e della Scientific Research Foundation del Dipartimento dell'Istruzione della provincia dello Yunnan (2023Y0784).

Questa ricerca ha ricevuto l'approvazione del Comitato Etico per gli Esperimenti Animali dell'Università di Medicina di Kunming (kmmu20220945). Tutti gli esperimenti hanno aderito alle linee guida stabilite per la cura degli animali. Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono state raccolte da topi maschi C57Bl/6J di età compresa tra 6 e 8 settimane e di peso compreso tra 20 e 25 g. Questi topi sono stati acquistati dalla Kunming Medical University di Kunming, in Cina. L'intera procedura sperimentale è stata condotta in condizioni di sterilità rigorosa. Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato.
1. Preparazione dei reagenti e degli strumenti
NOTA: Tutte le fasi che coinvolgono le soluzioni devono essere eseguite all'interno di un armadio a rischio biologico di classe II.
<ol><li>Preparare il tampone di lavaggio mescolando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con calcio e magnesio, 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (P/S) (vedere Tabella dei materiali). Conservare questo tampone al freddo a 4 °C. È fondamentale prepararlo fresco il giorno dell'utilizzo e degassare il tampone.</li>
	<li>Preparare gli enzimi digestivi combinando 10 mL di PBS (senza calcio e magnesio) con 2 mL di tripsina allo 0,25%, 1 mL di papaina 20 mg/mL e 200 μL di collagenasi I da 1 mg/mL (vedi Tabella dei materiali). NOTA: Assicurarsi dell'uso di aliquote di volumi appropriati per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo. Conservare queste aliquote a -20 °C.</li>
	<li>Preparare il terreno di coltura utilizzando il kit di terreno di crescita delle cellule endoteliali disponibile in commercio, che include VEGF-C (100 ng/mL) e 1% P/S (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare il tampone di arresto integrando il terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di FBS per arrestare il processo di digestione.</li>
	<li>Prepara strumenti chirurgici sterili: questi strumenti dovrebbero includere forbici, pinzette a punta seghettata e pinzette a punta fine.</li>
</ol>2. Rivestimento del pallone
<ol><li>Rivestire il matraccio T25 con una soluzione di fibronectina 100 μg/mL (vedere Tabella dei materiali) e incubare per una notte a 37 °C. Prima dell'uso, rimuovere la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Lavare il pallone tre volte con PBS, successivamente aspirare il PBS e lasciare asciugare il pallone T25 all'aria.</li>
</ol>3. Dissociazione delle leptomeningi
NOTA: Utilizzare sempre tamponi e soluzioni preraffreddati a 4 °C.
<ol><li>Anestetizzare i topi con un'inalazione eccessiva di isoflurano al 4% e poi sacrificarli mediante rapida decapitazione utilizzando forbici precedentemente pulite con etanolo al 70%.</li>
	<li>Incidere con cura la pelle lungo la linea mediana, partendo dall'apertura nella parte posteriore del cranio ed estendendosi verso la zona frontale.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il cranio, sollevandolo delicatamente con le forbici per evitare di danneggiare le leptomeningi, assicurandosi di ottenere l'intero cervello, comprese le leptomeningi.</li>
	<li>Immergere l'intero cervello in un tampone di lavaggio e sciacquarlo delicatamente per rimuovere il sangue superficiale.</li>
	<li>Trasferisci il cervello in una capsula di Petri sterile senza tritare ed estrai le leptomeningi dalla superficie del cervello usando una pinzetta a punta fine al microscopio.</li>
	<li>Tagliare il tessuto delle leptomeningi in frammenti utilizzando microforbici sterili.</li>
</ol>4. Digestione enzimatica delle leptomeningi
<ol><li>Aggiungere 10 mL della miscela enzimatica (fase 1.2) ai frammenti e incubare a 37 °C per 15 min. Agitare delicatamente per assicurarsi che i frammenti si stacchino dal fondo del tubo. Successivamente, aggiungere 10 ml di tampone di arresto (passaggio 1.4) per arrestare la digestione.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di PBS freddo e passare la miscela attraverso un colino da 70 μm in una provetta sterile da 50 mL per filtrare eventuali grumi.</li>
</ol>5. Espansione cellulare
<ol><li>Piastra 1 x 10 5 cellule per cm 2 in un matraccio T25 rivestito di fibronectina (fase2) con5 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore. Successivamente, rimuovere il terreno per eliminare le cellule non attaccate.</li>
	<li>Sostenere la cultura sostituendo il 50% del terreno ogni due giorni. Ripeti questo processo due o tre volte.</li>
</ol>6. Selezione della cella magnetica
NOTA: Lavorare rapidamente, mantenere la freddezza delle celle e utilizzare soluzioni pre-raffreddate per prevenire l'etichettatura non specifica delle cellule.
<ol><li>Preparazione degli strumenti e dei reagenti: collegare un separatore magnetico a un supporto per separatore magnetico (vedere la tabella dei materiali). Collegare una colonna di selezione al separatore magnetico e posizionare un filtro cellulare da 70 μm sopra la colonna di selezione. Posizionare una provetta da 50 ml sotto la colonna di selezione per raccogliere il flusso.</li>
	<li>Digestione enzimatica: una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza, aspirare il terreno e risciacquare le cellule con PBS. Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Arrestare la digestione aggiungendo il tampone di arresto. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Incubazione degli anticorpi: risospendere 1 x 107 cellule totali in 100 μL di PBS e aggiungere 10 μL di anticorpo LYVE-1 (vedere la tabella dei materiali). Mescolare accuratamente e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.<ol><li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Sciacquare le cellule introducendo 1 mL di PBS e centrifugando a 300 x g per 5 min. Rimuovere completamente il surnatante.</li>
	</ol></li>
	<li>Marcatura delle microsfere: risospendere le cellule in 100 μL di PBS e aggiungere 20 μL di Microsfere (vedi Tabella dei materiali). Mescolare bene e incubare per 30 minuti al buio a 4 °C.<ol><li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti e travasare il surnatante. Successivamente, detergere le cellule con 1 mL di PBS attraverso centrifugazione a 300 x g per 5 min. Infine, rimuovere completamente il surnatante.</li>
	</ol></li>
	<li>Esclusione magnetica negativa: risospendere le cellule in 4 mL di PBS. Passare le cellule attraverso un colino cellulare da 70 μm per eliminare i grumi. Preparare la colonna di selezione (vedere Tabella dei materiali) sciacquandola con 3 mL di PBS, quindi applicare la sospensione cellulare nella colonna di selezione.<ol><li>Eseguire le fasi di lavaggio con 3 mL di PBS e raccogliere le cellule LYVE-1-negative in una provetta da 50 mL posizionata sotto la colonna di selezione per consentirne il passaggio.</li>
	</ol></li>
	<li>Selezione magnetica positiva: pipettare 6 mL di PBS nella colonna di selezione. Svuotare istantaneamente le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna di selezione per ottenere LLEC positivi a LYVE-1. NOTA: Attendere sempre che il serbatoio della colonna di selezione sia vuoto prima di procedere al passaggio successivo.</li>
</ol>7. Cultura dei LLEC
<ol><li>Centrifugare gli LLEC LYVE-1-positivi a 300 x g per 5 minuti, quindi rimuovere con cautela il surnatante.</li>
	<li>Inserire 1 x 10 5 cellule per cm2 in un matraccio T25 rivestito di fibronectina con5 mL di terreno di coltura.</li>
	<li>Mantieni la cultura sostituendo il 50% del mezzo a giorni alterni. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, staccare le cellule con lo 0,25% di tripsina ed eseguire il passaggio cellulare. Utilizzare le cellule per esperimenti successivi dopo 2-3 passaggi.</li>
</ol>8. Analisi citofluorimetrica
NOTA: L'analisi citofluorimetrica a flusso è stata condotta seguendo la procedura precedentemente descritta15.
<ol><li>Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule aderenti e incubare a 37 °C per 5 min. Quindi, aggiungi il tampone di arresto per arrestare la digestione.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min e aspirare completamente il surnatante. Risospendere 1 x 106 cellule in 100 μL di PBS.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL di anticorpo LYVE-1. Mescolare accuratamente e incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in una quantità appropriata di tampone PBS per l'analisi utilizzando la citometria a flusso e il software FlowJo (vedere Tabella dei materiali).</li>
</ol>9. Colorazione immunofluorescente
NOTA: La colorazione immunofluorescente è stata condotta seguendo la procedura descritta in precedenza16.
<ol><li>Lavare le celle con PBS tre volte. Fissare le celle con paraformaldeide (PFA) al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il PFA e lavare le celle con PBS tre volte.</li>
	<li>Applicare il tampone a blocchi per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone di blocco dai vetrini coprioggetti.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo LYVE-1 nel tampone di colorazione alle cellule e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere alle cellule un anticorpo secondario appropriato (vedere la tabella dei materiali) nel tampone di colorazione e incubare al buio. Lavare le celle tre volte con PBS.</li>
	<li>Controcolorante con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Le cellule sono ora pronte per la microscopia a immunofluorescenza.</li>
</ol>

Realizzazione di colture LLEC in vitro mediante selezione cellulare magnetica

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<li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries%3A+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).</li>
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<li>Wilting, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Prox1+is+a+marker+for+lymphatic+endothelial+cells+in+normal+and+diseased+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues.</a> The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi da rivelare.

Il protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro non è stato precedentemente riportato. Questo studio introduce un protocollo riproducibile e multiprocedurale per la raccolta e la coltura di LLEC da leptomeningi di topo.
Sebbene questo protocollo multiprocedurale sia riproducibile, ci sono diverse considerazioni chiave. Ad esempio, i palloni T25 rivestiti di fibronectina promuovono l'adesione delle LLEC e funzionano eliminando le cellule non aderenti, garantendo c...

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) appena scoperte formano un reticolo di singole cellule all'interno delle leptomeningi, mostrando un modello di distribuzione distinto rispetto alle cellule endoteliali linfatiche periferiche 1,2. Le funzioni cellulari e le implicazioni cliniche associate alle LLEC rimangono in gran parte un territorio inesplorato. Al fine di aprire la strada alla ricerca funzionale sui LLEC, è imperativo stabilire un modello in vitro per il loro studio. Pertanto, questo studio ha ideato un protocollo completo per l'isolamento e la coltura primaria delle LLEC.
I topi sono il modello animale preferito per la loro idoneità alla manipolazione genetica nella ricerca sulle malattie. Studi precedenti hanno isolato con successo cellule endoteliali linfatiche da vari tessuti di topo, tra cui i linfonodi3, il tessuto mesenterico4, il tessuto dermico5, i linfatici di raccolta6 e il tessuto polmonare7. Queste procedure di isolamento si sono basate principalmente su tecniche come il cernimento cellulare attivato magneticamente (MACS) e lo smistamento con citometria a flusso 8,9,10. Inoltre, gli sforzi di ricerca hanno portato alla creazione di linee cellulari aracnoidee di ratto e linee cellulari capillari linfatiche di ratto11,12. Nonostante l'esistenza di tecniche di coltura di espianto per leptomeningi13, esiste un urgente bisogno di un protocollo standardizzato per l'isolamento e la coltura delle LLEC. Di conseguenza, questo studio ha raccolto e coltivato con successo le LLEC dissociando meticolosamente le leptomeningi sotto la guida di un microscopio e promuovendo l'espansione delle LLEC attraverso l'uso del fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C). Il marcatore distintivo per le cellule endoteliali linfatiche è il recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1)14. Questo protocollo a più fasi isola selettivamente gli LLEC positivi a LYVE-1 utilizzando MACS e successivamente ne verifica la purezza attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente.
Le fasi principali di questo protocollo multi-step possono essere riassunte come segue: rivestimento del pallone, dissociazione delle leptomeningi, digestione enzimatica delle leptomeningi, espansione cellulare, selezione magnetica delle cellule e successiva coltura di LLEC. Infine, la purezza delle LLEC isolate è confermata attraverso l'analisi citofluorimetrica e la colorazione immunofluorescente. L'obiettivo generale di questo studio è quello di presentare un protocollo riproducibile e multi-step per l'isolamento di LLEC da leptomeningi di topo e la loro successiva coltura in vitro . Questo protocollo è destinato a facilitare notevolmente le indagini sulle funzioni cellulari e sulle implicazioni cliniche delle LLEC.

<table><tbody><tr><td>Blocca buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0102</td><td>Memorizza aliquote su &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Solarbio</td><td>C8140</td><td>Conservare le aliquote a 20 &deg; C</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>Memorizza aliquote a &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Solarbio</td><td>11995</td><td>Memorizza le aliquote a &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1041</td><td>Conservare le aliquote a &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>C-3202</td><td>Negozio aliquote a &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Solarbio</td><td>S9010</td><td>Memorizza le aliquote su &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Solarbio</td><td>F8180&nbsp;</td><td>Memorizza le aliquote su &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td>V10.8.1</td><td></td></tr><tr><td>LYVE-1 anticorpo</td><td>eBioscience</td><td>12-0443-82</td><td>Memorizza aliquote su &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>Separatore magnetico</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-302</td><td>Sterile prima dell'uso</td></tr><tr><td>Supporto separatore magnetico</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>Sterile prima dell'uso</td></tr><tr><td>Microsfere</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-801</td><td>Conservare le aliquote a &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td>Conservare le aliquote a &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Solarbio</td><td>G8430-25g</td><td>Negozio aliquote a &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>D1040</td><td>Memorizza le aliquote su &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>PDPN anticorpo</td><td>Santa</td><td>sc-53533</td><td>Conservare le aliquote su &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td>Memorizza le aliquote su &ndash; 4 gradi </td></tr><tr><td>C PROX1 anticorpo</td><td>Santa</td><td>sc-81983</td><td>Conservare le aliquote su &ndash; 4 gradi C</td></tr><tr><td>Colonna di selezione&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>Sterile prima dell'uso</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Conservare le aliquote a &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>VEGF-C&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab51947</td><td>Memorizza aliquote su &ndash; 20 &deg; C</td></tr><tr><td>VEGFR-3 anticorpo</td><td>Santa</td><td>sc-514825</td><td>Conservare le aliquote a &ndash; 4 gradi E</td></tr></tbody></table>

raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC) sono una popolazione cellulare intracranica scoperta di recente con una distribuzione unica chiaramente distinta dalle cellule endoteliali linfatiche periferiche. La loro funzione cellulare e le implicazioni cliniche rimangono in gran parte sconosciute. Di conseguenza, la disponibilità di una fornitura di LLEC è essenziale per condurre ricerche funzionali in vitro. Tuttavia, attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura di LLEC in vitro.
Questo studio ha raccolto con successo le LLEC utilizzando un protocollo a più fasi, che includeva il rivestimento del pallone con fibronectina, la dissezione delle leptomeningi con l'assistenza di un microscopio, la digestione enzimatica delle leptomeningi per preparare una sospensione a singola cellula, l'induzione dell'espansione delle LLEC con il fattore di crescita dell'endotelio vascolare-C (VEGF-C) e la selezione di cellule positive al recettore ialuronico dei vasi linfatici-1 (LYVE-1) attraverso la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS). Questo processo ha portato alla creazione di una cultura primaria. La purezza degli LLEC è stata confermata attraverso la colorazione in immunofluorescenza e l'analisi citofluorimetrica, con un livello di purezza superiore al 95%. Questo protocollo in più fasi ha dimostrato riproducibilità e fattibilità, il che faciliterà notevolmente l'esplorazione della funzione cellulare e delle implicazioni cliniche delle LLEC.

Questo studio presenta un protocollo riproducibile in più fasi per la raccolta di cellule endoteliali linfatiche (LLEC) dai topi e successivamente la creazione della loro coltura primaria in vitro. Le fasi chiave riguardano la preparazione del matraccio e il rivestimento della fibronectina, la dissociazione delle leptomeningi, l'ottenimento di una sospensione unicellulare attraverso la digestione enzimatica e l'induzione dell'espansione delle LLEC con VEGF-C. Le LLEC LYVE-1-positive vengono quindi isolate selett...

Le cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLEC), un tipo di cellula intracranica recentemente identificato, hanno funzioni poco conosciute. Questo studio presenta un protocollo riproducibile per la raccolta di LLEC dai topi e la creazione di colture primarie in vitro . Questo protocollo è progettato per consentire ai ricercatori di approfondire le funzioni cellulari e le potenziali implicazioni cliniche delle LLEC.

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Questo protocollo è progettato per le aree di altri ricercatori interessati solo dove ha stabilito la multi procedura e le aree primarie culturali Il nostro protocollo alla fine ha portato alla creazione della nostra cultura primaria dell'area CS con un livello di purezza superiore al 95% Attualmente non esiste un protocollo esistente per la raccolta e la coltura I nostri risultati hanno aperto la strada a ulteriori indagini sulla funzione simile di LLEC nel virtuale. Al RUC, la nostra recente scoperta della popolazione cellulare intracranica, il significato biologico della RUC Condurremo ulteriori ricerche sulla funzione cellulare e ne esamineremo le implicazioni cliniche.

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Neuroscienze

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le cellule endoteliali linfatiche rivestono i vasi cisti-come malformazione linfatica umani e prepuzi utilizzando cellule fluorescenza attivate (FACS). Coltura delle cellule e successiva espansione di queste cellule permette un nuovo livello di sofisticazione sperimentale per studi genetici, proteomica, funzionali e differenziazione cellulare.

Isolamento di cellule umane endoteliali linfatico da Multi-parametro fluorescenza-attivato cell sorting

Il protocollo cultura leptomeningi espianto dal post-mortem cervello umano è un modo tecnicamente robusto e semplice da ricavare fibroblasti meningei fibronectina-positivo entro 6-8 settimane e crioconservazione circa 20-30 milioni di cellule.

Derivazione delle Culture leptomeningi Explant da Postmortem cervello umano donatori

Descriviamo un'iniezione intracisternache che impiega un ago piegato sulla punta che può essere stabilizzato al cranio, eliminando così il rischio di danni al parenchyma sottostante. L'approccio può essere utilizzato per la mappatura genetica del destino e manipolazioni delle cellule leptomeningeee e per il monitoraggio del movimento del fluido cerebrospinale.

Induzione di cellule leptomeningeali Modifica tramite iniezione intracisternale

Il protocollo qui descritto evidenzia i principali passaggi nella differenziazione delle cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte, nella preparazione di Neisseria meningitidis per l'infezione e nella raccolta di campioni per altre analisi molecolari.

Meningitidis di Neisseria Infezione di cellule endoteliali cerebrali derivate da cellule staminali pluripotenti indotte

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

Questo articolo descrive un protocollo per la propagazione delle cellule tumorali circolanti nel liquido cerebrospinale (CSF-CTC) raccolte da pazienti con malattia leptomeningea associata a melanoma (M-LMD) per sviluppare modelli preclinici per lo studio di M-LMD.

Ex Vivo Coltura di cellule tumorali circolanti nel liquido cerebrospinale da pazienti con melanoma per studiare la malattia leptomeningea associata al melanoma

Viene presentato un protocollo per l'isolamento e la coltura primaria delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) dal tessuto cerebrale murino neonatale per generare un modello in vitro robusto per studiare la funzione della barriera emato-encefalica in condizioni fisiologiche e patologiche.

Isolamento e coltura delle cellule endoteliali microvascolari del cervello del topo

Qui viene presentato un protocollo per valutare i vasi linfatici meningei (MLV) dei muri, che svolgono un ruolo importante in molteplici malattie neurologiche. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo integrato che consenta sia la valutazione funzionale del drenaggio dei tracce sia la caratterizzazione morfologica dettagliata della rete di MLV dorsali.

Protocollo integrato per la valutazione dei linfatici meningei: iniezione di cisterna magna, imaging dei linfonodi, dissezione meningea e colorazione dell'intero montaggio

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per analizzare, attraverso trasfezione elettroporazione e neuroni dell'ippocampo e del mouse cultura corticale. Colture a breve termine possono essere utilizzati per gli studi della crescita degli assoni e la guida, mentre a lungo termine le culture possono essere utilizzati per studi di sinaptogenesi e analisi spine dendritiche.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Qui forniamo un protocollo per la coltura di neuroni corticali di ratto in presenza di uno strato alimentatore gliali. I neuroni coltivati ​​stabilire la polarità e di creare le sinapsi, e può essere separato dalla glia per l'utilizzo in diverse applicazioni, quali elettrofisiologia, imaging del calcio, saggi di sopravvivenza cellulare, immunocitochimica, e RNA / DNA / isolamento delle proteine.

Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia

Scopri il protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali linfatiche leptomeningee (LLECs) da topi con purezza superiore al 95%. Questo metodo facilita lo studio delle funzioni cellulari e delle implicazioni cliniche nel sistema nervoso centrale.

Raccolta e coltura primaria di cellule endoteliali linfatiche leptomeningee

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