Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

Provided è un protocollo per lo sviluppo di un test di amplificazione della polimerasi ricombinasi in tempo reale per quantificare la concentrazione iniziale di campioni di DNA utilizzando un termociclatore o un microscopio e un riscaldatore per tavolini. Viene anche descritto lo sviluppo di un controllo positivo interno. Vengono forniti script per l'elaborazione di dati grezzi di fluorescenza in tempo reale.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare la semplificazione quantitativa della ricombinasi polimerasi per quantificare la concentrazione di DNA di campioni sconosciuti. Ciò si ottiene aggiungendo prima alla reazione il controllo positivo interno del DNA bersaglio, i primer del DNA e le sonde marcate in fluorescenza. In una seconda fase, le reazioni vengono inserite nella macchina PCR in tempo reale, che riscalda le reazioni per attivare gli enzimi e monitora la fluorescenza delle sonde per rilevare la generazione di ampliconi target e di controllo.

Successivamente, i dati fluorescenti vengono analizzati utilizzando uno script per generare la curva standard e convalidare il saggio. I risultati mostrano che i campioni di DNA possono essere quantificati con precisione entro un ordine di grandezza della concentrazione corretta sulla base degli esperimenti di convalida utilizzati per quantificare un DNA bersaglio dell'HIV. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la PCR quantitativa in tempo reale, è che l'RPA è isotermica, quindi non è necessario un costoso termociclatore.

L'RPA richiede anche una minore amplificazione alla temperatura, è tollerante ai campioni sporchi, amplifica il target a livelli rilevabili in pochi minuti e utilizza alcuni enzimi per consentire un facile trasporto e conservazione a temperatura ambiente. Per iniziare a pulire tutti i piani di lavoro e le superfici delle apparecchiature con una soluzione di candeggina al 50% per creare uno spazio di lavoro di preamplificazione pulito, rimuovere la soluzione di acetato di magnesio da 280 millimolari, il tampone di reidratazione e i pellet di reazione dal congelatore a meno 20 gradi Celsius e scongelare le soluzioni a temperatura ambiente. Quindi assemblare una miscela master trasferendo 383,5 microlitri di tampone di reidratazione in un nuovo tubo micro fuge a 41,6 microlitri di acqua priva di nucleasi nel tampone e vortice per miscelare 35 microlitri di acetato di magnesio in un tubo separato.

Rimettere l'acetato di magnesio nelle soluzioni stock del tampone reidratante nel congelatore. Quindi ottenere l'innesco e le prob quas dal frigorifero a quattro gradi Celsius. Posizionali nell'area di lavoro di preamplificazione e spegni le luci per ridurre al minimo l'esposizione alla luce a 27,3 microlitri di ciascuno dei 10 primer micromolari in avanti e indietro alla miscela master.

Segue a 7,8 microlitri dell'esagono da 10 micromolari etichettato HIV 1D NA. Sonda la miscela master e agita il tubo. Quindi restituire il primer e le soluzioni stock della sonda allo stoccaggio I reagenti per il controllo positivo interno possono essere aggiunti qui come indicato nel protocollo di testo per assemblare le reazioni QRPA. Per prima cosa, posizionare i pellet enzimatici liofilizzati in singole provette di due strisce di provette PCR a otto pozzetti, pipettare 37,5 microlitri della miscela master in una provetta contenente un pellet.

Mescolare delicatamente il contenuto della provetta con la punta della pipetta per sciogliere il pellet senza creare bolle. Rimuovere con cautela il puntale dalla reazione per evitare una perdita di volume e assicurarsi di cambiare i puntali della pipetta tra una provetta e l'altra. Trasferire i tubi in un blocco freddo freddo a 96 pozzetti per almeno cinque minuti per raffreddare la miscela master.

Nel frattempo, caricare il software del termociclatore con il protocollo e la disposizione delle piastre è indicata nel protocollo di testo. Quindi, tagliare due strisce di adesivi microsigillanti in plastica trasparente in modo che siano leggermente più larghe delle provette per PCR. E anche ottenere due coperchi piatti della striscia di provette PCR, aliquotare l'HIV uno modello plasmidico come indicato nel protocollo di testo.

E poi aggiungere 10 microlitri del modello alla provetta PCR appropriata. Anche in questo caso, mescolare delicatamente la miscela con il puntale della pipetta. Quindi, aggiungi 2,5 microlitri di acetato di magnesio a ciascun tappo della provetta, quindi posiziona delicatamente i tappi sopra le provette di reazione in modo che non siano completamente sigillate.

L'acetato di magnesio deve essere chiaramente visibile attraverso il cappuccio. Posizionare le strisce di provette per PCR in una microcentrifuga e centrifugare le provette per 10 secondi per raccogliere tutto il liquido sul fondo della provetta e rimuovere eventuali bolle. La combinazione della soluzione di acetato di magnesio con la miscela master avvia la reazione QRPA.

Rimuovere rapidamente le provette per PCR nel blocco freddo per arrestare la reazione. Quindi, rimuovere lentamente i coperchi per evitare di contaminare le reazioni e sigillare le provette con una pellicola di microsigillatura trasparente. Trasferire i tubi al termociclatore in base alle posizioni nel layout della piastra.

Chiudere il coperchio del termociclatore e fare clic su Avvia esecuzione. Assicurarsi di designare un nome file per l'esperimento al termine dell'esecuzione. Visualizza i dati grezzi della fluorescenza ed esportali in un foglio di calcolo che creerà un file chiamato risultati dell'amplificazione della quantificazione.

Per costruire la curva standard. Innanzitutto, scarica lo script della curva standard, quindi apri MATLAB o un programma di analisi dei dati simile. Aprire lo script e premere Esegui per eseguire lo script.

Digitare il numero di file di dati da analizzare quando richiesto. Digitare quindi il numero di campioni e il numero di repliche in ogni file di training. Nella finestra di comando.

Digita la concentrazione di DNA più bassa in 10 copie logaritmiche che è stata utilizzata per costruire la curva standard e premi invio. Nell'esempio qui. La concentrazione più bassa è di un log basato su 10 copie.

Quindi digita la differenza di concentrazione tra ogni standard di DNA nel prompt dei comandi e premi invio qui. L'intervallo di concentrazione è di un log basato su 10 copie. Quindi, inserisci il valore per la soglia di pendenza nella finestra di comando e premi invio.

Questo valore è in genere compreso tra tre e cinque. Digitare il numero di deviazioni standard sopra lo sfondo per la soglia positiva, nota anche come Z, quindi premere invio per immettere l'intervallo di valori Z tipici da uno a cinque. Quindi, specificare l'attrezzatura utilizzata per raccogliere i dati in questo caso.

Digitarne uno per il termociclatore, quindi premere invio. Se è presente un controllo positivo interno, selezionare il valore predefinito o un nuovo valore per la soglia digitando Y o N a seconda che sia necessaria una nuova soglia. Infine, seleziona tutti i file del foglio di calcolo che verranno utilizzati per costruire la curva standard.

Lo script importerà e analizzerà automaticamente tutti i dati. La QRPA in tempo reale è stata eseguita su campioni duplicati contenenti diversi numeri di copia di HIV 1D NA. L'inizio dell'amplificazione rilevabile, indicato da un aumento della fluorescenza, si verifica prima per i campioni con un numero di copie del DNA più elevato rispetto ai campioni con un numero di copie inferiore. I dati grezzi di fluorescenza sono stati utilizzati per generare una curva standard dall'amplificazione delle concentrazioni note di HIV 1D NA. Questi dati sono stati adattati a una curva esponenziale e il valore R al quadrato indica un'elevata bontà di adattamento.

La curva standard è stata utilizzata per prevedere le concentrazioni di ulteriori campioni di DNA di concentrazione nota. La regolazione del valore di Z a uno consente una previsione accurata di basse concentrazioni di DNA. Al contrario, alte concentrazioni di DNA sono meglio previste con un valore Z di cinque.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che l'RPA non dispone di veri cicli per limitare il tasso di amplificazione del DNA. Quindi la velocità di amplificazione deve essere controllata con precisione. La coerenza tra gli esperimenti è fondamentale, quindi assicurati di utilizzare le stesse aliquote di primer per tutti gli esperimenti.

Protegge i componenti di reazione dal calore e dalla luce. Aggiungere acetato di magnesio immediatamente prima dell'inizio della raccolta dei dati e mantenere le reazioni nel blocco freddo fino all'inizio. L'esperimento.