Name: Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri l'amplificazione quantitativa con polimerasi ricombinasi per quantificare il DNA utilizzando un controllo positivo interno. Questo metodo isotermico offre un'alternativa accessibile alla PCR in tempo reale.

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Questa ricerca è stata finanziata da una sovvenzione della Bill &amp; Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges in Global Health Initiative.

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Al fine di ottenere dati di quantificazione significativi utilizzando l&#39;algoritmo di MATLAB, l&#39;utente deve selezionare i valori di input appropriati quando richiesto. Dopo l&#39;avvio ogni script ai punti 5 e 6, tutte le variabili di input sono sollecitati automaticamente nella finestra di comando e le uscite sono generati automaticamente. Nella Sezione 5.7 all&#39;utente viene richiesto di selezionare una soglia pista. Il valore della soglia pista colpisce il quadrato del coefficiente di correlazione (r 2)...

Quantitative amplificazione degli acidi nucleici è una tecnica importante per il rilevamento di ambientale, di origine alimentare, e gli agenti patogeni di origine idrica, nonché per la diagnostica clinica. Real time PCR quantitativa (qPCR) è il metodo gold standard per il rilevamento sensibile, specifico e quantitativa degli acidi nucleici, ad esempio, per l&#39;HIV-1 test di carica virale, il rilevamento di batteri patogeni, e lo screening per molti altri organismi 1 - 3. Durante tempo reale qPCR, primer amplificano patogeno DNA in cicli, e un segnale fluorescente viene generato che è proporzionale alla quantità di DNA amplificato nel campione ad ogni ciclo. Un campione contenente una concentrazione sconosciuta di DNA patogeno può essere quantificato utilizzando una curva standard che riguarda la concentrazione di DNA iniziale di campioni standard e il momento in cui il segnale fluorescente raggiunge una certa soglia (cioè, la soglia ciclo o C T). <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Perché in tempo reale qPCR richiede costose attrezzature cicli termici e diverse ore per ricevere i risultati, tecniche di amplificazione isotermica alternativi, come recombinase polimerasi amplificazione (RPA), sono stati sviluppati 4. Queste piattaforme genere forniscono risultati più rapidi e amplificare acidi nucleici a singolo temperatura inferiore, che può essere realizzato con meno costoso, attrezzature semplici. RPA, che è particolarmente interessante per applicazioni point-of-care, amplifica il DNA in minuti, richiede una temperatura bassa di amplificazione (37 ° C), e rimane attiva in presenza di impurità 5,6. Saggi RPA sono stati sviluppati per una vasta gamma di applicazioni, tra cui l&#39;analisi degli alimenti, degli agenti patogeni, lo screening di farmaci antitumorali, e la rilevazione di agenti biothreat 7-12. Tuttavia, l&#39;uso di RPA per la quantificazione degli acidi nucleici è stata limitata 13,14. In lavori precedenti, è stato shown che in tempo reale RPA quantitativa (qRPA) è fattibile 15. Qui, un protocollo più dettagliata per l&#39;utilizzo in tempo reale quantitativa RPA quantificare campioni sconosciuti utilizzando una curva standard, un metodo che è analogo a quantificazione utilizzando qPCR. Questo protocollo descrive come eseguire una reazione RPA su un termociclatore per rilevare HIV-1 DNA come un proof-of-concept, e come sviluppare un controllo positivo interno (IPC) per garantire che il sistema funzioni correttamente. La raccolta dei dati utilizzando un termociclatore o microscopio e analisi dei dati per la costruzione di una curva standard utilizzando i dati di formazione è anche dettagliato. Infine, il metodo per quantificare i campioni sconosciuti utilizzando la curva standard con uno script personalizzato è dimostrata. Questa tecnica consente qRPA quantificazione dei campioni con concentrazioni sconosciute e ha molti vantaggi rispetto tradizionale in tempo reale qPCR.

<table><tbody><tr><td>Saggio qRPA Primer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diretto HIV-1</td><td>Tecnologie del DNA integrate</td><td>Oligo DNA personalizzati</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Primer inverso HIV-1</td> Integrated <td>DNA Technologies</td> oligo <td>DNA personalizzati</td><td>5'-CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda HIV-1</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td><td>DNA personalizzato oligo</td><td>5'- TGC TAT TAT GTC TAC TAT TCT TTC CCC [SIMA/HEX] GC [THF] C [dT-BHQ1] GTA CCC CCC AAT CCC C -3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda IPC</td><td>BioSearch Technologies&nbsp;</td>DNA <td>personalizzato oligo</td><td>5'-AGG TAG TGA CAA GAA ATA ACA ATA CAG GAC [FAM] T [THF] T [dT-BHQ1] GGT TTT GTA ATT GGA A -3'</td></tr><tr><td>Reagenti RPA exo (pellet, tampone di reidratazione, acetato di magnesio</td><td>TwistDx</td><td>TwistAmp exo</td><td></td></tr><tr><td>PCR strisce di provette</td><td>BioRad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td>PCR strisce di provette con tappo piatto</td><td>BioRad</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo micro-seal</td><td>BioRad</td><td>558/MJ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bersaglio dell'HIV-1 (pHIV-IRES- eYFP&Delta; Env&Delta; Vif&Delta; Vpr)</td><td></td><td></td><td>plasmide personalizzato, vedi: Segall, H. I., Yoo, E. & Sutton, R. E. Caratterizzazione e rilevamento di lentivirus competenti per la replicazione artificiale di una gamma di ospiti alterata. Terapia molecolare 8, 118&ndash; 129, doi:10.1016/S1525-0016(03)00134-5 (2003).</td></tr><tr><td>DNA genomico maschile umano Applied</td><td>Biosystems</td><td>360486</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti blocco freddo</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-36700-48</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>BioRad</td><td>CFX96</td><td></td></tr><tr><td>MiniFuge</td><td>VWR</td><td>93000-196</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Tris tampone 1.0 M, pH 8.0</td><td>EMD Millipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Promega</td><td>V4321</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Sviluppo</td><td></td><td></td><td></td>IPC</tr><tr><td>Cryptosporidium parvum Modello IPC</td><td>Waterborne Inc</td><td>P102C</td><td>È anche possibile ordinare un bersaglio sintetico a doppio filamento da IDT se l'utente non è attrezzato per lavorare con C. parvum (un agente infettivo BSL-2). I primer PCR e RPA per C. parvum sono stati progettati utilizzando il numero di accesso GenBank AF115377.1</td></tr><tr><td>PCR primer a lungo termine</td><td>Tecnologie DNA integrate Oligo</td><td>DNA personalizzati</td><td>5'-TGG CAG TAT TCA TTC ACA ATT TTA AAA GAA AAG G/ ATC TAA GGA AGG CAG CAG GC-3'</td></tr><tr><td>Primer inverso lungo per PCR</td><td>Integrated DNA Technologies</td> oligo <td>DNA personalizzati</td><td>5'- CCC GAA AAT TTT GAA TTT TTG TAA TTT GTT TTT G/ TGC TGG AGT ATT CAA GGC ATA -3'</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelty DNA Polimerasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit di estrazione del gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>TAE 10X tampone</td><td>EMD Millipore</td><td>574797</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Esperimenti</td><td></td><td></td><td></td></tr> al <tr><td>microscopio Microscopio verticale a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Imager.J1</td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore a tavolino</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-GSH</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura ad alta stabilità di precisione a 1 canale</td><td>Bioscience Tools</td><td>TC-1100S</td><td></td></tr><tr><td>FAM/GFP cubo filtrante</td> Set <td>di filtri Zeiss</td><td>38 (000000-1031-346)</td><td>eccitazione BP 470/40 nm, emissione BP 520/50 nm</td></tr><tr><td>cubo filtrante HEX</td><td>Chroma</td><td>49014</td><td>eccitazione BP 530/30 nm, emissione BP 575/40 nm</td></tr><tr><td>Taglierina laser</td><td>Rete dell'incisore</td><td>VLS3.60</td><td></td></tr><tr><td>1/8" acrilico nero</td><td>McMaster Carr</td><td>8505K113</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm acrilico trasparente</td><td>McMaster Carr</td><td>PD-72268940&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Super colla</td><td>Ufficio Depot</td><td>Duro super colla&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale di grado PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8662-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Analisi</td><td></td><td></td><td></td>dei dati</tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATLAB MATLAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>script: "JoVE_qRPA_standard_curve.m"</td><td>Incluso nello script SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_qRPA_validation_and_quantification.m"</td><td>Incluso nello script SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB: "JoVE_real_time_intensity_to_excel.m"</td><td>Incluso in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_well.ai</td><td>Incluso in SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_qRPA_base.ai</td><td>Incluso nel software SI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JoVE_AxioVision_Script.ziscript</td><td>Incluso in SI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sviluppo di un quantitative ricombinasi polymerase amplificazione assay con un controllo positivo interno

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

È stato recentemente dimostrato che l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA), una piattaforma di amplificazione isotermica per il rilevamento di agenti patogeni, può essere utilizzata per quantificare la concentrazione del campione di DNA utilizzando una curva standard. In questo manoscritto viene fornito un protocollo dettagliato per lo sviluppo e l'implementazione di un saggio di amplificazione quantitativa della polimerasi ricombinasi in tempo reale (saggio qRPA). Utilizzando la quantificazione del DNA dell'HIV-1 come esempio, vengono descritti l'assemblaggio delle reazioni RPA in tempo reale, la progettazione di una sequenza di controllo positivo interno (IPC) e la co-amplificazione dell'IPC e del target di interesse. Vengono fornite istruzioni e script di elaborazione dei dati per la costruzione di una curva standard utilizzando i dati di più esperimenti, che possono essere utilizzati per prevedere la concentrazione di campioni sconosciuti o valutare le prestazioni del saggio. Infine, viene descritto un metodo alternativo per la raccolta di dati di fluorescenza in tempo reale con un microscopio e un riscaldatore da tavolino come passo verso lo sviluppo di un test qRPA point-of-care. Il protocollo e gli script forniti possono essere utilizzati per lo sviluppo di un test qRPA per qualsiasi bersaglio di DNA di interesse.

Prima di selezionare una sequenza di servire come IPC negli esperimenti qRPA con l&#39;obiettivo (HIV-1) DNA, controllo interno positivo (IPC) i candidati sono generati e screening per la loro capacità di amplificare in reazioni qRPA senza HIV-1 DNA presente. Candidati IPC sono più lunghi rispetto al target (HIV-1) DNA per prevenire la formazione IPC da fuori competizione HIV-1 formazione amplicon. Come mostrato in Figura 2A, la generazione di due C. candidati parvum IPC sono stati ver...

Provided è un protocollo per lo sviluppo di un test di amplificazione della polimerasi ricombinasi in tempo reale per quantificare la concentrazione iniziale di campioni di DNA utilizzando un termociclatore o un microscopio e un riscaldatore per tavolini. Viene anche descritto lo sviluppo di un controllo positivo interno. Vengono forniti script per l'elaborazione di dati grezzi di fluorescenza in tempo reale.

Sviluppo di un Quantitative ricombinasi Polymerase Amplificazione Assay con un controllo positivo interno

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare la polimerizzazione con ricombinasi quantitativa per quantificare la concentrazione di DNA in campioni sconosciuti. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo al reazione il controllo interno positivo di DNA bersaglio, i primer di DNA e le sonde marcate con fluorocromo. Come secondo passaggio, le reazioni vengono collocate nel termociclatore in tempo reale, che riscalda le reazioni per attivare gli enzimi e monitora la fluorescenza delle sonde per rilevare la generazione di ampliconi bersaglio e di controllo.Successivamente, i dati fluorescenti vengono analizzati mediante uno script per generare la curva standard e per convalidare il saggio. I risultati mostrano che i campioni di DNA possono essere quantificati con precisione entro un ordine di grandezza della concentrazione corretta, basandosi sugli esperimenti di convalida utilizzati per quantificare un DNA bersaglio dell'HIV. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la PCR quantitativa in tempo reale, è che la RPA è isoterma, pertanto non richiede un termociclatore costoso.RPA richiede anche una temperatura di amplificazione più bassa, è tollerante a campioni sporchi, amplifica il bersaglio a livelli rilevabili entro pochi minuti e utilizza enzimi liofilizzati che consentono un facile trasporto e stoccaggio a temperatura ambiente. Per iniziare, pulire tutte le superfici del bancone e delle attrezzature con una soluzione al 50% di candeggina per creare un'area di lavoro pulita prima dell'amplificazione; prelevare la soluzione di acetato di magnesio 280 millimolare, il buffer di reidratazione e i pellet di reazione dal congelatore a -20 gradi Celsius e lasciare scongelare le soluzioni a temperatura ambiente. Quindi assemblare un mix master trasferendo 383,5 microlitri di buffer di reidratazione in un nuovo tubo microcentrifuga, aggiungendo 41,6 microlitri di acqua priva di nucleasi al buffer e vortexando per mescolare; aggiungere inoltre 35 microlitri di acetato di magnesio in un tubo separato.Riportare l'acetato di magnesio delle soluzioni stock del buffer di reidratazione nel congelatore. Successivamente, prelevare il primer e la sonda dal refrigeratore a quattro gradi Celsius. Posizionarli nell'area di preamplificazione e spegnere le luci per minimizzare l'esposizione alla luce; aggiungere 27,3 microlitri di ciascuno dei primer forward e reverse a 10 micromolari al mix master.Successivamente, aggiungere 7,8 microlitri della sonda per HIV-1 etichettata con esamero (10 micromolare) al mix master e vortexare il tubo. Quindi riporre le soluzioni stock di primer e sonda nel congelatore; i reagenti per il controllo interno positivo possono essere aggiunti in questo punto come indicato nel protocollo testuale per assemblare le reazioni di QRPA. Prima di tutto, inserire i pellet enzimatici liofilizzati in tubi individuali di strip PCR a otto pozzetti con profilo basso, quindi pipettare 37,5 microlitri del mix master in un tubo contenente un pellet.Mescolare delicatamente il contenuto del tubo con la punta della pipetta per sciogliere il pellet senza formare bolle. Rimuovere con attenzione la punta dalla reazione per evitare perdite di volume e assicurarsi di cambiare le punte della pipetta tra un tubo e l'altro. Trasferire i tubi su un blocco freddo da 96 pozzetti refrigerato per almeno cinque minuti per raffreddare il master mix.Nel frattempo, caricare il software del termociclatore con il protocollo e la disposizione della piastra indicata nel protocollo testuale. Successivamente, tagliare due strisce di adesivi sigillanti trasparenti per micropiastre in modo che siano leggermente più larghe dei tubi PCR. Inoltre, procurarsi due tappi piatti per strip di tubi PCR ed aliquote il template plasmidico HIV uno come indicato nel protocollo testuale.E quindi aggiungere 10 microlitri del template al tubo PCR appropriato. Ancora una volta, mescolare delicatamente la miscela con la punta della pipetta. Successivamente, aggiungere 2,5 microlitri di acetato di magnesio su ogni cappuccio del tubo, quindi posizionare delicatamente i cappucci sopra i tubi di reazione in modo che non siano completamente sigillati.L'acetato di magnesio deve essere chiaramente visibile attraverso il tappo. Posizionare le strisce di provette PCR in una microcentrifuga e centrifugare le provette per 10 secondi per raccogliere tutto il liquido sul fondo della provetta ed eliminare eventuali bolle d'aria. La combinazione della soluzione di acetato di magnesio con il master mix avvia la reazione di QRPA.Rimuovere rapidamente le provette PCR sul blocco freddo per arrestare la reazione. Successivamente, rimuovere lentamente i coperchi per evitare contaminazioni e sigillare le provette con un film sigillante micros trasparente. Trasferire le provette nel termociclatore secondo le posizioni indicate nel layout della piastra.Chiudere il coperchio del termociclatore e fare clic su avvia esecuzione. Assicurarsi di assegnare un nome al file per l'esperimento al termine dell'esecuzione. Visualizzare i dati grezzi di fluorescenza ed esportarli in un foglio di calcolo, il quale creerà un file denominato risultati di amplificazione per la quantificazione.Per costruire la curva standard. Innanzitutto, scaricare lo script per la curva standard, quindi aprire MATLAB o un programma simile per l'analisi dati. Aprire lo script e premere esegui per avviare lo script.Digiti il numero di file di dati da analizzare quando richiesto. Successivamente, digiti il numero di campioni e il numero di replicati in ciascun file di addestramento nella finestra dei comandi.Digitare la concentrazione minima di DNA in copie basate su logaritmo in base 10 utilizzata per costruire la curva standard e premere invio. Nell'esempio mostrato qui, la concentrazione minima è di una copia basata su logaritmo in base 10.Quindi digitare la differenza di concentrazione tra ciascuno standard di DNA nel prompt dei comandi e premere invio qui. L'intervallo di concentrazione è di un logaritmo in base 10 di copie. Successivamente, inserire il valore della soglia della pendenza nella finestra dei comandi e premere invio.Questo valore è tipicamente compreso tra tre e cinque. Digitare il numero di deviazioni standard al di sopra dello sfondo per la soglia positiva, nota anche come Z, quindi premere invio; i valori tipici di Z variano da uno a cinque. Successivamente, specificare l'equipaggiamento utilizzato per raccogliere i dati in questo caso.Digitare uno per il termociclatore, quindi premere invio. Se è presente un controllo positivo interno, selezionare il valore predefinito o un nuovo valore per la soglia digitando S o N a seconda che sia necessaria una nuova soglia. Infine, selezionare tutti i file di foglio di calcolo che verranno utilizzati per costruire la curva standard.Lo script importerà ed analizzerà automaticamente tutti i dati. La QRPA in tempo reale è stata eseguita su campioni duplicati contenenti diversi numeri di copie di HIV 1D NA. L'inizio dell'amplificazione rilevabile, indicato da un aumento della fluorescenza, si verifica prima nei campioni con un numero maggiore di copie di DNA rispetto ai campioni con un numero minore di copie. I dati grezzi di fluorescenza sono stati utilizzati per generare una curva standard a partire dall'amplificazione di concentrazioni note di HIV 1D NA. Questi dati sono stati adattati a una curva esponenziale, e il valore di R quadrato indica un'elevata bontà di adattamento.La curva standard è stata utilizzata per prevedere le concentrazioni di ulteriori campioni di DNA di concentrazione nota. L'aggiustamento del valore di Z a uno consente una previsione accurata di basse concentrazioni di DNA. Al contrario, alte concentrazioni di DNA sono meglio previste con un valore di Z pari a cinque.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che la RPA non possiede veri cicli per limitare la velocità di amplificazione del DNA. Pertanto, la velocità di amplificazione deve essere controllata con precisione. La coerenza tra esperimenti è fondamentale, quindi assicurarsi di utilizzare gli stessi aliquote di primer per tutti gli esperimenti.Proteggere i componenti della reazione da calore e luce. Aggiungere l'acetato di magnesio immediatamente prima dell'inizio della raccolta dati e mantenere le reazioni nel blocco refrigerato fino al momento dell'avvio. L'esperimento.

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Un poco costoso, metodo throughput elevato per il rilevamento simultaneo di fino a 43 bersagli molecolari è descritto. Applicazioni di MPCR / RLB comprendono digitando microbica e la rilevazione di agenti patogeni multipli da campioni clinici.

PCR multiplex e Reverse Blot Assay Linea Hybridization (MPCR / RLB)

Lo studio descrive un metodo conveniente per l'identificazione della fonte di contaminazione fecale / urina o la contaminazione da nitrati in acqua utilizzando qPCR per la quantificazione specifica di virus DNA umano / suini / bovini, adenovirus e poliomavirus, proposti come strumenti di MST.

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In questo video, dimostriamo la tecnica della PCR digitale duplex (ddPCR), una modifica della tradizionale tecnica PCR utile per rilevare contemporaneamente due diversi marcatori genetici. Una singola reazione PCR viene suddivisa in goccioline emulsionate di dimensioni nanolitrometriche che vengono amplificate in modo indipendente e il rilevamento di segnali di amplificazione della fluorescenza di colore diverso dalla frazione di goccioline viene utilizzato per calcolare la concentrazione...

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Qui, descriviamo un metodo per la quantificazione simultanea dei circoli di escissione del recettore delle cellule T (TREC) e dei circoli di escissione di ricombinazione con eliminazione K (KREC). Il test TREC/KREC può essere utilizzato come marcatore della produzione di timo e midollo osseo.

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Qui, presentiamo un protocollo per lo sviluppo e la convalida di un metodo PCR quantitativo utilizzato per la rilevazione e la quantificazione del DNA EHV-2 nei fluidi respiratori equini. Il protocollo di validazione EHV-2 qRT-PCR prevede una procedura in tre parti: sviluppo, caratterizzazione del solo test qRT-PCR e caratterizzazione dell'intero metodo analitico.

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Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

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Questo manoscritto descrive la procedura sperimentale e l'analisi del software per un test di sito di integrazione bidirezionale che può contemporaneamente analizzare il DNA di giunzione vettoriale-host a monte ea valle. I prodotti bidirezionali di PCR possono essere usati per qualsiasi piattaforma di sequencing a valle. I dati risultanti sono utili per un confronto quantitativo e ad alto rendimento dei target integrati del DNA.

Sistema di integrazione bidirezionale retrovirale Metodo PCR e flusso di lavoro analitico dei dati quantitativi

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