Metodo ad alto rendimento per l'osservazione dei fenotipi di motilità in Pseudomonas aeruginosa

La nostra ricerca si concentra sulla comprensione di come i batteri agiscono e causano infezioni utilizzando la biologia dei sistemi e la genomica. Il nostro obiettivo è identificare i geni che influenzano la fisiologia batterica in condizioni che imitano l'ambiente infezionale, al fine di trovare nuovi bersagli per sviluppare antibiotici migliori e trattamenti alternativi. Abbiamo sviluppato un protocollo ad alta produttività per identificare i fattori genetici che influenzano la motilità di Pseudomonas aeruginosa, consentendo un'analisi genomica a livello genomico dei comportamenti di sciame e spasmi. Questa iniziativa di ricerca ha scoperto meccanismi molecolari che guidano la motilità e che contribuiscono anche alla formazione, colonizzazione e evasione della difesa dell'ospite.

È adattabile a diversi saggi e specie batteriche. Per cominciare, prendi le lastre sorgente della biblioteca di mutanti trasposoni di Pseudomonas aeruginosa e lasciale piatte su una superficie a temperatura ambiente per circa un'ora per raffreddarle. Per il test desiderato, seleziona piastre M9 glucosio 0,5% agar per lo sciame e piastre LB agar 1% per i spasmi.

Per configurare il replicatore per un trasferimento accurato della colonia, accendi il replicatore. Nella sezione modalità seleziona e opera, scegli seleziona ed esegui i programmi memorizzati. Nella sezione seleziona targhe sorgente, seleziona più tavola 384 agar.

Poi, nella sezione seleziona piastra target, seleziona più piastra 384 agar. Nella sezione seleziona pad, seleziona pin breve 384. Nei programmi di cantante, seleziona replica molti, poi vai a replica opzioni di programma e scegli generale, ricicla e nessuno.

Nella fonte della sezione, seleziona offset, poi casuale e raggio predefinito. Nel target di sezione, seleziona pinning e regola la pressione al 2%. Lascia tutte le altre impostazioni predefinite. Poi, inserisci il corto perno RePads 384 nel compartimento appropriato.

Posizionare la sorgente e le piastre target sulla piattaforma designata del replicatore. Posiziona le piastre sorgente a densità 384 e le piastre di motilità vuote sulla piattaforma. Premi run usando i parametri selezionati per iniziare il processo di trasferimento.

Il robot di pinning dell'array microbico trasferirà le colonie dalle piastre sorgente a densità 384 alle piastre di motilità. Successivamente, inserisci le piastre di motilità inoculate in sacchetti di plastica. Posiziona con cura i sacchetti contenenti i piatti nell'incubatrice, impostati a 37 gradi Celsius per 18 ore.

Dopo il periodo di incubazione, cattura immagini ad alta risoluzione delle placche di motilità utilizzando qualsiasi software di imaging di alta qualità. Dopo aver eseguito il test di motilità e aver immaginato le piastre di motilità, esegui il macro in ImageJ. Apri la cartella contenente le immagini per caricare il batch per l'analisi.

Quando richiesto, modifica l'angolo usando l'opzione di anteprima finché la piastra non è dritta per regolare la rotazione della piastra stessa. Quando sei soddisfatto, clicca sul pulsante ok. Poi, sposta lo strumento rettangolare intorno alle colonie per ritagliare la parte della piastra che contiene le colonie.

Quando sei pronto, clicca su ok per completare il ritaglio. Definisci la griglia utilizzata per disegnare la regione di interesse, o ROI, attorno a ogni colonia e misura l'area di motilità. Seleziona la densità di colonie appropriata e regola i parametri secondo necessità per assicurare che ogni cerchio sia posizionato attorno a una colonia.

Quando sei pronto, attiva la casella ok e clicca sul pulsante ok. L'area di motilità di ogni colonia sarà misurata e un file CSV contenente i dati verrà salvato nella cartella designata. Per il test di motilità, si utilizza in autoclave una soluzione agar contenente M9, glucosio, casaminoacidi e solfato di magnesio.

Versa 25 millilitri di agar raffreddato e miscelato in ogni piastra di Petri. Successivamente, inoculare ogni piastra con 2,5 microlitri di coltura batterica notturna e incubare a 37 gradi Celsius per 18 ore con i coperchi rivolti verso l'alto per osservare i fenotipi di motilità. Dopo aver autoclavato una soluzione di LB con 1% di agar, versare 25 millilitri di LB raffreddato e miscelato 1%agar nelle piastre di Petri.

Infilza i batteri inoculati sul fondo delle placche a contrazione contenenti l'1% di agar. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 48 ore, poi a temperatura ambiente per altre 48 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura l'agar dalle placche.

Visualizza la zona di contrazione tingendo la piastra di Petri con una soluzione di viola cristallina all'1%. Il test di motilità a contrazioni ha mostrato che i mutanti di Pseudomonas aeruginosa con delezioni geniche della macchina T4P presentavano regioni aureogeniche significativamente più piccole rispetto al tipo selvatico, indicando una ridotta motilità di contrazione. L'analisi della motilità dello sciame ha rivelato che i mutanti di delezione della libreria PA14 avevano regioni alomatiche significativamente ridotte senza protuberanze, confermando la capacità difettosa di sciame.

Gli studi sulla motilità batterica sono spesso limitati dalla loro capacità di produzione. Il nostro protocollo di motilità ad alta produttività aiuterà i ricercatori a studiare la motilità batterica in modo completo. Ad esempio, utilizzando una collezione di mutanti a livello genomico, diventa possibile identificare tutti i geni collegati alla motilità e rivelare come i batteri causano infezioni.

I nostri risultati sollevano nuove domande sul controllo genetico della motilità in Pseudomonas aeruginosa, sul suo ruolo nella formazione dei biofilm e sulla sua connessione con la patogenesi. Aiutano inoltre nell'esplorazione di come le condizioni ambientali influenzino i comportamenti di motilità e se il targeting dei geni di motilità possa portare a terapie antimicrobiche innovative.