Identificazione e classificazione delle varianti missenso della subunità del recettore GABA_A posizionate per il loro ruolo nei neuroni piramidali dell'ippocampo

Il nostro studio si basa sull'idea che le mutazioni epilettogene e prossimali nelle subunità del recettore GABA-A possano influenzare in modo simile il modello di neurone piramidale CA1. Esploriamo questo aspetto attraverso un framework multiscala. Gli esperimenti di laboratorio sono essenziali per scoprire la verità, ma non possono catturare completamente la diversità e la complessità della vita a tutte le scale, dalle molecole agli organismi. Ci sono troppe possibilità, questo è il problema.

Il nostro protocollo e i nostri risultati hanno aperto la strada a un ambiente computazionale che può essere utilizzato per esplorare l'impatto dei polimorfismi, come i polimorfismi delle subunità del recettore GABA-A sulla funzione neurale.

Il nostro studio solleva nuove domande riguardo alla misura in cui le varianti patogene previste e le mutazioni epilettogene mostrano proprietà simili e come queste relazioni possono essere efficacemente catturate e simulate.

La nostra attenzione attuale è sulla funzione del microcircuito corteccia entorinale-ippocampo. Studieremo modelli animali in vivo e modelli computazionali di microcircuiti per esplorare il controllo del setto nasale su questo circuito, in particolare nei disturbi neuropsichiatrici.

[Narratore] Per iniziare, apri il file Excel originale contenente i dati genetici e rimuovi le colonne non necessarie dal file, lasciando solo quattro colonne, GRCh38Chromosome, GRCh38Location, Name e Protein change, prima di salvare il file come data1.xlsx nella directory di lavoro relativa al software R. Per ulteriori operazioni di pulizia e formattazione dei dati, aprire il software R e RStudio. Quindi, apri lo script R Data_GABAA R. Imposta la directory di lavoro e carica le librerie necessarie facendo clic sul pulsante Esegui. Caricare il file di dati e avviare la pulizia dei dati per le colonne che richiedono questo processo. Pulisci e combina ulteriormente i dati in un'unica colonna, separati da un unico spazio. Crea un nuovo frame di dati per l'output combinato e aggiungi l'ID della variante della trascrizione dell'ensemble desiderato. Scrivi il risultato in un nuovo file Excel chiamato data1output.xlsx. Per costruire un modello biofisico di una sinapsi GABAergica su un neurone piramidale ippocampale basato su conduttanza multicompartimentale, installare Brian 2 e importare i pacchetti richiesti. Progetta il modello basato sulla conduttanza definendo la cinetica di gating dei canali ionici, i parametri passivi e attivi e le conduttanze postsinaptiche. Utilizzare le conduttanze modificate di tipo Hodgkin-Huxley per i neuroni piramidali dell'ippocampo. Regola la distribuzione della densità dei canali del sodio voltaggio-dipendenti per soma, segmento iniziale dell'assone, nodi di Ranvier e dendriti. Impostare le conduttanze dei canali del sodio e del potassio su zero nei segmenti mielinizzati. Cinetica di gating dei canali ionici integrati per canali del sodio e del potassio voltaggio-dipendenti. Introdurre le correnti sinaptiche come somma di tutte le sinapsi glutammatergiche e GABAergiche in un compartimento. Includere sia la corrente veloce mediata dal recettore AMPA che la corrente lenta mediata dal recettore NMDA nella corrente glutammatergica. Includere solo la corrente veloce mediata dal recettore GABA nella corrente GABAergica. Supponiamo che una quantità costante di glutammato venga rilasciata alla sinapsi per ogni picco presinaptico. Pertanto, l'attivazione dei recettori è dipendente dal tempo di picco e le conduttanze totali dei recettori, G-AMPA e G-NMDA, riflettono la quantità di glutammato che viene rilasciata da ogni evento. Imposta i parametri morfologici utilizzando il diametro misurato sperimentalmente per soma e neuriti e la lunghezza di ciascun compartimento neuritico e i modelli di ramificazione. Ridurre la morfologia del neurone reale in un modello multicompartimentale dividendo la cellula in più compartimenti che preservano accuratamente la struttura ramificata principale e mantengono la simmetria bilaterale. Determinare i parametri biofisici per il modello di sinapsi GABAergica valutando le misure di controllo wild-type ottenute in precedenza e importandole per utilizzarle nel modello. Definire le costanti di tempo di salita e disattivazione per la corrente post-sinaptica mediata dal recettore GABA-A. Progettare la topologia del modello neuronale e assegnare parametri morfologici e biofisici, che includono la specifica della disposizione spaziale e delle interconnessioni dei compartimenti in base alle informazioni morfologiche e ramificate precedentemente ottenute. Assegna i parametri morfologici appropriati, come la lunghezza e il diametro del segmento, e i parametri biofisici a ciascun compartimento del modello. Creare l'attività presinaptica utilizzando SpikeGeneratorGroup. Collegare il generatore di spike al compartimento target del neurone modello utilizzando la classe Synapses per modellare le connessioni sinaptiche. Impostare una corrente costante sostenuta di 0,85 nano-Ampere e posizionare l'elettrodo sul soma per imitare l'attività sottosoglia guidata dal carico di corrente ionica di base in un dato momento. Per creare monitor di registrazione, registrare le tracce di tensione dai compartimenti di destinazione utilizzando StateMonitor. Infine, costruisci la rete ed eseguila. I treni di spike neuronali sotto singolo input glutammatergico distale e inibizione GABAergica somatica hanno rivelato gli esiti di attivazione dei recettori GABA-A wild-type e mutanti. La mutazione beta-3N110D ha alterato l'inibizione causando l'attivazione dei neuroni per agganciarsi all'input eccitatorio di Glu-S1 dopo il quarto picco presinaptico, con un breve ritardo post-sinaptico. La mutazione gamma-2K328M ha anche compromesso l'inibizione con l'attivazione dei neuroni che si verifica intorno al quinto picco di Glu-S1 e con un ritardo post-sinaptico più lungo rispetto a beta-3N110D. In presenza di doppio input sinaptico, la mutazione gamma-2P302L ha causato un'attivazione quasi sincronizzata con l'input apicale mediale di Glu-S2, probabilmente riflettendo la somma ritardata da Glu-S1. La mutazione beta-3T288N ha mostrato un modello simile con punte allineate agli input di Glu-S2 e una seconda spike che appare in quasi sincronia. La mutazione beta-3N110D in condizioni di doppio input ha innescato picchi per quasi tutti gli input eccitatori tranne i primi due, con intervalli tra i picchi notevolmente ridotti. Il mutante gamma-2K328M ha mostrato un modello di attivazione simile, ma non è riuscito a rispondere al secondo e al terzo input eccitatori. In condizioni di input a tripla eccitazione, sia i mutanti beta-3N110D che gamma-2K328M hanno risposto a quasi tutti i picchi presinaptici, attivando coppie di picchi in risposta all'impulso eccitatorio cumulativo.