Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello

L'obiettivo generale di questa tecnica di soffio è quello di condurre la somministrazione farmacologica nella registrazione di patch-clamp a cellula intera. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'elettrofisiologia, come la somministrazione farmacologica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la concentrazione del farmaco intorno al sito di registrazione aumenta rapidamente, impedendo così la desensibilizzazione dei recettori di membrana.

In generale, l'individuo nuovo a questo metodo avrà difficoltà perché la preparazione della fetta acuta della corteccia prefrontale e la posizione della micropipetta a sbuffo sono relativamente difficili. Per iniziare questa procedura, schiacciare la soluzione di taglio congelata per ottenere una granita. Conserva la soluzione fangosa sul ghiaccio e fai bollire con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica.

Quindi, posizionare la testa sezionata in un becher riempito con una soluzione di taglio ghiacciata ed estrarla dopo alcuni secondi. Taglia il cranio lungo la linea mediana in direzione caudale-rostrale con le forbici sottili e rimuovi le porzioni laterali del cranio. Quindi, rimuovi il cervello con una spatola fine e immergilo nella soluzione di taglio ghiacciata.

Successivamente, posiziona il cervello sul coperchio di una capsula di Petri di nove centimetri piena di ghiaccio. Sciacquare il cervello con una soluzione da taglio ghiacciata. Quindi, taglia il cervelletto e il bulbo olfattivo con una lama di rasoio.

Successivamente, applicare la colla cianoacrilica sul portacampioni Vibratome. Posiziona con cura il blocco cerebrale sulla goccia di colla, con il lato rostrale rivolto verso l'alto, e immergilo immediatamente nella soluzione di taglio ghiacciata. Regolare il portalama su un angolo di 15 gradi rispetto al piano orizzontale.

Sezionare i tessuti cerebrali in fette coronali di 350 micron. Quindi, trasferire i vetrini nella camera di recupero riempita con ACSF e incubarli per un'ora con gorgogliamento costante di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%. Nel nostro esperimento, anche la preparazione della fetta acuta della corteccia prefrontale è fondamentale nella procedura.

Una fetta di cervello sana significa neuroni attivi che possono essere rattoppati strettamente. In questa procedura, realizzare micropipette in borosilicato di vetro da utilizzare come elettrodi di registrazione o micropipette a sbuffo. Per la registrazione degli elettrodi, le resistenze della punta sono comprese tra quattro e sei megaohm, mentre le micropipette a soffio hanno diametri della punta compresi tra due e cinque micrometri.

Aggiungere il bloccante dei canali del sodio all'ACSF per bloccare il canale del sodio veloce e quindi i potenziali d'azione, e mantenere una portata costante di questa soluzione di due o tre millilitri al minuto nella camera di registrazione. Far bollire costantemente l'ACSF con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica per garantire la vitalità delle fette. Trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione, utilizzando una pipetta Pasteur con la punta sottile tagliata per adattarsi alle dimensioni della fetta.

Quindi, posiziona un'ancora di platino sopra la fetta per tenerla sulla piattaforma. Successivamente, riempire le micropipette di registrazione con la soluzione interna e riempire le micropipette a sbuffo con GABA a 10 micromolari, 50 micromolari e 100 micromolari, o ACSF come controllo del veicolo. Per evitare l'ostruzione con detriti, applicare una leggera pressione positiva utilizzando una siringa da un millilitro prima di immergere l'elettrodo di registrazione nell'ACSF.

Al microscopio, posizionare l'elettrodo di registrazione e la micropipetta a sbuffo in modo che le punte appaiano al centro del monitor. Quindi, identifica un neurone bersaglio. Regolare la messa a fuoco del microscopio abbassando gradualmente la micropipetta a sbuffo e posizionarla sopra il neurone di registrazione con un angolo di 45 gradi.

Mantenere la distanza tra la punta della micropipetta a sbuffo e il neurone bersaglio nell'intervallo da 20 a 40 micrometri. Avvicinarsi lentamente e con attenzione al neurone con l'elettrodo di registrazione, quindi rilasciare la pressione positiva. Applicare un'aspirazione debole e breve attraverso il tubo collegato al portaelettrodo per creare una tenuta gigaohm.

Mantenere la tensione a zero millivolt. Dopo la formazione della guarnizione gigaohm, compensare la capacità veloce e lenta manualmente o automaticamente. Quindi, applicare una breve e forte aspirazione attraverso il tubo per entrare nella modalità a cella intera.

Successivamente, registrare le correnti IPSC evocate in modalità voltage clamp. Eroga sbuffi GABA singoli o accoppiati attraverso la micropipetta a sbuffo controllata da un generatore di passi di tensione Master-8. Modificare la durata del soffio per ottenere i migliori risultati delle correnti IPSC evocate e misurare le correnti IPSC evocate nel modello di depressione indotta da LPS.

Qui sono mostrati i campioni di IPSC indotti da GABA 10, 50 e 100 micromolari. Ed ecco le curve di risposta della durata del soffio. Qui sono mostrate le correnti ripetitive evocate dal GABA a 50 sbuffi micromolari a intervalli di uno, due o tre secondi.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottenere fette di cervello sane. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della somministrazione farmacologica per esplorare l'effetto del farmaco in elettrofisiologia.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre la somministrazione farmacologica nella registrazione del patch-clamp a cellula intera. Non dimenticare che lavorare con TTX può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni, come indossare i guanti.