Name: Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende limaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Scopri un metodo di fotoirradiazione a basso costo per ridurre l'autofluorescenza nei tessuti umani e preservare i segnali anticorpali. Questa tecnica consente l'imaging multiplex di campioni clinici archiviati per l'analisi spaziale delle cellule immunitarie.

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<ol><li>Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1</a> (2023).</li>
<li>Dahl, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trends+of+pulmonary+infections+with+nontuberculous+mycobacteria%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review.</a> Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2022).</li>
<li>Cadena, A. M., Fortune, S. M., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in tuberculosis.</a> Nat Rev Immunol. 17 (11), 691-702 (2017).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibex%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibex%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mapping+of+protein+composition+and+tissue+organization%3A+A+primer+for+multiplexed+antibody-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial mapping of protein composition and tissue organization: A primer for multiplexed antibody-based imaging.</a> Nat Methods. 19 (3), 284-295 (2022).</li>
<li>Duong, H., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multispectral+led+array+for+the+reduction+of+background+autofluorescence+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A multispectral led array for the reduction of background autofluorescence in brain tissue.</a> J Neurosci Methods. 220 (1), 46-54 (2013).</li>
<li>Nolta, N. F., Liberti, A., Makol, R., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin+embedding+and+LED+autofluorescence+reduction+for+rodent+spinal+cord+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Gelatin embedding and LED autofluorescence reduction for rodent spinal cord histology.</a> J Neurosci Methods. 346, 108924(2020).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omic+profiling+of+follicular+lymphoma+reveals+changes+in+tissue+architecture+and+enhanced+stromal+remodeling+in+high-risk+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients.</a> Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IBEX+knowledge-base%3A+A+central+resource+for+multiplexed+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The IBEX knowledge-base: A central resource for multiplexed imaging techniques.</a> PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).</li>
<li>Yaniv, Z., et al. The IBEX imaging knowledge-base: A community resource enabling adoption and development of immunofluoresence imaging methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaniv%2C+Z+%22ArXiv%22">ArXiv</a>. , (2024).</li>
<li>Quardokus, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+mapping+antibody+panels%3A+A+community+resource+for+standardized+multiplexed+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Organ mapping antibody panels: A community resource for standardized multiplexed tissue imaging.</a> Nat Methods. 20 (8), 1174-1178 (2023).</li>
<li>Mcshane, P. J., Glassroth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+disease+due+to+nontuberculous+mycobacteria%3A+Current+state+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria: Current state and new insights.</a> Chest. 148 (6), 1517-1527 (2015).</li>
<li>Hsu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GATA2+are+associated+with+the+autosomal+dominant+and+sporadic+monocytopenia+and+mycobacterial+infection+%28monomac%29+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mutations in GATA2 are associated with the autosomal dominant and sporadic monocytopenia and mycobacterial infection (monomac) syndrome.</a> Blood. 118 (10), 2653-2655 (2011).</li>
<li>Vinh, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autosomal+dominant+and+sporadic+monocytopenia+with+susceptibility+to+mycobacteria%2C+fungi%2C+papillomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Autosomal dominant and sporadic monocytopenia with susceptibility to mycobacteria, fungi, papillomaviruses.</a> Blood. 115 (8), 1519-1529 (2010).</li>
<li>Filipe-Santos, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+susceptibility+to+mycobacteria+is+caused+by+mutations+in+nemo+impairing+CD40-dependent+IL-12+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">X-linked susceptibility to mycobacteria is caused by mutations in nemo impairing CD40-dependent IL-12 production.</a> J Exp Med. 203 (7), 1745-1759 (2006).</li>
<li>Galeotti, T., Van Rossum, G. D., Mayer, D. H., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+fluorescence+of+NAD%28P%29H+in+whole-cell+preparations+of+tumours+and+normal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">On the fluorescence of NAD(P)H in whole-cell preparations of tumours and normal tissues.</a> Eur J Biochem. 17 (3), 485-496 (1970).</li>
<li>Schneckenburger, H., Gessler, P., Pavenstadt-Grupp, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+mitochondrial+deficiencies+in+living+cells+by+microspectrofluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Measurements of mitochondrial deficiencies in living cells by microspectrofluorometry.</a> J Histochem Cytochem. 40 (10), 1573-1578 (1992).</li>
<li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+ceroid+formation%3A+The+cellular+recycling+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and ceroid formation: The cellular recycling system.</a> Adv Exp Med Biol. 266, 3-15 (1989).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Mechanisms+of+age-related+accumulation+and+influence+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Mechanisms of age-related accumulation and influence on cell function.</a> Free Radic Biol Med. 33 (5), 611-619 (2002).</li>
<li>Jung, T., Bader, N., Grune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin%3A+Formation%2C+distribution%2C+and+metabolic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin: Formation, distribution, and metabolic consequences.</a> Ann N Y Acad Sci. 1119, 97-111 (2007).</li>
<li>Sherratt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+and+the+ageing+elastic+fibre%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity and the ageing elastic fibre.</a> Age (Dordr). 31 (4), 305-325 (2009).</li>
<li>Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+collagen%3A+More+than+scaffolding%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Lung collagen: More than scaffolding.</a> Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+frequency-domain+fluorescence+spectroscopy+and+applications+to+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes.</a> Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,3% Tritone-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Soluzione per il blocco del buffer</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice: A4503</td><td>Soluzione per il blocco del buffer</td></tr><tr><td>1% Blocco BD Fc umano</td><td>BD Bioscienze</td><td>564220</td><td>Blocco Fc necessario per il blocco del buffer</td></tr><tr><td>Lampada LED da 150 W</td><td>Amazzone</td><td>B07VH3CVSF</td><td>Sorgente luminosa a LED per fotoirraggiamento tissutale</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Soluzione per il blocco delle fasi di tampone e lavaggio</td></tr><tr><td>Contenitore di stoccaggio da 20 galloni</td><td>Amazzone</td><td>B001B1C4G0</td><td>Contenitore per il processo di fotoirraggiamento</td></tr><tr><td>Lampada LED RGBW da 40 W&nbsp;</td><td>Amazzone</td><td>B08QFPJSMD</td><td>Sorgente luminosa RGB per fotoirraggiamento tissutale</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Kit di blocco Avidin/Biotina</td><td>Abcam</td><td>ab64212</td><td>Soluzione bloccante di avidina e biotina</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Bioscienze</td><td>554714</td><td>Soluzione di fissaggio</td></tr><tr><td>Soluzione di decera BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221076</td><td>Soluzione di deparaffinazione</td></tr><tr><td>Soluzione per il recupero degli epitopi BOND 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235529</td><td>Soluzione di recupero dell'epitopo a base di citrato pH 6 (ER1)</td></tr><tr><td>Soluzione per il recupero degli epitopi BOND 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0235530</td><td>Soluzione per il recupero di epitopi a base di EDTA a pH 9 (ER2)</td></tr><tr><td>Sistema di rilevamento BOND Research</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0396648</td><td>Reagente di colorazione per ricerca automatizzato</td></tr><tr><td>Coloratore di ricerca BOND RX</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td>Piattaforma automatizzata di colorazione per la ricerca</td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio BOND</td><td>Leica Biosystems</td><td>NC0221077</td><td>Tampone di lavaggio</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Bioscienze</td><td>Codice 347420/AB_400298</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>50-0202-82/AB_11150959</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB8165G/AB_2728839</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>CD45 Ficoeritrina (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE/NA</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotecnologie</td><td>1064135/AB_2892745</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Asino anti-capra IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Asino anti-topo IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>A32787/ AB_2762830</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Asino anti-topo IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Sistema di colorazione EasyDip</td><td>Rifornimento per nuovi arrivati</td><td>5300KIT</td><td>Sistema di colorazione dei vetrini</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>00-4958-02</td><td>Supporti di montaggio</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biozio</td><td>40046</td><td>Colorazione nucleare per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Convertitore di file Imaris x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Strumenti</td><td></td><td>Convertitore di file gratuito</td></tr><tr><td>ImarisViewer software x64 10.2.0</td><td>Imaris Oxford Strumenti</td><td></td><td>Software gratuito per l'elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Penna ImmEdge</td><td>Laboratori Vector</td><td>H-4000</td><td>Penna barriera idrofobica</td></tr><tr><td>Boroidruro di litio (1 grammo)</td><td>Prodotti chimici STREM</td><td>93-0397</td><td>Sostanza chimica per l'inattivazione del colorante, acquistare piccole aliquote di questa sostanza chimica (1 grammo)</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& Sistemi D</td><td>BAF2846</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Occhiali Micro Cover</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td>Coperture per vetrini</td></tr><tr><td>Pan-citocheratina Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750/AB_2868569</td><td>Anticorpo per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Sistema a microonde PELCO BioWave Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>36500-230</td><td>Microonde scientifico non riscaldante</td></tr><tr><td>PELCO SteadyTemp Pro</td><td>Ted Pella Inc</td><td>50062</td><td>Controllo della temperatura completamente automatizzato per microonde scientifiche</td></tr><tr><td>SimpleITK</td><td>Software open source</td><td></td><td>Software di registrazione ed elaborazione dei canali</td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Episodio 11227</td><td>Reagente di marcatura per imaging IBEX. Vedere la tabella 1.</td></tr><tr><td>Microscopio a campo largo</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Microsystems THUNDER imager con sorgente luminosa LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Per l'imaging a fluorescenza, è stato utilizzato un filtro quad-band personalizzato con ruota portafiltri esterna (PN: 11536075) con due filtri a banda singola aggiuntivi (PN: 8118215) per visualizzare sette canali di colorante per passaggio. Le linee di eccitazione, dicroica ed emissione del filtro sono (1) cubo Quad-Band: dicroico a 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, senza filtri di eccitazione o di emissione; (2) ruota portafiltri esterna posizione 1: 434/32, posizione 2: 520/40, posizione 3: 585/20, posizione 4: 720/60, posizione 5: passante; (3) 1 banda singola&mdash; 585/22 eccitazione, 594 dicroica, 625/30 emissione; (4) banda singola 2&mdash; 635/20 eccitazione, 647 dicroica, 667/30 emissione.</td></tr><tr><td>Zeiss Detergente per lenti ottiche</td><td>Amazzone</td><td>B00GPVQVCO</td><td>Detergente per lenti per obiettivi per microscopi</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Anticorpi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019</td><td>IgG policlonali di coniglio, ciclo 1</td></tr><tr><td>Alfa-actina muscolare liscia DyLight 755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R</td><td>1A4/asm-1, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB8165G</td><td>IgG policlonali di capra, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD8 Alexa Fluor 647</td><td>BioLeggenda</td><td>372906</td><td>C8/144B, ciclo 1</td></tr><tr><td>CD68 iFluor 594</td><td>Caprico Biotecnologie</td><td>1064135</td><td>KP1, ciclo 1</td></tr><tr><td>Asino anti-capra IgG Alexa Fluor Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Codice A32814</td><td>Asino policlonale, ciclo 1</td></tr><tr><td>Asino anti-topo IgG Alexa Fluor Plus AF647</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Codice: A32787</td><td>Asino policlonale, ciclo 1</td></tr><tr><td>Asino anti-coniglio IgG Alexa Fluor Plus AF555</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Codice: A32794</td><td>Asino policlonale, ciclo 1</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biozio</td><td>40046</td><td>Marcatura nucleare, ciclo 1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Bioscienze</td><td>347420</td><td>MMA, ciclo 2</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>50-0202-82</td><td>L26, ciclo 2</td></tr><tr><td>CD45 Ficoeritrina (PE)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>2B11 + PD7/26, ciclo 2</td></tr><tr><td>Asino anti-topo IgM Alexa Fluor 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020</td><td>Asino policlonale, ciclo 2</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& Sistemi D</td><td>BAF2846</td><td>IgG policlonali di capra, ciclo 2</td></tr><tr><td>Pan-citocheratina Alexa Fluor 750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>AE-1/AE-3, ciclo 2</td></tr><tr><td>Streptavidina Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Episodio 11227</td><td>N/D, ciclo 2</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biozio</td><td>40046</td><td>ciclo 2</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Soluzioni</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer (Ciclo 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritone-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,3% in volume</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Codice: A4503</td><td>1% in volume</td></tr><tr><td>Blocco Fc BD umano</td><td>BD Bioscienze</td><td>564220</td><td>1% in volume</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>97,7% in volume</td></tr><tr><td>Soluzione colorante per anticorpi primari #1 (Ciclo 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer di blocco (ciclo 1)</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Biozio</td><td>40046</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>CD8 AF647</td><td>BioLeggenda</td><td>372906</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Soluzione colorante con anticorpi primari #2 (Ciclo 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer di blocco (ciclo 1)</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi</td></tr><tr><td>CD4&nbsp; AF488</td><td>R& Sistemi D</td><td>FAB8165G</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Ag85B</td><td>Abcam</td><td>ab43019/NA</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Soluzione colorante con anticorpi secondari #1 (Ciclo 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer di blocco (ciclo 1)</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi</td></tr><tr><td>Asino Anti-Capra AF Plus 488</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>A32814/AB_2762838</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Asino anti-Coniglio AF Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>A32794/AB_2762834</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Asino anti-Topo AF Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>A32787/AB_2762830</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Soluzione colorante per anticorpi primari #3 (Ciclo 1)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer di blocco (ciclo 1)</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi</td></tr><tr><td>CD68 iF594</td><td>Caprico Biotecnologie</td><td>1064135</td><td>1:10</td></tr><tr><td>a-SMA DL755</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-345221R/NA</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Tampone di blocco senza BSA (ciclo 2)&nbsp; </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritone-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>0,3% in volume</td></tr><tr><td>Blocco Fc BD umano</td><td>BD Bioscienze</td><td>564220</td><td>1% in volume</td></tr><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>98,7% in volume</td></tr><tr><td>Soluzione colorante con anticorpi primari #4 (ciclo 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer di blocco senza BSA (ciclo 2)</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD Bioscienze</td><td>347420</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Biotina Lumican</td><td>R& Sistemi D</td><td>BAF2846</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34528PE</td><td>1:20</td></tr><tr><td>CD20 eFluor 660</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>50-0202-82</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Pan-citocheratina AF750</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Soluzione di colorazione anticorpale secondaria #2 (Ciclo 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer di blocco senza BSA (ciclo 2)</td><td>Vedi sopra</td><td></td><td>Rabboccare fino al volume dopo l'aggiunta di anticorpi</td></tr><tr><td>Asino anti-Topo IgM AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-020/AB_2340844</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Strepavidina AF594</td><td>Thermo Fisher Scientifico</td><td>Episodio 11227</td><td>1:200</td></tr></tbody></table>

il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende l'imaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti

Optimized Workflow for Iterative Bleaching Extends Multiplexity Imaging of Highly Autofluorescent Clinical Samples

La progettazione di un pannello di imaging multiplex basato su anticorpi richiede tempo, impegno e risorse significativi12. Queste sfide sono particolarmente evidenti quando si progetta un pannello per campioni FFPE archiviati da tessuti altamente autofluorescenti, come descritto qui (Figura 1). Per superare queste sfide, abbiamo prima identificato i fluorofori più luminosi compatibili con il nostro protocollo di inattivazione del colorante (Tabella 1...

Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende l'imaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti

The prevalence of pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria (NTM) has been increasing globally. Though NTM-induced pulmonary disease often ...

optimized-workflow-for-iterative-bleaching-extends-multiplexity

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Sfondo autofluorescenza dei campioni biologici complica spesso tecniche di imaging basata sulla fluorescenza, particolarmente in tessuti postmitotic umani invecchiati. Questo protocollo descrive come autofluorescence da questi campioni possa essere efficacemente rimosse utilizzando una luce disponibile in commercio che emette luce a diodi fonte a photobleach il campione prima della colorazione.

Semplice eliminazione di fluorescenza di fondo nel tessuto cerebrale umano formalina per microscopia di immunofluorescenza

Un protocollo dettagliato per un pannello indicatore di sei multiplex immunofluorescenza è ottimizzato ed eseguito, utilizzando un coloratore automatico per risultati più coerenti e un tempo di procedura più breve. Questo approccio può essere adattato direttamente da qualsiasi laboratorio per studi di immuno-oncologia.

Pannello di immunofluorescenza Multiplex automatizzato per gli studi di Immuno-oncologia su campioni di tessuto in formalina Carcinoma

L'immunohistochimica fluorescente multiplex è una tecnologia emergente che consente la visualizzazione di più tipi di cellule all'interno del tessuto incorporato in parina (FFPE) intatto. Le linee guida presentate sono linee guida per garantire un multiplex a 7 colori di successo con istruzioni per ottimizzare anticorpi e reagenti, preparare diapositive, progettare e suggerimenti per evitare problemi comuni.

Ottimizzazione, progettazione ed evitare le falle nella immunostiera fluorescente manuale

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

L'immunoistochimica ciclica multiplex consente la rilevazione in situ di più marcatori contemporaneamente utilizzando l'incubazione ripetuta antigene-anticorpo, la scansione delle immagini e l'allineamento e l'integrazione delle immagini. Qui, presentiamo il protocollo operativo per l'identificazione dei substrati delle cellule immunitarie con questa tecnologia in campioni di carcinoma polmonare e metastasi cerebrali accoppiate.

Immunoistochimica fluorescente ciclica multiplex

Questo rapporto descrive un protocollo automatizzato per saggi di immunofluorescenza multiplex (mIF) su un coloratore automatico per vetrini. Dimostra l'elevata riproducibilità della proteomica spaziale su autocoloratori tissutali standard ad alto rendimento e imager a fluorescenza su vetrini interi, ideale per saggi mIF personalizzati su un gran numero di vetrini tissutali nella ricerca traslazionale.

Saggi automatizzati di immunofluorescenza multiplex ad alto rendimento per la ricerca traslazionale

La combinazione di IBEX (iterative bleaching-extends-multiplexity) e di un saggio commerciale di marcatura dei nucleotidi (Click-iT EdU) consente il rilevamento e la categorizzazione dei tipi di cellule in divisione in processi altamente dinamici in sezioni fisse di tessuto murino congelato. Inoltre, una nuova pipeline di elaborazione delle immagini open source fornisce l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto rendimento.

Flusso di lavoro di imaging e analisi ad alto rendimento per la valutazione dei fenotipi delle cellule cutanee e degli stati di proliferazione nei campioni di tessuto

Qui, descriviamo l'applicazione del metodo IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplicity) utilizzando coloratori tissutali automatizzati disponibili in commercio e considerazioni di ottimizzazione per l'uso di reagenti basati sull'amplificazione del segnale tiramidico.

Lo sbiancamento iterativo estende la molteplicità con l'uso dell'automazione della colorazione per le strutture principali

Questo articolo descrive un protocollo per l'immunofluorescenza multiplex ottimizzato per caratterizzare l'architettura tridimensionale delle metastasi peritoneali.

L'imaging tridimensionale di tessuti tumorali utilizzando lo sbiancamento iterativo estende l'approccio alla multiplexità

Lo sbiancamento iterativo spettrale estende la multiplexità (IBEX) si basa sulla tecnica IBEX di base aggiungendo il blocco dell'eparina per ridurre al minimo il legame non specifico e sfruttando il rilevamento spettrale con la miscelazione computazionale per sopprimere l'autofluorescenza. Questo approccio accelera l'acquisizione delle immagini riducendo al contempo le fonti di fondo, consentendo solide analisi proteomiche spaziali multi-round e ad alto parametro.

Imaging ad alto plex con microscopia confocale spettrale per ridurre al minimo la fluorescenza tissutale non specifica

L'immunofluorescenza multiplexata consente l'etichettatura sequenziale di più marcatori anticorpali all'interno di una singola sezione tissutale per supportare l'analisi spaziale dell'architettura tissutale e delle popolazioni cellulari. Qui viene presentato un flusso di lavoro per la rilevazione multiplex di marcatori strutturali, associati alla senescenza e immunologici, inclusa la preparazione manuale e automatizzata delle vetrine, l'imaging iterativo e l'analisi di singole cellule...

Saggio multiplexato di immunofluorescenza per la valutazione spaziale dei marcatori di senescenza in vivo

Scopri un metodo di fotoirradiazione a basso costo per ridurre l'autofluorescenza nei tessuti umani e preservare i segnali anticorpali. Questa tecnica consente l'imaging multiplex di campioni clinici archiviati per l'analisi spaziale delle cellule immunitarie.

Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende limaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti (Video) | JoVE Journal

Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende l'imaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti

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