Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende l'imaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti
11 luglio 2025
L'implementazione di una tecnica di fotoirradiazione versatile e a basso costo con il metodo IBEX manuale consente un imaging ottimale del tessuto umano con una significativa autofluorescenza nativa. Questo protocollo descrive in dettaglio come ottenere immagini multiplexate di vetrini interi da campioni clinici archiviati utilizzando un microscopio invertito, reagenti ampiamente disponibili e software open source per l'allineamento e l'elaborazione delle immagini.
[Narratore] Utilizzando la proteomica spaziale, denominata Metodo dell'anno 2024 di Nature Methods, è possibile mappare le posizioni precise delle cellule immunitarie insieme alle interazioni cellula-cellula all'interno dei tessuti. Ciò rivela modelli spaziali legati agli esiti clinici. La creazione di pannelli di anticorpi complessi e tessuti di imaging con un'elevata fluorescenza endogena presenta notevoli sfide in termini di tempo, risorse e competenze per IBEX e altre tecniche di microscopia a fluorescenza. Utilizzando IBEX, le caratteristiche specifiche del tumore sono state identificate nei pazienti con linfoma follicolare ad alto rischio e con i colleghi di Human Cell Atlas. È stata creata una mappa spaziale completa del timo umano. Poco si sa sulla composizione delle cellule immunitarie, sulle interazioni spaziali e sulle differenze di produzione di citochine in diverse patologie polmonari micobatteriche. Questo protocollo colma questa lacuna. Questo protocollo offre un metodo di fotoirradiazione adattabile e a basso costo per ridurre significativamente l'autofluorescenza tissutale ad ampio spettro, soprattutto nei campioni FFPE difficili, preservando al contempo il segnale anticorpale per l'analisi spaziale. Per iniziare, immergere i vetrini con il tessuto in PBS dopo aver completato il recupero dell'antigene. Rimuovere un vetrino dal PBS e utilizzare un panno privo di lanugine per asciugare accuratamente tutto il tampone in eccesso senza toccare il fazzoletto. Con una penna idrofoba, disegna un bordo attorno alla sezione di tessuto sul vetrino. Dopo aver ripetuto il processo per i vetrini rimanenti, lasciare asciugare le barriere idrofobiche per 10 minuti. Quindi, utilizzando un panno privo di lanugine, rimuovere il PBS dalla sezione del tessuto senza toccare direttamente il tessuto. Ora aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante sul vetrino e chiudere la camera di umidità. Posizionare la camera in un forno a microonde scientifico non riscaldante con un meccanismo di regolazione della temperatura ed eseguire il programma precedentemente stabilito per cinque cicli. Durante l'incubazione bloccante, preparare la soluzione primaria di colorazione dell'anticorpo 1 con gli uncini e il tampone bloccante contenente il blocco Fc. Combina gli anticorpi e mescola delicatamente il cocktail. Al termine del ciclo a microonde, rimuovere e aprire la camera del vetrino e rimuovere il tampone di blocco dal vetrino senza toccare il fazzoletto. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione primaria per la colorazione degli anticorpi 1 al vetrino. Rimettere la camera nel microonde ed eseguire nuovamente il programma di anticorpi primari per circa 30 minuti. Una volta completata la marcatura degli anticorpi primari, tenere il vetrino in verticale. Per lavare il vetrino, pipettare 1.000 microlitri di PBS sul fazzoletto, lasciandolo defluire. Eliminare il PBS in eccesso e fissare il vetrino con paraformaldeide all'1% per 10 minuti a temperatura ambiente nella camera di umidità. Dopo il fissaggio, lavare accuratamente il vetrino con 1.000 microlitri di PBS da tre a cinque volte e lasciare uno strato di PBS sul tessuto fino alla fase di fotoirradiazione. Per preparare la scatola di fotoirradiazione, raccogli una lampada LED da 150 watt, una lampada LED RGBW flood da 40 watt, un grande contenitore di plastica con una capacità di 75,71 litri o più, PBS fresco e una capsula di Petri. Ora riempi la piastra di Petri con 1x PBS per immergere completamente il vetrino. Eseguire la procedura di fotoirradiazione in una stanza fredda per ridurre al minimo il calore delle lampade. Quindi posizionare il vetrino nella piastra di Petri, assicurandosi che sia completamente immersa nel PBS. Quindi, posiziona la lampada da 40 watt direttamente sopra la capsula di Petri con la sorgente luminosa rivolta verso il basso verso il vetrino e imposta la lampada sulla modalità luce rossa. Infine, accendi entrambe le lampade da 150 watt e 40 watt e copri l'intera configurazione con il coperchio del contenitore di plastica. Dopo due ore, accendere la lampada sulla luce verde e incubare per 16 ore. I fluorofori più luminosi compatibili con il protocollo di inattivazione del colorante sono stati identificati e abbinati a marcatori a bassa espressione per migliorare il rilevamento del segnale. L'autofluorescenza è stata ridotta significativamente dopo la fotoirradiazione e a lunghezze d'onda di imaging più lunghe. Anticorpi coniugati direttamente mirati a marcatori strutturali altamente espressi, actina muscolare alfa-liscia e pancitocheratina, sostituiti nel canale del vicino infrarosso a 750 nanometri. Il segnale di fondo è stato sottratto computazionalmente utilizzando un'immagine di riferimento non colorata e l'aritmetica SimpleITK, e i segnali reali sono stati migliorati attraverso la soglia. L'imaging dell'intero vetrino di sezioni colorate con IBEX ha rivelato granulomi con nuclei necrotici e neutrofili CD15-positivi. Il Mycobacterium tuberculosis o micobatteri non tubercolari sono stati rilevati vicino al nucleo necrotico del granuloma utilizzando l'anticorpo anti-antigene 85B. Il tessuto linfoide associato al granuloma conteneva cellule B CD20-positive, cellule T CD4-positive, alcune cellule T CD8-positive e la marcatura CD45 di tutte le cellule immunitarie nel polmone. L'imaging IBEX ha anche consentito la visualizzazione delle caratteristiche anatomiche del polmone, tra cui le cellule epiteliali bronchiali, la muscolatura liscia arteriosa e i macrofagi CD68-positivi.
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Panoramica
Questo articolo presenta una tecnica di fotoirradiazione a basso costo che migliora l'imaging del tessuto umano con autofluorescenza nativa. Il protocollo consente l'imaging multiplexato di interi vetrini da campioni clinici archiviati utilizzando reagenti ampiamente disponibili e software open-source.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Microscopia a fluorescenza
Sfondo
- La proteomica spaziale consente la mappatura delle cellule immunitarie e delle loro interazioni all'interno dei tessuti.
- Esistono sfide nella costruzione di pannelli di anticorpi e nell'imaging di tessuti con elevata fluorescenza endogena.
- La tecnica IBEX identifica caratteristiche specifiche dei tumori nei pazienti con linfoma ad alto rischio.
- Poco si sa sulla composizione delle cellule immunitarie nelle patologie polmonari micobatteriche.
Obiettivo dello studio
- Fornire un protocollo che riduca l'autofluorescenza del tessuto preservando i segnali degli anticorpi.
- Facilitare l'analisi spaziale delle cellule immunitarie in campioni di tessuto complessi.
- Colmare le lacune di conoscenza nelle interazioni delle cellule immunitarie attraverso varie patologie.
Metodi utilizzati
- I vetrini con tessuto vengono immersi in PBS dopo il recupero dell'antigene.
- Il buffer di bloccaggio e le soluzioni di anticorpi primari vengono preparati e applicati.
- La fotoirradiazione viene eseguita utilizzando specifiche lampade LED per ridurre l'autofluorescenza.
- L'imaging di interi vetrini viene condotto per visualizzare le interazioni delle cellule immunitarie e le caratteristiche dei tessuti.
Principali risultati
- È stata ottenuta una significativa riduzione dell'autofluorescenza dopo la fotoirradiazione.
- I granuloma e i tipi di cellule immunitarie sono stati visualizzati nel tessuto polmonare.
- Gli anticorpi specifici hanno rilevato Mycobacterium tuberculosis vicino ai nuclei necrotici.
- L'imaging IBEX ha rivelato dettagliate caratteristiche anatomiche dei tessuti polmonari.
Conclusioni
- Il protocollo migliora l'imaging di tessuti complessi minimizzando l'autofluorescenza.
- Fornisce uno strumento prezioso per studiare le interazioni delle cellule immunitarie in varie malattie.
- Questo metodo può essere adattato per una vasta gamma di applicazioni cliniche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Multiplexed imaging of highly autofluorescent clinical samples is a persistent bottleneck in translational research, limiting the ability to resolve spatial immune cell phenotypes in archived tissues. The optimized IBEX workflow with iterative bleaching and photoirradiation directly addresses this challenge, enabling high-resolution, quantitative spatial proteomics in FFPE samples using accessible instrumentation. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery across diverse disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic mapping of immune cell populations within intact tissue architecture.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships and cell-cell interactions in disease contexts.
- Facilitates functional target validation through quantitative, multiplexed readouts in clinically relevant samples.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, low-autofluorescence tissue sections for downstream multiplexed imaging workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative signal detection by minimizing background interference.
- Enables scalable, whole-slide imaging for high-content screening of immune and structural markers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomics outputs with translational biomarker strategies in pulmonary and infectious disease models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis of archived clinical specimens.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering high-content, spatially resolved data from challenging samples.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatial proteomics in FFPE tissues, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through spatially resolved immune profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multiplexed imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, whole-slide data for robust statistical comparison of immune cell distributions and tissue features.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in archived clinical samples.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable imaging protocol for diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spatial immune profiling.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust data generation from archived samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design and fluorescence imaging.
- Needs access to widefield microscopy and LED-based photoirradiation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for antibody validation and image analysis workflows.
- Adaptable to various FFPE tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Practical limitations include potential epitope loss and spectral overlap, necessitating careful panel design and validation.
