Il flusso di lavoro ottimizzato per lo sbiancamento iterativo estende l'imaging multiplex di campioni clinici altamente autofluorescenti

[Narratore] Utilizzando la proteomica spaziale, denominata Metodo dell'anno 2024 di Nature Methods, è possibile mappare le posizioni precise delle cellule immunitarie insieme alle interazioni cellula-cellula all'interno dei tessuti. Ciò rivela modelli spaziali legati agli esiti clinici. La creazione di pannelli di anticorpi complessi e tessuti di imaging con un'elevata fluorescenza endogena presenta notevoli sfide in termini di tempo, risorse e competenze per IBEX e altre tecniche di microscopia a fluorescenza. Utilizzando IBEX, le caratteristiche specifiche del tumore sono state identificate nei pazienti con linfoma follicolare ad alto rischio e con i colleghi di Human Cell Atlas. È stata creata una mappa spaziale completa del timo umano. Poco si sa sulla composizione delle cellule immunitarie, sulle interazioni spaziali e sulle differenze di produzione di citochine in diverse patologie polmonari micobatteriche. Questo protocollo colma questa lacuna. Questo protocollo offre un metodo di fotoirradiazione adattabile e a basso costo per ridurre significativamente l'autofluorescenza tissutale ad ampio spettro, soprattutto nei campioni FFPE difficili, preservando al contempo il segnale anticorpale per l'analisi spaziale. Per iniziare, immergere i vetrini con il tessuto in PBS dopo aver completato il recupero dell'antigene. Rimuovere un vetrino dal PBS e utilizzare un panno privo di lanugine per asciugare accuratamente tutto il tampone in eccesso senza toccare il fazzoletto. Con una penna idrofoba, disegna un bordo attorno alla sezione di tessuto sul vetrino. Dopo aver ripetuto il processo per i vetrini rimanenti, lasciare asciugare le barriere idrofobiche per 10 minuti. Quindi, utilizzando un panno privo di lanugine, rimuovere il PBS dalla sezione del tessuto senza toccare direttamente il tessuto. Ora aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante sul vetrino e chiudere la camera di umidità. Posizionare la camera in un forno a microonde scientifico non riscaldante con un meccanismo di regolazione della temperatura ed eseguire il programma precedentemente stabilito per cinque cicli. Durante l'incubazione bloccante, preparare la soluzione primaria di colorazione dell'anticorpo 1 con gli uncini e il tampone bloccante contenente il blocco Fc. Combina gli anticorpi e mescola delicatamente il cocktail. Al termine del ciclo a microonde, rimuovere e aprire la camera del vetrino e rimuovere il tampone di blocco dal vetrino senza toccare il fazzoletto. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione primaria per la colorazione degli anticorpi 1 al vetrino. Rimettere la camera nel microonde ed eseguire nuovamente il programma di anticorpi primari per circa 30 minuti. Una volta completata la marcatura degli anticorpi primari, tenere il vetrino in verticale. Per lavare il vetrino, pipettare 1.000 microlitri di PBS sul fazzoletto, lasciandolo defluire. Eliminare il PBS in eccesso e fissare il vetrino con paraformaldeide all'1% per 10 minuti a temperatura ambiente nella camera di umidità. Dopo il fissaggio, lavare accuratamente il vetrino con 1.000 microlitri di PBS da tre a cinque volte e lasciare uno strato di PBS sul tessuto fino alla fase di fotoirradiazione. Per preparare la scatola di fotoirradiazione, raccogli una lampada LED da 150 watt, una lampada LED RGBW flood da 40 watt, un grande contenitore di plastica con una capacità di 75,71 litri o più, PBS fresco e una capsula di Petri. Ora riempi la piastra di Petri con 1x PBS per immergere completamente il vetrino. Eseguire la procedura di fotoirradiazione in una stanza fredda per ridurre al minimo il calore delle lampade. Quindi posizionare il vetrino nella piastra di Petri, assicurandosi che sia completamente immersa nel PBS. Quindi, posiziona la lampada da 40 watt direttamente sopra la capsula di Petri con la sorgente luminosa rivolta verso il basso verso il vetrino e imposta la lampada sulla modalità luce rossa. Infine, accendi entrambe le lampade da 150 watt e 40 watt e copri l'intera configurazione con il coperchio del contenitore di plastica. Dopo due ore, accendere la lampada sulla luce verde e incubare per 16 ore. I fluorofori più luminosi compatibili con il protocollo di inattivazione del colorante sono stati identificati e abbinati a marcatori a bassa espressione per migliorare il rilevamento del segnale. L'autofluorescenza è stata ridotta significativamente dopo la fotoirradiazione e a lunghezze d'onda di imaging più lunghe. Anticorpi coniugati direttamente mirati a marcatori strutturali altamente espressi, actina muscolare alfa-liscia e pancitocheratina, sostituiti nel canale del vicino infrarosso a 750 nanometri. Il segnale di fondo è stato sottratto computazionalmente utilizzando un'immagine di riferimento non colorata e l'aritmetica SimpleITK, e i segnali reali sono stati migliorati attraverso la soglia. L'imaging dell'intero vetrino di sezioni colorate con IBEX ha rivelato granulomi con nuclei necrotici e neutrofili CD15-positivi. Il Mycobacterium tuberculosis o micobatteri non tubercolari sono stati rilevati vicino al nucleo necrotico del granuloma utilizzando l'anticorpo anti-antigene 85B. Il tessuto linfoide associato al granuloma conteneva cellule B CD20-positive, cellule T CD4-positive, alcune cellule T CD8-positive e la marcatura CD45 di tutte le cellule immunitarie nel polmone. L'imaging IBEX ha anche consentito la visualizzazione delle caratteristiche anatomiche del polmone, tra cui le cellule epiteliali bronchiali, la muscolatura liscia arteriosa e i macrofagi CD68-positivi.