Flusso di lavoro di imaging e analisi ad alto rendimento per la valutazione dei fenotipi delle cellule cutanee e degli stati di proliferazione nei campioni di tessuto

Questo protocollo combina il metodo di imaging ottico multiplex, l'etichettatura IBEX e Click-iT EDU per rilevare e classificare i tipi di cellule in divisione in processi altamente dinamici, come la riparazione della pelle. Inoltre, forniamo una nuova pipeline di elaborazione delle immagini open source per l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto rendimento. Rivestire la piastra a 24 pozzetti con 200 microlitri di gelatina di cromo-alluminio e incubare la piastra per 15 minuti su uno shaker a bilanciere.

Togliete quindi completamente la gelatina e asciugate i pozzetti rivestiti per 60 minuti in forno a 40 gradi. Tagliare il tessuto incluso nell'OCT a uno spessore compreso tra 15 e 30 micrometri al criostato e trasferirlo rapidamente in un pozzetto rivestito contenente due millilitri di PBS. Rimuovere con cautela il PBS utilizzando una pipetta da un millilitro con l'obiettivo di mantenere la sezione di tessuto centrata nel pozzetto.

Per farlo in modo efficace, aspirare lentamente il PBS dai bordi del pozzetto, regolando la posizione della pipetta secondo necessità per evitare che il tessuto si sposti. Asciugare le sezioni di tessuto per un'ora in un forno a 37 gradi Celsius. Reidratare con un millilitro di PBS per cinque minuti.

Permeabilizzare il tessuto con 500 microlitri di Triton allo 0,5% per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare brevemente il fazzoletto due volte con PBS ed eseguire la reazione Click-iT per 30 minuti a temperatura ambiente. Conservare i campioni al riparo dalla luce.

Lavare brevemente il fazzoletto due volte con PBS. Bloccare per un'ora con un tampone di blocco a temperatura ambiente. Aggiungere gli anticorpi primari per il primo ciclo.

E incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius. Lavare con PBS tre volte. Eseguire la colorazione secondaria degli anticorpi.

Per il primo ciclo, applicare gli anticorpi secondari per gli anticorpi primari disaccoppiati insieme a un controcolorante nucleare. Incubare i campioni al riparo dalla luce per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare il fazzoletto tre volte con un millilitro di PBS per cinque minuti a temperatura ambiente.

Lasciare circa 500 microlitri di PBS in ogni pozzetto e portare la piastra al microscopio. Nel software Meta Express, fai clic su Screening e poi su Impostazione acquisizione. Fare clic sul pulsante Espelli.

Pulire il fondo della piastra con etanolo al 70% e inserire la piastra nel microscopio. Fare clic sul pulsante Piastra di carico. Nella scheda Obiettivo e fotocamera, selezionare l'ingrandimento desiderato.

Come modalità di acquisizione, selezionare la modalità di fessura confocale da 51 micrometri. Nella scheda Piastra (Plate), selezionate il modello di piastra. Vai alla scheda Visita ai siti delle targhe.

In Opzioni sito, fai clic su un numero fisso di siti. Imposta il numero di colonne e righe in modo tale che l'intero pozzetto sia coperto all'incirca. Fare clic sui siti di sovrapposizione 10%Selezionare solo il primo pozzetto per l'acquisizione facendo clic con il pulsante destro del mouse sul pozzetto corrispondente sulla mappa della piastra.

Vai alla scheda Messa a fuoco automatica acquisizione. Per l'autofocus da pozzetto a pozzetto, selezionare l'opzione piastra e fondo pozzetto. Per la messa a fuoco automatica del sito, selezionare l'opzione Tutti i siti.

Vai alla scheda Lunghezze d'onda e scegli il numero di coloranti da visualizzare nel ciclo corrente. Vai alla prima scheda della lunghezza d'onda. Scegliere il laser con offset Z per il posizionamento Z e fare clic sul pulsante Calcola offset per impostare l'altezza di imaging corretta.

Scegli l'immagine in cui il campione è meglio a fuoco. Premere il pulsante Messa a fuoco. Viene mostrata un'immagine a fuoco del tessuto.

Impostare la potenza di illuminazione su 50%Impostare l'intensità massima target su 2000 e premere Auto Expose. Per la serie Z, scegliere la serie Z e l'immagine di proiezione 2D, mentre per la correzione dell'ombreggiatura, scegliere solo ombreggiatura FL. Ripeti i passaggi per altre lunghezze d'onda, ma invece di laser con offset Z, scegli Offset Z da W1 e scegli zero.

Vai al passaggio della serie Z e inserisci la dimensione del passo desiderata. Fare clic sul pulsante Messa a fuoco. Trascinare la freccia della posizione corrente fino a raggiungere la parte inferiore del tessuto e fare clic sul pulsante Imposta B.

Trascina la freccia di posizione sulla parte superiore del tessuto e fai clic sul pulsante Imposta T. Fare clic su F2, Stop, premere nuovamente Start Live. Assicurati che la fase sia al primo pozzetto facendo clic con il pulsante sinistro del mouse su di esso.

Trova il bordo del tessuto e contrassegna tutti i siti contenenti tessuto per l'acquisizione facendo clic con il pulsante destro del mouse. Vai alla scheda Esegui e digita il nome della targa. Fare clic su Salva protocollo.

Impostare l'area di acquisizione per tutti gli altri pozzi. Esegui Controllo, Journal, avvia la registrazione e quindi immediatamente Controlla, Journal, interrompi la registrazione. Salva il diario creato e riaprilo tramite Controllo, Giornale, Modifica diario.

Nel pannello di sinistra, vai su Acquisizione lastre, carica il protocollo da file e fai clic su Acquisizione lastre per aggiungere questi passaggi al journal. Fare doppio clic su Modifica acquisizione piastra, caricare il protocollo da file e scegliere il protocollo salvato per il primo pozzetto. Ripetere i passaggi per ogni pozzetto da acquisire, assicurandosi di caricare sempre il rispettivo protocollo.

Fare clic su Esegui giornale per avviare l'acquisizione. 30 minuti prima della fine del diario, iniziare a preparare il reagente sbiancante. Sciogliere 10 milligrammi di boroidruro di litio in 10 millilitri di H2O a doppia distillazione e passare attraverso un filtro da 0,22 micrometri.

Lasciare agire per 10 minuti. La soluzione dovrebbe iniziare a formare bolle. Per garantire uno sbiancamento efficiente, utilizzare il reagente sbiancante entro quattro ore dalla preparazione.

Aggiungere la soluzione sbiancante ai campioni e incubare per 15 minuti mantenendo i campioni esposti all'illuminazione ambientale. Piccole bolle dovrebbero apparire sul tessuto. Lavare i campioni sbiancati tre volte con un millilitro di PBS per cinque minuti, ciascuno a temperatura ambiente.

Aggiungere gli anticorpi primari per il ciclo successivo e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. L'imaging IBEX multiplexato combinato con l'etichettatura Click-iT EDU rivela diverse strutture e tipi di cellule proliferanti nella pelle ferita. La marcatura EDU su campioni crioconservati mostra di essere simile quando si esegue la marcatura in immunofluorescenza anticorpale per KI-67 su sezioni di tessuto incluse in paraffina, nonché quando si marcano le cellule con KI 67 utilizzando la citometria a flusso.

L'utilizzo di questo protocollo consente di rilevare con precisione la proliferazione cellulare in processi biologici complessi. Inoltre, la pipeline di elaborazione delle immagini open source non richiede alcuna esperienza di programmazione e genera file che possono essere elaborati con software non commerciali, come Fiji e quPath. Inoltre, questo protocollo non richiede alcuna attrezzatura costosa e quindi può essere eseguito nella maggior parte dei contesti di ricerca.