Name: Ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di DNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Scopri l'ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite CRISPR/Cas9 e HMEJ per l'integrazione di grandi costrutti DNA. Questo metodo riduce costi e tempi di produzione mantenendo la funzionalità cellulare.

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<ol><li>Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">T cells in health and disease.</a> Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nature reviews. Immunology. 6 (2), 127-135 (2006).</li>
<li>Dotti, G., Gottschalk, S., Savoldo, B., Brenner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+therapies+using+chimeric+antigen+receptor-expressing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells.</a> Immunol Rev. 257 (1), 107-126 (2014).</li>
<li>DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+strategies+to+enhance+CAR+T+cell+persistence+for+patients+with+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors.</a> Front Immunol. 10, 218(2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chimeric+switch-receptor+targeting+PD1+augments+the+efficacy+of+second-generation+CAR+T+cells+in+advanced+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A chimeric switch-receptor targeting PD1 augments the efficacy of second-generation CAR T cells in advanced solid tumors.</a> Cancer Res. 76 (6), 1578-1590 (2016).</li>
<li>Yeku, O. O., Purdon, T. J., Koneru, M., Spriggs, D., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Armored+CAR+T+cells+enhance+anti-tumor+efficacy+and+overcome+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Armored CAR T cells enhance anti-tumor efficacy and overcome the tumor microenvironment.</a> Sci Rep. 7 (1), 10541(2017).</li>
<li>Schober, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+replacement+of+T-cell+receptor+%CE%B1-+and+%CE%B2-chains+with+preservation+of+near-physiological+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Orthotopic replacement of T-cell receptor α- and β-chains with preservation of near-physiological T-cell function.</a> Nat Biomed Eng. 3 (12), 974-984 (2019).</li>
<li>Roth, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+T+cell+function+and+specificity+with+non-viral+genome+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.</a> Nature. 559 (7714), 405-409 (2018).</li>
<li>Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-based+cancer+immunotherapy%3A+Emerging+efficacy+and+pathways+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance.</a> Immunol Rev. 290 (1), 127-147 (2019).</li>
<li>Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosenberg%2C+SA+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 348 (6230), 62-68 (2015).</li>
<li>Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+antigen+and+NK+cell+activating+ligand+expression+in+malignant+cells%3A+a+story+of+loss+or+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">HLA antigen and NK cell activating ligand expression in malignant cells: a story of loss or acquisition.</a> Semin Immunopathol. 33 (4), 321-334 (2011).</li>
<li>Walther, W., Stein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+gene+transfer%3A+a+review+of+their+use+in+the+treatment+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for gene transfer: a review of their use in the treatment of human diseases.</a> Drugs. 60 (2), 249-271 (2000).</li>
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<li>Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., Sutton, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+determination+of+the+packaging+limit+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic determination of the packaging limit of lentiviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 12 (15), 1893-1905 (2001).</li>
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<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature reviews. Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Pomeroy, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+genetically+engineered+primary+human+natural+killer+cell+platform+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">a genetically engineered primary human natural killer cell platform for cancer immunotherapy.</a> Mol Ther. 28 (1), 52-63 (2020).</li>
<li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR%2FCas9+targeted+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Sci Rep. 8 (1), 12144(2018).</li>
<li>Nguyen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stabilized+Cas9+nanoparticles+and+modified+repair+templates+increase+genome+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency.</a> Nat Biotechnol. 38 (1), 44-49 (2020).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Semenova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cytosolic+DNA+sensors+bind+plasmid+DNA+after+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple cytosolic DNA sensors bind plasmid DNA after transfection.</a> Nucleic Acids Res. 47 (19), 10235-10246 (2019).</li>
<li>Wimberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+inhibition+of+DNA-PK+and+Pol%CF%B4+improves+integration+efficiency+and+precision+of+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Simultaneous inhibition of DNA-PK and Polϴ improves integration efficiency and precision of genome editing.</a> Nat Comm. 14 (1), 4761(2023).</li>
<li>Monjezi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CAR+T-cell+engineering+using+non-viral+Sleeping+Beauty+transposition+from+minicircle+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Enhanced CAR T-cell engineering using non-viral Sleeping Beauty transposition from minicircle vectors.</a> Leukemia. 31 (1), 186-194 (2017).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. -Y., Chen, Z. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nat Biotechnol. 28 (12), 1287-1289 (2010).</li>
<li>Webber, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-induced+targeted+integration+of+large+DNA+payloads+in+primary+human+T+cells+via+homology-mediated+end-joining+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cas9-induced targeted integration of large DNA payloads in primary human T cells via homology-mediated end-joining DNA repair.</a> Nat Biomed Eng. 8, 1553-1570 (2024).</li>
<li>Williams, J. A., Paez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell+and+gene+therapy+safety+and+performance+using+next-generation+Nanoplasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Improving cell and gene therapy safety and performance using next-generation Nanoplasmid vectors.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 32, 494-503 (2023).</li>
<li>Wierson, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeted+integration+directed+by+short+homology+in+zebrafish+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells.</a> eLife. 9, 53968(2020).</li>
<li>Hendel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+modified+guide+RNAs+enhance+CRISPR-Cas+genome+editing+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (9), 985-989 (2015).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present%2C+and+future+of+non-viral+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The past, present, and future of non-viral CAR T cells.</a> Front Immunol. 13, 867013(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acido acetico</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific 14190144</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5% CTS Sostituzione del siero con cellule immunitarie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofactor X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofactor X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>RNA guida chimicamente modificati Tecnologie</td><td>DNA integrate</td><td>na</td><td>Design personalizzato</td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink</td><td>L-7206</td><td></td></tr><tr><td>CTS OpTmizer Terreni di espansione delle cellule T SFM + OpTmizer Supplemento di espansione delle cellule T</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048501</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>I Stem Cell Technologies</td><td>07900</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Attivatore T umano CD3/CD28&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11141D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Umano IL15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>Umano IL2</td><td>PeproTech</td><td>200-02&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Umano IL7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lonza 4D nucelofector Core</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D nucelofector X Unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Minicircle System Biosciences</td><td>MN910A-1</td><td>Design personalizzato</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina</td><td>MiliporeSigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nanoplasmide</td><td>Aldevron</td><td>na</td><td>Design personalizzato</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegnerizzazione non virale di cellule t umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di dna

Non-Viral Engineering of Primary Human T Cells via Homology-Mediated End-Joining Targeted Integration of Large DNA Templates

Qui, un modello multicistronico di grandi dimensioni (&gt;6,3 kb) chiamato costrutto "Giant Minicircle" è stato integrato nel locus TRAC nelle cellule T umane primarie utilizzando l'editing CRISPR/Cas9; un gRNA specifico per TRAC (TCTCTCAGCTGGTACACGGC), l'UgRNA e il nanoplasmide HMEJ (Figura 2A) con una condizione priva di gRNA specifico per TRAC, il gRNA universale e l'mRNA Cas9 utilizzati come controllo negativo. I campioni che includono il costrutto Giant Minicircle, il gRNA specifico per TRAC, il gRNA universale e l'mRNA Cas9 hanno avuto un tasso medio di knock-in del 23,35% quando hanno misurato l'espressione di GFP (23,5% ± 5,247), mentre il controllo negativo non ha mostrato alcuna espressione di GFP (Figura 2B). Non ci sono state differenze significative nell'espansione del fold (Figura 2C) e nella vitalità (Figura 2D) tra le condizioni sperimentali. Questi risultati dimostrano un knock-in ad alta efficienza di un modello molto grande, pur mantenendo un'eccellente vitalità ed espansione cellulare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica del progetto del costrutto HMEJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68150/68150fig02.jpg"> Figura 2: Caratterizzazione di cellule T elettroporate con il costrutto del minicerchio gigante. (A) Rappresentazione schematica del costrutto Giant Minicircle, un grande modello multicistronico (&gt;6.3 kb) che codifica per un CAR anti-mesotelina e RQR8 sotto il promotore TRAC con un linker GSG, un CAR anti-CD19 e una muteina DHFR ed eGFP sotto il promotore MND. (B) percentuale di espressione di RQR8, (C) espansione del fold e (D) vitalità delle cellule T nove giorni dopo l'elettroporazione con il costrutto Giant Minicircle e i reagenti CRISPR-Cas9, rispetto a un controllo negativo elettroporato con il Giant Minicircle privo di reagenti CRISPR-Cas9. (***p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68150/68150fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Dimensione della piastra</td>
			<td>Volume della cuvetta</td>
			<td>Celle/Pozzetto</td>
			<td>Volume dei supporti di ripristino</td>
			<td>Volume di 1x TCM con NAC</td>
			<td>Volume finale totale</td>
		</tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td>
			<td>22/22 μL</td>
			<td>1-3 x 106</td>
			<td>300 μl</td>
			<td>680 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td>
			<td>100/110 μL</td>
			<td>4-20 x 106</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>2,9 ml</td>
			<td>4 ml</td>
		</tr><tr><td>Piastra G-Rex a 24 pozzetti</td>
			<td>20-110 μl</td>
			<td>1-20 x 106</td>
			<td>400 μl</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>6 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Concentrazioni cellulari per cuvette e piastre di recupero.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Dimensione cuvetta</td>
			<td>Plasmide modello</td>
			<td>Sito bersaglio gRNA</td>
			<td>GRNA di linearizzazione plasmidica</td>
			<td>mRNA Cas9</td>
		</tr><tr><td>20 μl</td>
			<td>1-2 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1 μg)</td>
			<td>1-3 μg (1,5 μg)</td>
		</tr><tr><td>100 μl</td>
			<td>5-10 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
			<td>5-15 μg (5 μg)</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Quantità di reagenti CRISPR/Cas9 e modello di DNA necessari.

Ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di DNA

Many current adoptive cellular therapies rely on lenti- or retroviral vectors to engineer T cells for the expression of a chimeric antigen receptor (CAR) ...

non-viral-engineering-primary-human-t-cells-via-homology-mediated-end

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Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Le metodologie di targeting genico possono essere utilizzate per generare topi transgenici con alleli knockout, knock-in e marcati.  Qui, descriviamo un metodo migliorato di ricombinazione in E. coli, che chiamiamo "subclonaggio più inserimento", che può essere utilizzato per generare rapidamente vettori di targeting genico personalizzati.

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Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.

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Qui si descrive un nuovo metodo per generare recettori delle cellule T antigene-specifiche (TCR) accoppiando la TCRα o TCRβ di un TCR esistente, che possiede l'antigene-specificità di interesse, con hemichain complementare del T periferico recettore delle cellule repertorio. I TCR de novo generati conservano antigene-specificità con vari affinità.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

Questo manoscritto descrive la procedura sperimentale e l'analisi del software per un test di sito di integrazione bidirezionale che può contemporaneamente analizzare il DNA di giunzione vettoriale-host a monte ea valle. I prodotti bidirezionali di PCR possono essere usati per qualsiasi piattaforma di sequencing a valle. I dati risultanti sono utili per un confronto quantitativo e ad alto rendimento dei target integrati del DNA.

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Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.

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Ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di DNA

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