Ingegnerizzazione non virale di cellule T umane primarie tramite integrazione mirata di giunzione terminale mediata da omologia di grandi modelli di DNA
May 9th, 2025
Viene fornito un protocollo dettagliato per l'utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9 per ottenere un knock-in mirato altamente efficiente di grandi costrutti multicistronici in cellule T umane primarie attraverso la via di riparazione del DNA HMEJ (omologia-mediata da end joining). Le cellule T ingegnerizzate con questo protocollo adattabile alle cGMP mantengono un'eccellente espansione cellulare, citotossicità e produzione di citochine.
Questo end-joining mediato da omologia, o protocollo basato su HMEJ, offre un approccio compatibile con GLP per l'ingegnerizzazione mirata non virale di cellule T CAR T o TCR-transgeniche altamente funzionali per l'immunoterapia.
L'attuale produzione GMP di cellule T transgeniche CAR T e TCR per immunoterapie rimane costosa e richiede un lungo tempo di produzione. Questo metodo non virale riduce significativamente sia i costi che i tempi di produzione.
Questo protocollo consente l'integrazione mirata non virale di grandi modelli di DNA in cellule T umane primarie. Al contrario, molte altre tecniche mostrano un'efficacia ridotta con modelli di DNA più grandi o richiedono l'uso di vettori virali che si integrano in modo casuale.
Questo metodo non virale consente di ottenere un'efficiente integrazione mirata di transgeni in cellule T primarie con bassa tossicità e funzione preservata in vitro e in vivo, supportando lo sviluppo clinico di terapie ingegnerizzate con cellule T.
L'efficiente ingegneria mirata non virale nelle cellule T umane primarie crea l'opportunità di sviluppare nuove terapie con cellule immunitarie in modo più sicuro ed efficace con la ricerca futura incentrata sul miglioramento dell'efficacia terapeutica in più indicazioni di malattia e sottogruppi di cellule immunitarie.
[Narratore] Per iniziare, preparare una piastra di recupero aggiungendo 300 microlitri di terreno di recupero a un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Scaldare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Per preparare le cellule T, raccogliere la miscela di perline di attivazione delle cellule T stimolata mescolandole nel pallone e quindi spostandole in una provetta di volume appropriato. Posizionare il tubo nel magnete per isolare le perle dalle celle in sospensione. Lasciarlo incubare per almeno un minuto. Senza rimuovere il tubo dal magnete, trasferire il fluido e le cellule T in un nuovo tubo. Conta le cellule T e trasferiscile in provette coniche da 14 millilitri o 50 millilitri. Rabboccare la provetta con PBS e conservare le celle in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica fino alla centrifugazione. Successivamente, preparare la miscela di cellule T combinando la soluzione della cellula primaria e l'integratore per creare il tampone della miscela master. Centrifugare le cellule T in PBS a 200 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Decantare o aspirare il surnatante. Risospendere le cellule T nel tampone di miscelazione master a una concentrazione di 1 milione di cellule per 18 microlitri di tampone di miscela master. Sul ghiaccio, aggiungere i reagenti a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti per ogni condizione. Ora, preparare la miscela di elettroporazione aggiungendo 18 microlitri di miscela di cellule T a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti, se necessario. Aggiungere un ulteriore tampone di miscelazione master per garantire un volume totale finale di 22 microlitri per tutte le condizioni di elettroporazione. Contrassegnare un'estremità della cuvetta di elettroporazione e il suo tappo per eseguire l'elettroporazione. Togliere il tappo dalla cuvetta. Pipettare delicatamente la miscela per elettroporazione dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti, su e giù, una o due volte e caricarla in cuvette. Richiudere la cuvetta utilizzando la marcatura precedentemente effettuata per evitare di mettere il tappo all'indietro. Toccare la cuvetta da tre a cinque volte per rimuovere potenziali bolle d'aria. Posizionare le cuvette nell'apparecchiatura di elettroporazione ed eseguire l'elettroporazione. Rimuovere delicatamente la cuvetta dall'apparecchiatura e posizionarla nel cofano. Lasciare riposare le celle a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Dopo il periodo di riposo, prelevare 80 microlitri di terreno di recupero riscaldato dalla piastra di recupero. Aggiungere delicatamente il terreno alla cuvetta, evitando il contatto diretto con le cellule. Pipettare delicatamente su e giù una volta e trasferire il volume totale di reazione sulla piastra di recupero. Incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Aggiungere la MTC per diluire le cellule a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Dopo la diluizione, ristimolare le cellule aggiungendo perle di attivazione delle cellule T in un rapporto di 0,5 perle per cellula in ciascun pozzetto. Assicurarsi che le perle siano state lavate per rimuovere il loro buffer di conservazione, quindi risospenderle in MTC prima di aggiungerle a ciascun pozzetto. Infine, il terzo giorno, rimuovere le perle di attivazione delle cellule T e analizzare le cellule. Utilizzando CRISPR-Cas9 è stato ottenuto un knock-in ad alta efficienza del costrutto a minicerchio gigante nel locus TRAC delle cellule T umane primarie, con un'espressione di GFP del 23,35%. Il controllo negativo non ha mostrato alcuna espressione di GFP. Non ci sono state differenze significative nell'espansione delle pieghe tra le condizioni sperimentali e di controllo. Allo stesso modo, non sono state osservate differenze significative nella vitalità cellulare tra le condizioni sperimentali e quelle di controllo.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo non virale, compatibile con le GLP, per l'ingegnerizzazione efficiente di linfociti T umani primari utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9. Il protocollo integra con successo grandi costrutti multicistronici attraverso il percorso di giunzione mediato dall'omologia (HMEJ), portando a linfociti T con funzionalità mantenuta, adatti per applicazioni di immunoterapia.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Tecnologia CRISPR/Cas9
- Ingegnerizzazione dei linfociti T
- Applicazioni di immunoterapia
Contesto
- Gli attuali metodi di produzione di linfociti T CAR e TCR sono costosi e richiedono molto tempo.
- Gli approcci esistenti spesso faticano a integrare in modo efficiente grandi modelli di DNA.
- Questo studio esplora un metodo non virale per migliorare l'efficacia e l'efficienza delle modifiche ai linfociti T.
Metodi utilizzati
- Il protocollo incorpora l'attivazione e l'elettroporazione dei linfociti T per la modifica genetica.
- Nei studi sono stati utilizzati linfociti T umani primari.
- Le tecnologie chiave includono CRISPR/Cas9 e tecniche di elettroporazione.
Risultati principali
- È stato ottenuto un knock-in ad alta efficienza di un costrutto minicircle gigante nel locus TRAC.
- È stata osservata una espressione GFP del 23,35% nei linfociti T modificati, senza differenze significative nell'espansione cellulare o nella vitalità rispetto ai controlli.
- I risultati confermano la fattibilità di questo metodo per lo sviluppo di terapie con linfociti T ingegnerizzati.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo efficiente per l'ingegnerizzazione non virale dei linfociti T con funzionalità preservata.
- Questo approccio ha il potenziale per ridurre i costi e i tempi di produzione migliorando al contempo la sicurezza delle terapie con linfociti T in ambito clinico.
