Saggio immunochimico convalidato per la determinazione completa del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano rilasciato e legato alle cellule

Presentiamo un sandwich convalidato, ELISA, che utilizza nuovi anticorpi monoclonali, che consente una quantificazione precisa del dominio extracellulare della proteina HER2 legato alle cellule e rilasciato per cellule coltivate in vitro e campioni di pazienti.

Il protocollo risponde alla necessità di un test accurato e convalidato per correlare la concentrazione della proteina HER2 circolante con le manifestazioni cliniche della malattia nella diagnostica e nella ricerca.

L'ampio intervallo di lavoro del test, la varietà di tipi di campioni e l'affidabilità dei risultati potrebbero aprire nuove opportunità per un'analisi completa dello stato del recettore in modelli in vitro e in vivo.

L'ELISA sviluppato sarà utilizzato per la quantificazione di HER2 rilasciato dai tessuti tumorali in diverse escrezioni del corpo umano come sangue, fluidi peritoneali o muco.

[Istruttore] Per iniziare, staccare le cellule usando la tripsina dopo che hanno raggiunto l'80% di confluenza e raccoglierle in un tubo conico separato da 15 millilitri. Dopo aver contato le cellule utilizzando un contatore automatico di cellule e seminare tre volte 10 alla potenza di cinque cellule per pozzetto in una piastra a 12 pozzetti con un millilitro di terreno di crescita. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica. Dalla coltura delle 24 ore, raccogliere il terreno di coltura da un pozzetto di ciascuna linea cellulare in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare i campioni raccolti a 10.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una nuova provetta per la conservazione a meno 20 gradi Celsius. Lavare le cellule rimanenti in ogni pozzetto con un millilitro di PBS freddo, aspirare delicatamente e scartare il PBS. Quindi, aggiungere 200 microlitri di tampone RIPA, integrato con un inibitore della proteasi all'1% in ciascun pozzetto e incubare per cinque minuti. Ora, raschiare le cellule con un raschietto cellulare e mescolare il lisato pipettando più volte per omogeneizzare. Raccogliere le cellule lisate in una nuova provetta e aspirare lentamente il campione in una siringa da due millilitri dotata di un ago calibro 21 che misura 0,8 per 40 millimetri. Dopo aver aspirato da cinque a 10 volte, centrifugare i campioni raccolti a 10.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il surnatante in una nuova provetta per la conservazione a meno 20 gradi Celsius. Diluire l'anticorpo di cattura Anti-HER2 a un microgrammo per millilitro nel tampone codificante. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri della soluzione di anticorpi catturanti a ciascun pozzetto di una piastra ELISA a 96 pozzetti. Coprire la piastra con pellicola sigillante. Incubare la piastra per una notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, posizionare la piastra a temperatura ambiente su un agitatore orizzontale per micropiastre per un'ora. Utilizzando una lavatrice per micropiastre, aspirare la soluzione di rivestimento e lavare ogni pozzetto tre volte con 300 microlitri di PBST. Quindi, con una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di tampone bloccante contenente il 5% di latte in polvere scremato in PBS a ciascun pozzetto rivestito per bloccare i siti di legame non specifici. Ora, preparare la curva di calibrazione e il controllo positivo. Aggiungi due microlitri di un milligrammo per millilitro, la soluzione madre di HER2 a 1.998 microlitri di PBS per creare uno standard di lavoro di 1000 nanogrammi per millilitro. Per lo standard due, aggiungere 500 microlitri di standard da uno a 500 microlitri di PBS e mescolare accuratamente per ottenere una concentrazione di 50 nanogrammi per millilitro. Preparare la diluizione seriale per generare gli standard da tre a sette. Successivamente, preparare i campioni della matrice utilizzando lisati cellulari PBS e terreno di coltura addizionato con concentrazioni note di HER2. Diluire i lisati cellulari da uno a 2000 con 2,5 microlitri di lisato e cinque millilitri di PBS per ottenere livelli di HER2 inferiori al limite di rilevamento. Per preparare una soluzione di due nanogrammi per millilitro, aggiungere otto microlitri di standard da uno a 392 microlitri di terreno di coltura PBS o lisato cellulare e mescolare accuratamente. Utilizzando una pipetta a canale singolo, aggiungere 100 microlitri di bianco PBS standard e analizzare i campioni, ciascuno in triplice copia, nei rispettivi pozzetti della piastra ELISA rivestita e bloccata. Dopo un'ora a 37 gradi Celsius in una camera di umidità, lavare la piastra utilizzando una lavatrice per micropiastre. Per rilevare il legame con gli anticorpi, diluire l'anticorpo rilevante biotinilato nel PBS a una concentrazione di lavoro di un microgrammo per millilitro. Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di questa soluzione di anticorpi rivelatori a ciascun pozzetto. Successivamente, diluire il coniugato AVID e HRP da uno a 40.000 in 40 millilitri di PBST. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di coniugato diluito a ciascun pozzetto. Dopo l'incubazione e il lavaggio della piastra, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri di substrato di 3,3 5,5 tetrametilbenzidina a ciascun pozzetto per avviare la reazione metrica del colore. Quindi, coprire la piastra con una pellicola sigillante. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per uno-cinque minuti, proteggendola dalla luce e monitorando lo sviluppo del colore. Quando viene raggiunta l'intensità di colore desiderata, aggiungere 100 microlitri di soluzione di arresto a ciascun pozzetto per terminare la reazione. Infine, misurare l'assorbanza a 450 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre. Utilizzando una curva di calibrazione a quattro parametri, calcolare la concentrazione del campione in base all'equazione della curva. Il sandwich sviluppato, ELISA, ha dimostrato un intervallo di lavoro per la proteina HER2 da 1,56 a 100 nanogrammi per millilitro con un coefficiente di determinazione di uno che indica un'eccellente corrispondenza. La concentrazione di HER2 nel terreno di coltura è aumentata nel tempo per tutte le linee cellulari testate con i valori più alti a 72 ore. Le cellule SK-OV-3 e SK-BR-3 hanno mostrato concentrazioni di HER2 circa dieci volte e 50 volte superiori, rispettivamente, rispetto alle cellule MDA-MB-231 nel terreno di coltura a 24 ore. Allo stesso modo, i livelli di HER2 nei lisati erano circa tre volte e cinque volte superiori rispettivamente per SK-OV-3 e SK-BR-3. È interessante notare che il terreno di coltura cellulare conteneva concentrazioni 1000 volte inferiori dell'antigene testato rispetto alla proteina legata alla membrana che si trova nei lisati di cellule intere.