Flusso di lavoro con un microscopio criogenico a fluorescenza coincidente, a fascio di elettroni e ioni per la fresatura mirata delle cellule

La mia ricerca sviluppa metodi di microscopia ottica per preservare le caratteristiche cellulari nelle lamelle criogeniche durante la fresazione a fascio di ioni focalizzato, permettendo un'analisi dettagliata tramite tomografia elettronica criogenica per scoprire l'organizzazione biologica nativa. La microscopia ottica è stata integrata nei sistemi CryoFIB-SEM, ma raramente nella stessa posizione della FIB. Ciò richiede approcci di guida basati sulla registrazione per preservare i bersagli marcati fluorescenti nella lamella finale.

Per cominciare, raffreddare manualmente la stazione di trasferimento utilizzando azoto liquido una volta che lo stadio ha raggiunto le temperature criogeniche. Carica una griglia automatica agganciata nella cassetta campione progettata per il sistema di microscopia artificiale criogenica. Assicurati che l'autogrid sia posizionata tra il coperchio incollato e il distanziatore.

Stringi la vite ad anello per chiudere la cassetta e inseriscila nella fessura della stazione di trasferimento. Collega la stazione di trasferimento al sistema di microscopia artificiale criogenica. Usa la camera interna della camera per guidare la cassetta campione verso il palco del campione.

Nel software di microscopia luminosa, sposta lo stadio del campione dalla posizione di carico alla posizione predefinita dei tre fasci. Nel software FIB-SEM, imposta l'ingrandimento su 100X e clicca sulla finestra in alto a sinistra. Nella scheda di allineamento del software di microscopia luminosa, clicca su Z e seleziona la funzione Play per acquisire un atlante SEM della griglia.

Identifica un'area quadrata con pellicola di carbonio rotta e fai doppio clic sopra per spostare la fase del campione in quella posizione. Torna all'interfaccia software. Attiva la FIB e acquisisci un'immagine.

Regola l'ingrandimento usando il menu a tendina nell'angolo in alto a sinistra. Premi Play per visualizzare l'immagine FIB. Poi imposta la dimensione del passo usando la barra scorrevole.

Ora clicca su Z e Z per regolare la posizione dello stadio Z finché la linea orizzontale presente nello ione e le immagini elettroniche non si allineano con la stessa caratteristica. Seleziona la scheda SEM nel software di microscopia luminosa. Usa i pulsanti X e Y per allineare una caratteristica comune tra le immagini SEM e ioniche.

Ora accendi il microscopio a fluorescenza. Seleziona la scheda FLM, imposta le condizioni di imaging con luce riflessa e seleziona Play. Poi allinea l'immagine a luce riflessa con quella SEM.

Ingrandisci l'immagine e clicca sull'opzione rettangolo per definire un motivo di fresatura per il fascio di ioni. Premi Start Patterning nel Display 2 per fresare un piccolo pattern usando il fascio di ioni focalizzato. Conferma che il motivo fresato sia visibile sia nel fascio di ioni focalizzato sia nella vista del microscopio fluorescente.

Nel software di microscopia luminosa, spostati nella scheda Localizzazione e attiva le condizioni appropriate per impostare i canali fluorescenti. Assegnare a ogni fluorofero un canale separato e includere un canale aggiuntivo per il campo chiaro. Regola la potenza del LED e il tempo di esposizione per ogni canale fluorescente per identificare il bersaglio di interesse.

Una volta che i parametri sono soddisfacenti, si ottiene uno stack z fluorescente pre-fresatura passando attraverso la direzione assiale. Poi segna il bersaglio come regione di interesse. Passa al software FIB-SEM e disegna una lamella nella regione di interesse.

Esegui fresatura grezza per rimuovere il materiale sfuso mantenendo il microscopio a fluorescenza acceso per monitorare i cambiamenti del segnale. Apri il toolkit interferometrico basato su Python dal terminale per monitorare il segnale fluorescente durante l'assottigliamento delle lamelle. Ridurre il ROI a circa due micrometri usando la modalità sezione trasversale di pulizia.

Per un bersaglio con un'estensione assiale superiore a 300 nanometri, nell'interfaccia grafica di Python seleziona il bersaglio nella micrografia di fluorescenza. Il software inizierà automaticamente a tracciare la luminosità in funzione del tempo ad ogni nuovo fotogramma. Monitorare l'intensità della fluorescenza tramite il toolkit Python.

Fresa il campione utilizzando la modalità di pulizia della sezione trasversale per rimuovere eventuali residui di supporto dalla zona di interesse. Osserva eventuali cali improvvisi di intensità di fluorescenza come segnali per cambiare direzione di fresatura. Se si osserva una forte diminuzione durante la fresatura dal basso verso l'alto, fermarsi e iniziare a fresare dall'alto verso il basso.

Dopo aver completato la fresatura dall'alto verso il basso, finalizzare la lamella fresando dal basso verso l'alto in modalità sezione trasversale di pulizia fino a raggiungere lo spessore desiderato. Poi cattura un'immagine di fluorescenza post-macinazione della lamella. Trasferisci il campione su un CryoTEM.

Carica l'immagine multi-canale a fluorescenza post-fresatura e l'immagine di proiezione CryoTEM nel software personalizzato di trasformazione proiettiva per la registrazione della regione di interesse. Ora seleziona otto-dieci coppie di punti di riferimento visibili sia nelle immagini di fluorescenza che in quelle di microscopia elettronica per calcolare la trasformazione proiettiva. Usa l'immagine sovrapposta come guida per selezionare un'area di immagini.

Successivamente seleziona i parametri di ingrandimento e acquisizione appropriati per la serie di inclinazione a seconda della dimensione della struttura del bersaglio e della risoluzione desiderata. Le cellule macrofagiche differenziate marcate con SiR-Tubulina mostravano un unico punto fluorescente brillante, di circa un micrometro di diametro, corrispondente al MTOC, insieme a strutture simili alla fibro che irradiavano verso la periferia cellulare coerenti con la rete microtubulica. Man mano che il campione veniva fresato fino a circa 800 nanometri di spessore, il singolo punto fluorescente MTOC si risolveva in due puntini distinti, ciascuno di circa 700 nanometri di diametro.

L'intensità della fluorescenza aumentò dopo la rimozione del materiale non fluorescente e del film di supporto assorbente, seguita da una netta diminuzione man mano che la lamella veniva ulteriormente assottigliata da due micrometri a meno di 200 nanometri. La fluorescenza criogenica correlata e la microscopia elettronica hanno permesso un targeting preciso delle strutture durante la macinazione. Tomogrammi ricostruiti e modelli segmentati rivelano che i centrioli sono composti da triple di microtubuli.

Nei casi in cui solo una macchia fluorescente è stata trattenuta nella lamella finale, un singolo centriolo è stato visualizzato nel tomogramma corrispondente. La precisione della fluorescenza basata sul millimilling è limitata dagli approcci di registrazione, che soffrono molto di risoluzione limitata dalla diffrazione, disadattamento dell'indice di rifrazione e anche del movimento indotto dalla fresatura. La microscopia ottica simultanea e la fresatura FIB eliminano gli errori di registrazione utilizzando invece il feedback in tempo reale della microscopia a fluorescenza per guidare il processo di fresatura.

Questo evita errori dovuti al limite di diffrazione e all'inadeguamento dell'indice di rifrazione, permettendo una fresatura precisa che preserva le strutture marcate fluorescenti per la crioelettronica tomografia all'interno della lamella finale. La nostra ricerca permette di individuare strutture cellulari che prima erano difficili da visualizzare direttamente tramite crioET, facendo luce sui meccanismi molecolari dietro un ampio spettro di macchine micromolecolari chiave.