Campionamento efficiente dello spazio di progettazione di biosensori geneticamente codificati grazie alla progettazione di esperimenti e al flusso di lavoro di automazione

Lo sviluppo e l'ottimizzazione di biosensori verso applicazioni biotecnologiche è l'ambito della nostra ricerca. In particolare, ci proponiamo di capire come ottimizzare e ingegnerizzare i biosensori attraverso la modulazione dei loro elementi genetici. Le scelte progettuali guidate dall'intuizione, come l'ingegneria classica del promotore e la selezione cellulare con attivazione della fluorescenza, sono tecniche abitualmente applicate nella caratterizzazione e nella progettazione di biosensori.

La progettazione di metodologie sperimentali non è ancora stata ampiamente adottata nella progettazione di circuiti genetici. Attraverso questo protocollo, cerchiamo di aumentare l'adozione di questi tipi di tecniche nella progettazione di circuiti genetici e biosensori. Per iniziare, determina la dimensione teorica della libreria e calcola il numero di singole varianti necessarie per garantire una copertura della libreria superiore al 95%.

Calcolare il volume richiesto di terreno di brodo di lisogenia integrato con antibiotici in base al numero di colonie da sottoporre a screening. Aprire il software di gestione dei liquidi e fare clic su Esegui accanto al programma di trasferimento dei liquidi MTP. Posizionare il fluido preparato nella posizione del serbatoio corrispondente.

Quindi riempire il ponte con piastre di microtitolazione vuote secondo il layout. Impostare il programma per erogare 200 microlitri di fluido. Fare clic su OK per confermare l'avvio del programma.

Ora, trasferire i pozzetti riempiti della piastra di microtitolazione su una piattaforma di raccolta delle colonie e aprire e trasferire le piastre a coclea quadrate di Pseudomonas putida trasformate con il DNA della libreria di varianti plasmidiche nella piattaforma di raccolta delle colonie. Usa il raccoglitore di colonie per inoculare ogni pozzetto preriempito con una singola colonia dalle piastre trasformanti. Richiudere le piastre inoculate e trasferirle in un'incubatrice ad agitazione offline.

Dopo l'incubazione, rimettere le piastre coltivate sulla piattaforma di gestione dei liquidi e aprirle. Fai clic su Esegui accanto al protocollo Aggiungi glicerolo al protocollo MTP. Assicurarsi che il layout della piastra sullo schermo corrisponda a quello del dock di gestione dei liquidi.

E in sequenza, fare clic su OK per l'esecuzione del protocollo. Una volta terminato, sigillare le piastre e mescolarle brevemente in un'incubatrice ad agitazione offline a 800 giri al minuto per cinque minuti. Codificare le piastre con codice a barre e conservarle a 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Calcolare il volume richiesto di terreni integrati con antibiotici per i blocchi a pozzetti profondi. Fare clic su Esegui accanto al programma di trasferimento di liquidi DWB. Assicurarsi che il fluido sia stato aggiunto al serbatoio corretto.

I blocchi vuoti per pozzetti profondi sono in posizioni di layout corrette e che sia disponibile un'adeguata fornitura di puntali. Impostare il programma per erogare 495 microlitri di fluido. Quando si è pronti, fare clic in sequenza su OK per avviare il programma.

Ora, sigillare i blocchi di pozzetti profondi riempiti con una membrana traspirante e trasferirli in un deposito temporaneo a 4 gradi Celsius. Quindi, fare clic su Esegui accanto al programma inoculato da MTP scongelato. Assicurarsi che le scorte criogeniche MTP e i blocchi di pozzetti profondi di riempimento siano trasferiti alla piattaforma in base al layout e che siano caricati un numero sufficiente di puntali.

In sequenza, fare clic su OK per inizializzare. Al termine del programma, sigillare i blocchi di pozzetti profondi inoculati durante la notte con una membrana traspirante. Trasferiscili in un'incubatrice per piastre offline impostata per 16 ore a 30 gradi Celsius, 800 giri al minuto e 75% di umidità.

Richiudere, miscelare e riportare le piastre per microtitolazione criogenica in un congelatore a 80 gradi Celsius. Ora, calcolate il volume richiesto di terreni integrati con varie concentrazioni di effettori e antibiotici per i blocchi di pozzetti profondi notturni da sottoporre a screening. Fare clic su Esegui accanto al programma di trasferimento di liquidi DWB.

Assicurarsi quindi che i serbatoi dei terreni integrati con l'effettore siano posizionati correttamente. Aggiungere blocchi vuoti per pozzi profondi nella piattaforma di movimentazione dei liquidi. Quando sono disponibili un numero sufficiente di puntali, fare clic in sequenza su OK per avviare il protocollo e generare blocchi di saggi a pozzetti profondi.

Dopo il riempimento, sigillare i blocchi profondi del pozzetto con una membrana traspirante. Riempire il dissipatore di liquidi con piastre vuote. Ripetere l'inoculazione fino a riempire tutti i blocchi di analisi.

Quindi, fare clic su Esegui accanto al programma DWB di trasferimento al saggio. Dopo aver saggiato i blocchi di pozzetti profondi con terreni integrati con effettore posizionati correttamente, trasferire e dissigillare i blocchi di pozzetti profondi durante la notte contenenti P.putida coltivata per layout. Fare clic in sequenza su OK per avviare il protocollo.

Al termine del programma, sigillare le piastre di saggi per il trasferimento all'incubatore offline. Scartare i blocchi di pozzetti profondi durante la notte dopo l'inoculazione. Quindi, trasferire i blocchi di pozzetti profondi in una centrifuga.

Celle a pellet a 4.000 G in un rotore controllato dal ghiaccio a 18 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, posizionare i blocchi di centrifuga sulla piattaforma di erogazione dei liquidi. Calcola il volume di una volta il PBS richiesto in base al numero di blocchi di pozzi profondi da vagliare.

Fare clic su Esegui accanto al programma DWB di risospensione PBS impostato per l'analisi e impostare il volume di dispensazione su 500 microlitri. Quindi assicurarsi che il PBS sia aggiunto al serbatoio corretto e disporre le piastre centrifugate in base al layout. Fare clic su OK per avviare il programma dopo aver confermato la disponibilità dei suggerimenti.

Richiudere e rimuovere i blocchi di pozzetti profondi risospesi dal gestore del liquido. Controllare la parte inferiore della piastra per assicurarsi che i pellet siano completamente risospesi. Fare clic su Esegui accanto alle celle di configurazione del saggio e al programma MTP dell'edizione PBS.

Quindi trasferire i blocchi di pozzetti profondi risospesi nel gestore di liquidi secondo il layout. Caricare le piastre di microtitolazione vuote in base al layout e impostare il volume di erogazione su 200 microlitri prima di fare clic su OK. Trasferite le piastre per microtitolazione riempite in un lettore di piastre multimodale offline e misurate la fluorescenza relativa e l'OD600.

Lo screening automatizzato di 5.000 varianti del promotore ha identificato i principali candidati che mostravano un'attivazione superiore a 3,6 volte. I valori EC 50 per 100 varianti uniche sono stati tracciati per visualizzare la distribuzione della sensibilità e identificare candidati robusti. I valori EC 50 sono stati calcolati per 226 varianti arricchite e classificati utilizzando la trasformazione Lin-log per formare una libreria in scala di sensibilità.

Un progetto di screening definitivo è stato costruito utilizzando la varianza di livello 1, 0 e 1 da quattro moduli. I profili dei modelli del sito di legame dei ribosomi di trasporto, regolatore, p-out e output hanno rivelato come i cambiamenti nei livelli di espressione dei quattro moduli abbiano influenzato in modo non lineare EC 50 e il coefficiente di Hill. Identificazione di combinazioni di espressione ottimali con RBS-Out, che mostrano un forte effetto positivo sia sulla sensibilità che sulla pendenza.

La variante del biosensore, ottimizzata a livello globale, che incorpora i punti di forza ideali del modulo, ha dimostrato una maggiore sensibilità e coefficiente di Hill rispetto alle versioni parentali e ottimizzate per DSD.