Name: Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 24 s
Description: Impara a generare modelli predittivi per l'espressione transitoria di proteine in foglie di tabacco utilizzando il design of experiments. Questo metodo ottimizza la produzione di anticorpi monoclonali in piante.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori sono grati al Dott. Thomas Rademacher per fornire il PPAM pianta vettore di espressione e Ibrahim Al Amedi per la coltivazione delle piante di tabacco utilizzate in questo studio. Vorremmo ringraziare il Dott. Richard M. Twyman per la sua assistenza con la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato in parte finanziato dalla Advanced Grant &quot;Future-Pharma&quot; Consiglio europeo della ricerca, il numero di proposta 269.110 e il Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation).

<ol><li>Fischer, R., Emans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+farming+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+research%22%5BJournal%5D)">Molecular farming of pharmaceutical proteins.</a> Transgenic research. 9, 277-299 (2000).</li>
<li>Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosafety+of+molecular+farming+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22AgBiotechNet%22%5BJournal%5D)">The biosafety of molecular farming in plants.</a> AgBiotechNet. 5, 9 (2003).</li>
<li>Shoji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant-based+system+for+rapid+production+of+influenza+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Resp%22%5BJournal%5D)">A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens.</a> Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+Its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Berg, R. H., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+applications+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein applications in plants.</a> Method Cell Biol. 85, 153 (2008).</li>
<li>Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+is+not+alone%3A+gene+transfer+to+plants+by+viruses+and+other+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria.</a> Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).</li>
<li>Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transient+Agrobacterium-mediated+gene+expression+system+in+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana.</a> Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+heterogeneous+biomass%3A+Overcoming+the+hurdles+in+model+building%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building.</a> Bioengineered. 4, (2013).</li>
<li>Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP+issues+for+recombinant+plant-derived+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins.</a> Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).</li>
<li>Daniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-at-a-time+plans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">One-at-a-time plans.</a> Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).</li>
<li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Factor-at-a-Time+versus+Designed+Experiments+The+American+Statistician%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician.</a> 53, 6 (1999).</li>
<li>Anderson, M. J., Kraber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keys+to+successful+designed+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ASQ+-+The+global+voice+of+quality%22%5BJournal%5D)">Keys to successful designed experiments.</a> ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).</li>
<li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMontgomery%2C+DC+%22Design+and+Analysis+of+Experiments%22">Design and Analysis of Experiments</a>. , John Wiley & Sons Inc. (2007).</li>
<li>Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMyers%2C+RH+%22Response+Surface+Methodology%3A+Process+and+Product+Optimization+Using+Designed+Experiments%22">Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments</a>. , Wiley. (2009).</li>
<li>Piepel, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programs+for+generating+extreme+vertices+and+centroids+of+linearly+constrained+experimental+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Qual+Technol%22%5BJournal%5D)">Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions.</a> J Qual Technol. 20, 15 (1988).</li>
<li>FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).</li>
<li>Shivhare, M., McCreath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Considerations+for+DoE+Implementation+in+Quality+By+Design%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design.</a> BioProcess International. 8, 9 (2010).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+transient+protein+expression+in+tobacco+%28Nicotiana+tabacum+L.%29+can+optimize+process+time%2C+yield%2C+and+downstream+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs.</a> Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).</li>
<li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter%2F5%27UTR+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , Productivity Inc. (2000).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22Response+Surface+Methods+Simplified%22">Response Surface Methods Simplified</a>. , Productivity Press. (2005).</li>
<li>De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+correct+intervals+for+prediction%3A+A+tutorial+on+tolerance+intervals+for+ordinary+least-squares+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometr+Intell+Lab%22%5BJournal%5D)">Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression.</a> Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).</li>
<li> Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li> PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li>Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transformation+of+Escherichia-Coli+with+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+protocols+for+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation protocols for Agrobacterium.</a> Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).</li>
<li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vienna+RNA+websuite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).</li>
<li>Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+immobilization+of+an+antibody+fragment+to+a+carboxymethylated+dextran-linked+biosensor+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface.</a> J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).</li>
<li>Newcombe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+biosensor+assay+to+quantify+polyclonal+IgG+in+ovine+serum+used+for+the+production+of+biotherapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments.</a> Process Biochem. 41, 842-847 (2006).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+Variable+Selection+in+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 41, 311-313 (1987).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Property+of+Well-Formulated+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 44, 26-30 (1990).</li>
<li>Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cauliflower+mosaic+virus+35S+and+nopaline+synthase+promoters+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants.</a> Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).</li>
<li>Ma, J. K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Assembly+of+Secretory+Antibodies+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants.</a> Science. 268, 716-719 (1995).</li>
<li>Wycoff, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+antibodies+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Design%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA antibodies from plants.</a> Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).</li>
<li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).</li>
</ol>

La tassa di pubblicazione è stato in parte sponsorizzato da aziende Statease, Inc. (USA) e Statcon (Germania), che non sono stati coinvolti nella coinvolti nella preparazione del manoscritto o responsabile per qualsiasi dei suoi contenuti.

Ogni esperimento richiede un&#39;attenta pianificazione, perché le risorse sono spesso scarse e costose. Ciò è particolarmente vero per le strategie DoE perché errori durante la fase di pianificazione (ad esempio la selezione di un modello di base che non copre tutte le interazioni significative dei fattori) possono diminuire sostanzialmente il potere predittivo dei modelli risultanti e quindi svalutare l&#39;intero esperimento. Tuttavia, questi errori possono essere facilmente evitati seguendo procedure di bas...

La produzione di proteine ​​biofarmaceutiche nelle piante è vantaggiosa perché le piante sono economici a crescere, la piattaforma può essere scalata solo crescendo più piante e patogeni umani sono in grado di replicare 1,2. Strategie espressione transiente basate per esempio sulla infiltrazione di foglie con Agrobacterium tumefaciens offre ulteriori vantaggi perché il tempo tra il punto di consegna del DNA e la consegna di un prodotto purificato è ridotto da anni a meno di 2 mesi 3. Espressione transiente è utilizzato anche per l&#39;analisi funzionale, ad esempio per testare geni per la loro capacità di complementare perdita di funzione mutanti o per indagare le interazioni proteina 4-6. Tuttavia, i livelli di espressione transiente tendono a mostrare una maggiore variazione da lotto a lotto di livelli di espressione in piante transgeniche 7-9. Ciò riduce la probabilità che i processi di produzione biofarmaceutica basati su espressione transiente will essere approvato nel contesto delle buone prassi di fabbricazione (GMP), perché la riproducibilità è un attributo di qualità critico ed è soggetta a valutazione del rischio 10. Tale variazione può anche mascherare tutte le interazioni che i ricercatori intendono studiare. Pertanto, abbiamo deciso di identificare i principali fattori che influenzano i livelli di espressione transitori nelle piante e per costruire un modello predittivo quantitativo di alta qualità. L&#39;approccio a un fattore-at-a-tempo (OFAT) è spesso usato per caratterizzare l&#39;impatto (effetto) di alcuni parametri (fattori) sull&#39;esito (risposta) di un esperimento 11. Ma questo è ottimale perché le prove individuali (va) durante l&#39;indagine (esperimento) saranno allineati come perle di una collana attraverso l&#39;area potenziale attraversato dai fattori che vengono testati (spazio di progettazione). La copertura dello spazio di progettazione e quindi il grado di informazioni derivate da dell&#39;esperimento èbasso, come mostrato nella Figura 1A 12. Inoltre, interdipendenze tra diversi fattori (interazioni factor) possono rimanere nascosti conseguente modelli poveri e / o la previsione di falsa Optima, come mostrato nella Figura 1B 13. Gli inconvenienti sopra descritti possono essere evitati utilizzando un disegno di avvicinamento esperimenti (DOE) in cui viene eseguito su un esperimento sono sparsi in modo più uniforme in tutto lo spazio di progettazione, il che significa che più di un fattore è variata tra due piste 14. Ci sono disegni specializzati per le miscele, screening fattori (disegni fattoriali) e la quantificazione degli impatti dei fattori sulle risposte (metodi di superficie di risposta, RSM s) 15. Inoltre, RSMS possono essere realizzati come disegni centrali-composito ma possono anche essere realizzati efficacemente con software specializzato che può applicare diversi criteri per la selezione di piste. Ad esempio, il cosiddetto D-optimality criterio selezionerà corre in modo da minimizzare l&#39;errore nei coefficienti del modello risultante, mentre il criterio IV-ottimalità seleziona piste che raggiungono la varianza previsione basso tutto lo spazio di progettazione 15,16. La RSM descriviamo qui permette la quantificazione precisa espressione transiente della proteina nelle piante, ma può essere facilmente trasferito su qualsiasi sistema che coinvolge vari (~ 5-8) fattori numerici (ad esempio temperatura, tempo, concentrazione) e alcuni (~ 2 - 4) fattori categorici (es. promoter, colore) in cui una descrizione meccanicistica non è disponibile o troppo complesso per modellare. L&#39;approccio DoE origine nelle scienze agrarie, ma si è diffuso ad altre zone, perché è trasferibile a qualsiasi situazione in cui è utile per ridurre il numero di corse necessarie per ottenere dati affidabili e generare modelli descrittivi per processi complessi. Questo a sua volta ha portato all&#39;inserimento del DoE nella &quot;Guida perIndustria, Q8 (R2) Pharmaceutical Development &quot;, pubblicato dalla Conferenza internazionale sull&#39;armonizzazione dei requisiti tecnici per la registrazione dei prodotti farmaceutici per uso umano (ICH) 17. DoE è ormai ampiamente utilizzato nella ricerca scientifica e l&#39;industria 18. Tuttavia, la cura deve essere presa durante la pianificazione e l&#39;esecuzione dell&#39;esperimento, perché la scelta di un grado del polinomio improprio per il modello multi-lineare di regressione (modello base) possono introdurre la necessità di corse aggiuntive per modellare correttamente tutti gli effetti dei fattori. Inoltre, danneggiati o dati mancanti generano modelli errati e viziata previsioni, e può anche impedire qualsiasi tentativo di costruzione del modello, come descritto nel protocollo e discussione sezioni 18. Nella sezione Protocollo, ci sarà inizialmente stabilito le fasi di pianificazione più importanti per un esperimento a base di RSM e poi spiegare il progetto sulla base del DoE software DesignExpert v8.1., ma disegni simili possono essere costruiti con altri includi softwareng JMP, Modde, e STATISTICA. Le procedure sperimentali sono seguite da istruzioni per l&#39;analisi e la valutazione dei dati. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1.jpg" /> Figura 1. Confronto di OFAT e DoE. A. Variazione sequenziale di un fattore alla volta (OFAT) in un esperimento (nero, rosso e blu cerchi) raggiunge una bassa copertura dello spazio di progettazione (regioni tratteggiate). Al contrario, la variazione di più di un fattore alla volta utilizzando la progettazione di esperimenti (DoE) strategia (cerchi verdi) migliora la copertura e quindi la precisione dei modelli risultanti. B. La copertura dello spazio di progettazione di parte significa che gli esperimenti OFAT (cerchi neri) può anche non riuscire a identificare le regioni operative ottimali (rosso) e prevedere soluzioni sub-ottimali (grande cerchio nero), mentre DoE strategies (stelle nere) sono più propensi a identificare le condizioni preferibili (grande black star).

<table><tbody><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>software</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8952.2</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2363.2</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K029.2</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5210.2</td><td>Componente del</td></tr> <tr><td>Escherichia coli K12 DH5a</td><td>Life Technologies</td><td>18263-012</td><td>Microrganismo</td></tr><tr><td>pPAM</td><td>GenBank</td><td>AY027531</td><td>Vettore di clonazione/espressione; &nbsp;</td></tr><tr><td>Plasmide NucleoSpin</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740588.250</td><td>Kit di isolamento del DNA plasmidico</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740609.250</td><td>Kit di purificazione del DNA plasmidico</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>n.a.Spettrofotometro</td><td></td></tr> <tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3193L</td><td>Restrizioneendonucleasi</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3101L</td><td>Restrizioneendonucleasi</td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td>Restrizioneendonucleasi</td></tr><tr><td>NEB 4</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B7004S</td><td>Tampone endonucleasi di restrizione</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Tetraborato di disodio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4403.3</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8040.2</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6352.4</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A512.1</td><td>Indicatore di colore</td></tr><tr><td>Xilene cianolo</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A513.1</td><td>Indicatore di colore</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>7530.2</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>BioRad</td><td>170-4406</td><td>Camera per elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101:pMP90RK</td><td>DSMZ</td><td>12365</td><td>Microrganismo</td></tr><tr><td>Electroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td>4307000.658</td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>Estratto di manzo</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X975.2</td><td>Componente del fluido</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2365.2</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0261.3</td><td>Componente</td></tr> <tr>del supporto<td>Carbenicillina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6344.2</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T832.3</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4163.2</td><td>Antibiotico</td></tr><tr><td>FWD primer</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCT</td> <td>CAG GAA GAG CAA TAC</td></tr><tr><td>REV primer</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCA</td> <td>AAG CGA GTA CAC AAC</td></tr><tr><td>2720 Termociclatore</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359659</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>RNAfold webserver</td><td>Università di Vienna</td><td>n.a.Software</td><td></td></tr> <tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Fertilizzante</td></tr><tr><td>Grodan Rockwool Cubs 10 x10 cm</td><td>Grodan</td><td>n.a.Rockwool</td> <td>block</td></tr><tr><td>Serra</td><td>n.a.n.a.Per</td><td></td> <td>la coltivazione</td></tr> <tr><td>di piantePhytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Per</td> <td>la coltivazione di piante</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo</td><td>B. Braun</td><td>6064204</td><td>Siringa</td></tr><tr><td>Sali di Murashige e Skoog</td><td>Duchefa</td><td>M 0222.0010</td><td>Componente del terreno</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.2</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Phytohormon analogon</td></tr><tr><td>&nbsp; Biofotometro plus</td><td>Eppendorf</td><td>6132 000.008</td><td>Fotometro</td></tr><tr><td>Osram bianco freddo 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Sorgente luminosa</td></tr><tr><td>Fosfato disodico</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Centrifuga 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Centrifuga</td></tr><tr><td>Forma -86C Congelatore ULT</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Congelatore</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Lettore di piastre a fluorescenza</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>n.a.SPR</td> <td>dispositivo</td></tr><tr><td>Protein A</td><td>Life Technologies</td><td>10-1006</td><td>Proteina legante gli anticorpi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>2G12 anticorpo</td><td>Anticorpo di riferimento Polymun</td><td>AB002</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione dei sistemi complessi utilizzando il design of experiments approccio: transient protein expression in tabacco come un caso di studio

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Le piante offrono molteplici vantaggi per la produzione di biofarmaci tra cui bassi costi, scalabilità e sicurezza. Espressione transiente offre il vantaggio supplementare di brevi tempi di sviluppo e di produzione, ma i livelli di espressione può variare notevolmente tra i lotti dando così luogo a preoccupazioni di regolamentazione nel contesto delle buone prassi di fabbricazione. Abbiamo usato un disegno degli esperimenti (DoE) approccio per determinare l&#39;impatto dei principali fattori, quali elementi di regolamentazione del costrutto di espressione, la crescita delle piante e parametri di sviluppo, e le condizioni di incubazione durante espressione, sulla variabilità di espressione tra i lotti. Abbiamo testato piante che esprimono un modello anti-HIV anticorpo monoclonale (2G12) e una proteina marcatore fluorescente (DsRed). Discutiamo il razionale per la selezione di alcune proprietà del modello e identificare i suoi potenziali limiti. L&#39;approccio generale può essere facilmente trasferito ad altri problemi perché i principi del modello unre ampiamente applicabile: la selezione dei parametri basata sulla conoscenza, la riduzione della complessità suddividendo il problema iniziale in moduli più piccoli, l&#39;installazione guidata dal software di combinazioni ottimali di esperimento e graduale aumento del design. Pertanto, il metodo non è solo utile per caratterizzare l&#39;espressione della proteina nelle piante, ma anche per la ricerca di altri sistemi complessi privi descrizione meccanicistica. Le equazioni predittive che descrivono l&#39;interconnettività tra i parametri possono essere utilizzati per stabilire modelli meccanicistici per altri sistemi complessi.

Un modello descrittivo per l&#39;accumulo DsRed durante espressione transiente utilizzando diversi promotori e 5&#39;UTRs Fluorescenza DsRED in estratti di foglie è stato usato per indicare il livello di espressione della proteina ricombinante e quindi è stato usato come la risposta nella strategia DoE. La differenza minima rilevabile abbiamo considerato rilevante era di 20 mcg / ml e la deviazione standard stimata del sistema era di 8 mg / ml in base a esperimenti iniziali....

Descriviamo un disegno di esperimenti approccio che può essere utilizzato per determinare e modellare l&#39;influenza del transgene elementi regolatori, parametri di crescita e sviluppo delle piante, e condizioni di incubazione sulla espressione transiente di anticorpi monoclonali e proteine ​​reporter nelle piante.

Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare modelli predittivi per l'espressione transitoria di proteine nelle foglie delle piante. Ciò si ottiene mettendo a punto un disegno sperimentale per identificare i parametri più importanti per l'espressione transitoria e quantificare il loro impatto sull'accumulo di proteine. In una seconda fase, i geni vengono clonati e trasferiti in agrobatteri, che vengono poi iniettati nelle foglie con conseguente espressione proteica transitoria.I campioni di foglie successive vengono analizzati per determinare i livelli di espressione proteica. Si ottengono risultati che mostrano il pattern dei livelli di espressione proteica transitoria in foglie di diverse età e per diverse condizioni di incubazione sulla base di un disegno di valutazione del modello sperimentale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un fattore alla volta, è che le interazioni tra diversi parametri come l'età delle foglie o la posizione delle foglie possono essere rilevate e quantificate.L'approccio "un fattore alla volta" che viene spesso utilizzato per caratterizzare l'effetto di determinati fattori sul risultato di u

characterization-complex-systems-using-design-experiments-approach

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Fonte: Rufián, J. S., et al. Analisi a singola cellula dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae nel tessuto vegetale. J. Vis. Esp. (2022).Questo video dimostra un metodo per analizzare l'espressione genica in batteri patogeni estratti dalle piante a livello di singola cellula utilizzando un fattore di trascrizione marcato fluorescente. L'imaging confocale rivela eterogeneità nell'espressione genica della virulenza, evidenziando la diversità funzionale all'interno di una popolazione...

Analisi a singola cellula dell'espressione genica da patogeni estratti da piante

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Piante di tabacco sono stati usati per produrre una cellulasi fungine, TrCel5A, tramite un sistema di espressione transiente. L'espressione potrebbe essere monitorato utilizzando una proteina di fusione fluorescente, e l'attività della proteina è stata caratterizzata post-espressione.

Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In piante di tabacco

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

A livello subcellulare, gli eventi di segnalazione sono modulati dinamicamente da segnali di sviluppo e ambientali. Qui descriviamo un protocollo che impiega il sistema di espressione transitoria del tabacco per monitorare l'interazione dinamica proteina-proteina e per rivelare l'organizzazione spaziale della trasduzione del segnale nelle cellule vegetali.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Una metodologia high-throughput, la produzione di protoplasti di tabacco automatizzata e la trasformazione è descritto. Il sistema robotico consente l'espressione genica massicciamente parallelo e la scoperta nel sistema modello BY-2 che dovrebbe essere traducibile di colture non-modello.

Una piattaforma robotica per high-throughput Protoplast Isolamento e Trasformazione

Studiare canali ionici, attraverso un sistema di espressione eterologhi è diventata una tecnica di base nella ricerca biomedica. In questo manoscritto, presentiamo un metodo efficiente tempo per realizzare canali ionici strettamente controllato eseguendo trasfezione transiente sotto il controllo di un promotore inducibile.

Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

L'espressione eterologa transitoria degli enzimi biosintetici in foglie di Nicotiana benthamiana può deviare endogene forniture di 2,3-oxidosqualene verso la produzione di nuovi prodotti ad alto valore triterpenici. Qui è descritto un protocollo dettagliato per produzione preparativo-scala rapidamente (5 giorni) di triterpeni e analoghi utilizzando questa potente piattaforma di origine vegetale.

Espressione transiente in Nicotiana Benthamiana lascia per produzione del Triterpene su scala preparativa

Impara a generare modelli predittivi per l'espressione transitoria di proteine in foglie di tabacco utilizzando il design of experiments. Questo metodo ottimizza la produzione di anticorpi monoclonali in piante.

Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio (Video) | JoVE Journal

Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

Esplora altri video