Caratterizzazione dei sistemi complessi Utilizzando il Design of Experiments Approccio: Transient Protein Expression in tabacco come un caso di studio

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare modelli predittivi per l'espressione transitoria di proteine nelle foglie delle piante. Ciò si ottiene mettendo a punto un disegno sperimentale per identificare i parametri più importanti per l'espressione transitoria e quantificare il loro impatto sull'accumulo di proteine. In una seconda fase, i geni vengono clonati e trasferiti in agrobatteri, che vengono poi iniettati nelle foglie con conseguente espressione proteica transitoria.

I campioni di foglie successive vengono analizzati per determinare i livelli di espressione proteica. Si ottengono risultati che mostrano il pattern dei livelli di espressione proteica transitoria in foglie di diverse età e per diverse condizioni di incubazione sulla base di un disegno di valutazione del modello sperimentale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un fattore alla volta, è che le interazioni tra diversi parametri come l'età delle foglie o la posizione delle foglie possono essere rilevate e quantificate.

L'approccio "un fattore alla volta" che viene spesso utilizzato per caratterizzare l'effetto di determinati fattori sul risultato di un esperimento non è ottimale perché le singole esecuzioni durante un esperimento saranno allineate come perle su un filo, ottenendo così una bassa copertura dello spazio di progettazione. In contrasto con la progettazione degli esperimenti della strategia DOE, la variazione di più di un fattore alla volta migliora la copertura e quindi la precisione dei modelli risultanti. Inoltre, la copertura dello spazio di progettazione distorta è un fattore alla volta.

Gli esperimenti possono anche non riuscire a identificare le regioni operative ottimali e prevedere soluzioni non ottimali, mentre le strategie DOE hanno maggiori probabilità di identificare le condizioni preferibili. Questo diagramma di flusso illustra il processo di pianificazione di una strategia DOE. Il primo passo consiste nell'identificare i fattori e le risposte rilevanti per l'inclusione nel progetto.

In questa dimostrazione verranno misurati i livelli di espressione di un modello di anticorpo monoclonale anti HIV due G 12 e di un marcatore fluorescente, la proteina DS rosso, sulla base di precedenti esperimenti. La differenza minima rilevabile considerata pertinente sarà di 10 microgrammi per millilitro per due G 12 e di 20 microgrammi per millilitro per il rosso DS. Inoltre, i valori approssimativi per la deviazione standard stimata del sistema per due G 12 e DS rossi saranno rispettivamente di quattro e otto microgrammi per millilitro.

I passi rimanenti per la pianificazione di questa strategia del DOE non saranno discussi qui, ma i dettagli possono essere trovati nel manoscritto di accompagnamento. Due G 12 e DS red saranno espressi transitoriamente nelle piante di tabacco. Per iniziare la procedura per la coltivazione delle piante, preparare blocchi di parete rocciosa di 10 x 10 x otto centimetri facendoli lampeggiare ampiamente con acqua deionizzata per rimuovere le sostanze chimiche residue.

Dopodiché, equilibra i blocchi con una soluzione appena preparata di fertilizzante semi di piante di tabacco posizionando uno o due semi di tabacco su ciascun blocco di parete rocciosa, seguiti da un breve risciacquo con fertilizzante. Fai attenzione a evitare di lavare via i semi, germina e coltiva le piante di tabacco per 42 giorni in serra in condizioni adeguate. Preparare l'AUM FASS coltivando una coltura fino a un OD 600 nanometri di 5,0.

Diluire la coltura con acqua e doppio mezzo di infiltrazione in modo che corrisponda al diametro esterno di 600 nanometri necessari per l'iniezione prima dell'iniezione. Confermare il OD 600 nanometri dell'atum della sospensione di fasione per preparare le foglie per l'iniezione. Grattare delicatamente l'epidermide nel sito di iniezione con la punta di una pipetta per facilitare l'afflusso della soluzione AUM Fasion.

Evitare di rompere la lamina fogliare mentre lo si fa. Tenere la siringa contenente la sospensione di fase AUM perpendicolare alla lamina fogliare, toccando il fusto contro il campo intercostale da trattare, spingere delicatamente l'uscita sul lato inferiore della foglia. Allo stesso tempo, premere delicatamente il lato superiore della foglia per evitare che la lamina della foglia si sposti o si rompa.

Spingere delicatamente verso il basso il pistone della siringa. La soluzione di moda AUM entrerà negli spazi intercellulari all'interno della lamina fogliare come indicato dalle aree trattate che appaiono più scure, verdi e umide. Assicurarsi che la siringa rimanga perpendicolare alla foglia durante l'iniezione.

In caso contrario, la sospensione batterica potrebbe fuoriuscire ad alta pressione. Ripetere questa procedura in più posizioni fino a quando l'intero campo intercostale non è infiltrato con aum, aum, fass. Quindi continuare con il campo intercostale successivo dopo l'iniezione, incubare le piante nelle condizioni determinate dal DOE quando il periodo di incubazione è completo.

Iniziare il campionamento. Stabilizzare la foglia con un tovagliolo di carta portatile e utilizzare un prestito di sughero per rimuovere da quattro a cinque dischi fogliari dai campi intercostali trattati nelle posizioni e nei tempi indicati dal DOE. Non rimuovere l'intera foglia dalla pianta durante il campionamento.

Determinare la massa di ciascun campione e metterlo in una provetta di reazione di plastica da 1,5 millilitri etichettata con il nome e la massa del campione. Conservare i campioni a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius o di -80 gradi Celsius prima della quantificazione delle proteine. In questa fase il processo può essere sospeso per diversi mesi, a seconda della stabilità del campione e della temperatura di conservazione per estrarre le proteine dai campioni di disco fogliare.

Aggiungere tre millilitri di tampone di estrazione per milligrammo di massa del campione e macinare i dischi fogliari nella provetta di reazione utilizzando un pestello elettrico fino a quando non rimangono frammenti di grandi dimensioni. Per evitare il surriscaldamento del campione, posizionare la provetta sul ghiaccio ogni volta che la provetta si scalda dopo la centrifugazione. Per rimuovere i solidi dispersi, trasferire il surnatante in un tubo di reazione pulito da 1,5 millimetri.

Misurare la fluorescenza rossa DS due volte in sequenza. In un lettore ben 96 ben riprodotto dotato di 530 filtri di eccitazione a 25 nanometri e 590 filtri di emissione a 35 nanometri per ogni campione. Fare la media della fluorescenza sulle due letture e sulle tre repliche tecniche e sottrarre il valore registrato per il controllo in bianco contenente zero microgrammi per millilitro DS rosso.

Sottrarre anche questo valore dalle lamelle delle diluizioni standard e utilizzare questi valori corretti in bianco per una regressione lineare che produce una curva di riferimento. La pendenza della curva di riferimento viene quindi utilizzata per convertire la fluorescenza misurata per i campioni in concentrazioni di rosso DS. La procedura per determinare la concentrazione dei due anticorpi G 12 non sarà illustrata qui, ma è descritta in dettaglio nel manoscritto allegato.

Il software Design Expert viene utilizzato per l'analisi e la valutazione dei dati nel nodo di analisi. Scegliere la risposta da analizzare e selezionare inizialmente nessuna nella scheda di trasformazione. Passare alla scheda di riepilogo dell'adattamento, che fornisce informazioni generali sui fattori importanti per il sistema oggetto di indagine.

Il software suggerirà un modello iniziale in base al suo significato nella scheda del modello. Un modello iniziale viene preselezionato in base ai risultati del riepilogo di adattamento. Utilizzare la modalità automatica per modificare questo modello nella scheda Innova.

Se necessario, esaminate il modello suggerito e i fattori inclusi. Rimuovere manualmente tutti i fattori con valori P superiori a una soglia predefinita o quelli improbabili in base a considerazioni meccanicistiche tornando alla scheda del modello, modificando la selezione in manuale ed eliminando i fattori appropriati dal modello. Passare alla scheda di diagnostica per confermare la qualità del modello e rilevare potenziali valori anomali nel set di dati che hanno una forte influenza sul modello.

Esaminando tutte le schede dello strumento di diagnostica, regolare il tipo di trasformazione nella scheda corrispondente, se suggerito dalla casella Grafico di Cox, e riavviare la procedura di analisi nella scheda Grafici del modello. Visualizzare il modello valutato per un numero limitato di fattori numerici, ad esempio tre. La rappresentazione della superficie di risposta è utile per valutare le caratteristiche ottimali.

Le superfici di risposta manuale illustrano solo l'impatto di due fattori sulla risposta oggetto dell'indagine. L'effetto di qualsiasi fattore aggiuntivo sulla risposta viene rivelato modificandone il valore o il livello nella finestra degli strumenti dei fattori. In alternativa, i fattori possono essere assegnati all'asse del grafico facendo clic con il pulsante destro del mouse su di essi nella finestra degli strumenti dei fattori e selezionando l'asse delle variabili indipendenti desiderato.

Manipola i livelli dei fattori e assegnali alle coordinate del grafico utilizzando lo strumento dei fattori. Esportare i grafici utilizzando il comando Esporta grafico su file nella scheda File. Utilizzare il sottonodo numerico nel nodo di ottimizzazione per ottimizzare numericamente la risposta desiderata, a seconda dei fattori del modello a cui a loro volta possono essere applicati determinati vincoli tramite la scheda dei criteri.

Calcola ed esamina le soluzioni numeriche nella scheda delle soluzioni in base all'input fornito nella scheda dei criteri. Esporta queste soluzioni in altri software, ad esempio un foglio di calcolo, per ulteriori analisi che rivelano le impostazioni dei fattori associate a valori di risposta alti o bassi. Ciò è utile se vengono studiati più di tre fattori numerici e la rappresentazione 3D è difficile in questo studio rappresentativo.

La strategia DOE è stata utilizzata per esaminare gli effetti di diversi promotori e cinque RS primi sull'espressione transitoria di ds. I fattori rossi inclusi nel modello di espressione transitoria e gli intervalli indagati sono mostrati in questa tabella. I fattori in grassetto sono unici per questo esperimento.

I fattori in corsivo sono per un altro esperimento che verrà descritto più avanti. Sono stati selezionati almeno tre livelli per tutti i fattori numerici discreti per consentire il calcolo di un modello di base quadratico. Per la selezione delle esecuzioni DOE è stato scelto un algoritmo di selezione ottimale per ottenere le stime più accurate per i coefficienti del modello di regressione.

Il progetto inizialmente suggerito dall'esperto di progettazione consisteva in 90 esecuzioni, ma l'FDS era insufficiente per ottenere un errore standard di previsione dell'1%. L'aumento ottimale del progetto per un totale di 210 esecuzioni ha risolto questo problema e ha portato a un FDS del 100% con un'accuratezza di previsione più uniforme nello spazio di progettazione indicato dalla curva piatta, le concentrazioni rosse DS sono state determinate per tutte le 210 esecuzioni e i dati sono stati trasformati in log 10. I fattori del modello sono stati scelti mediante selezione automatica a ritroso da un modello cubico con un livello alfa di 0,100.

Ciò ha portato a un modello significativo con una mancanza di adattamento insignificante e valori elevati per i coefficienti di correlazione multipli. Il valore P di tutti i fattori del modello era inferiore a 0,05 e quindi non era necessaria alcuna ulteriore manipolazione manuale del modello. Il modello conteneva tre interazioni fattoriali evidenziate in grassetto che non facevano parte della rivalutazione iniziale del modello di base quadratico del grafico FDS.

L'utilizzo di tutti i fattori inclusi nel modello di previsione finale ha rivelato che l'FDS per l'errore standard di previsione non era diminuito significativamente includendo le interazioni aggiuntive a tre fattori. Gli strumenti diagnostici per la qualità del modello in Design Expert hanno indicato che la trasformazione dei dati era utile e che non c'erano fattori mancanti nel modello perché il normale grafico dei residui mostrava un comportamento lineare e non era stato osservato alcun modello specifico nei residui rispetto al grafico previsto. Inoltre, non c'è stata alcuna tendenza nel corso dell'esperimento per indicare una variabile dipendente dal tempo nascosta.

Invece, le previsioni del modello erano in ottimo accordo con la fluorescenza rossa di Diaz osservata, poiché tutti i punti si trovano vicino alla diagonale. Si è quindi ipotizzato che il modello selezionato fosse utile per prevedere l'espressione transitoria del rosso DS nelle foglie di tabacco non leadine derivate da diverse combinazioni di UTR prime di cinque promotori durante un periodo di incubazione post-infiltrazione della durata di otto giorni, ed è stato selezionato anche un modello di regressione lineare artificiale senza trasformazione dei dati per illustrare le conseguenze di un'errata selezione e trasformazione dei fattori. Come si vede chiaramente qui, il normale grafico dei residui si discosta dal comportamento lineare atteso e c'è un modello a forma di V nel grafico dei residui rispetto a quello previsto invece di una dispersione casuale.

Inoltre, il grafico dei residui rispetto alla corsa evidenzia due valori estremi. Mentre le previsioni erano scarse sia per i valori piccoli che per quelli alti che si discostano dalla diagonale, le superfici di risposta ottimali del modello per l'espressione transitoria del rosso DS nelle foglie di tabacco sono mostrate qui. Il modello ha previsto che l'età delle foglie fosse un fattore significativo con livelli di espressione più bassi nelle foglie vecchie, ad esempio la foglia due nel lotto A e nel lotto B rispetto alle foglie giovani come la foglia sei nel lotto C e nel grafico D. La progressione dell'accumulo di rosso DS nelle foglie non era lineare o esponenziale, ma seguiva una curva sigmoidale durante gli otto giorni di incubazione post-infiltrazione.

Le cinque combinazioni principali di UTR con il promotore CAMV 35 SS hanno portato a una più forte espressione del rosso DS rispetto alle combinazioni con il promotore NOS. Sebbene anche i cinque UTR primi abbiano avuto un impatto significativo sull'espressione destra di DS, come mostrato dal confronto tra TL e CHS, la forza di espressione dipendeva dal promotore di accompagnamento. Il modello predittivo ha anche indicato che alcune coppie di combinazioni di UTR principali del promotore, come nas CHS e CAMV 35 SS, CHS hanno portato a livelli di espressione bilanciati che differiscono di meno del 30% da un rapporto definito su tutte le foglie e tempi di incubazione superiori a due giorni.

Tale espressione bilanciata sarebbe utile per l'espressione di proteine multimeriche con una stechiometria definita. L'approccio DOE è stato utilizzato anche per ottimizzare le condizioni di incubazione e gli schemi di raccolta per la produzione simultanea di due G 12 e DS red nel tabacco. I fattori che influenzano l'espressione transitoria che sono stati inclusi in questo esperimento sono in corsivo di 600 nanometri e tempo di incubazione.

È stato stabilito un modello predittivo per l'espressione di ciascuna proteina in piante di età diverse. Le foglie giovani sono state raccolte 40 giorni dopo la semina, le foglie vecchie sono state raccolte 47 giorni dopo la semina. Questi quattro modelli sono stati quindi valutati e si è stabilito un modello di consenso che includeva ogni fattore ritenuto significativo nei singoli modelli.

Successivamente è stato confermato che il modello di consenso era ancora una buona rappresentazione di tutti i set di dati iniziali. Il modello di consenso è stato successivamente utilizzato per identificare le temperature di incubazione ottimali e i 600 nanometri di OD batterico per entrambe le proteine per prevedere le concentrazioni proteiche in tutte le foglie e le posizioni fogliari nelle piante giovani e vecchie. L'integrazione dei profili di concentrazione con i dati sulla biomassa ha quindi portato alla resa proteica assoluta.

Le quantità proteiche assolute sono state quindi correlate con i costi a valle associati, consentendo un'analisi costi-benefici per la lavorazione di ogni foglia per età della pianta. La stessa quantità di DS rosso e circa il 65% di due G 12 è stata trovata nelle piante giovani rispetto a quelle vecchie, nonostante una biomassa media inferiore di circa il 50% che riflette la maggiore espressione proteica specifica nelle piante giovani. Ciò ha rivelato che le piante giovani erano vantaggiose per l'espressione transitoria perché le proteine raggiungevano concentrazioni più elevate durante periodi di crescita più brevi, nonostante la minore biomassa complessiva rispetto alle piante vecchie.

Infine, è stato anche riscontrato che la lavorazione di tutte le foglie delle vecchie piante era più costosa rispetto allo scarto delle foglie da una a tre e all'aumento del numero di piante per lotto. Pertanto, i modelli basati su DOE sono adatti non solo per segnare la fase finale di un esperimento, ma anche per la combinazione con altri dati per facilitare aspetti più complessi dell'analisi del processo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare, condurre e analizzare A DOE per studiare l'espressione proteica transitoria nelle piante.