Comprensione dei cambiamenti nella morfologia mitocondriale attraverso micrografie a fluorescenza dinamiche e tridimensionali

Lo scopo della nostra ricerca è osservare i cambiamenti nelle reti mitocondriali e indagare come queste reti mitocondriali cambiano in risposta alle condizioni cellulari. Utilizziamo strumenti open source come Fiji e Python, combinando librerie esistenti con macro e script personalizzati per automatizzare l'analisi della morfologia mitocondriale da dati complessi di microscopia a fluorescenza. Ottenere dati quantitativi e metriche affidabili che descrivano le dinamiche della fissione e della fusione mitocondriale con la loro localizzazione in 3D rimane una sfida.

La standardizzazione per tale generazione di dati non è comunemente disponibile. Pertanto, esistono conoscenze limitate sulla frequenza di fissione e fusione cellulare specifica e sulla localizzazione intracellulare. Abbiamo aggiunto il rilevamento della vita della fissione mitocondriale e della fusione alle metriche di ricerca disponibili.

E combinando questi con il conteggio della struttura mitocondriale, siamo stati in grado di definire una nuova metrica per comprendere le dinamiche delle reti mitocondriali. I nostri risultati ci permettono di caratterizzare i parametri di fissione e fusione specifici della cellula e per la prima volta determinare se il sistema mitocondriale è in equilibrio o in movimento. Ciò previene gravi interpretazioni errate dei fenotipi in salute e malattia e fornisce un quadro chiaro per una segnalazione accurata.

Per iniziare, aprire il file raw in ImageJ. Regola le impostazioni del colore per migliorare la visibilità della regione di interesse, ma non impostare nulla. Duplica l'immagine in base al numero di singole celle che devono essere analizzate.

Se in un campo visivo sono presenti più celle, passare ad Analizza, Strumenti e utilizzare gli strumenti Windows sincronizzati e Disegno a mano libera per disegnare un'area di interesse attorno a una cella di interesse, quindi selezionare Modifica e scegliere Cancella esterno per isolare la cella selezionata. Dividi i canali rosso e blu l'uno dall'altro e salva il canale mitocondriale come file tif. Per generare una funzione di diffusione punti o PSF, riaprire l'immagine raw.

Quindi apri il plug-in del generatore PSF selezionando Plug-in, quindi scegliendo Generatore PSF e selezionando il modello ottico 3D del lupo nato. Aprire le informazioni dell'immagine raw selezionando Immagine, quindi scegliendo Mostra informazioni o premendo I sulla tastiera. Scorrere fino alla fine della finestra delle informazioni sull'immagine.

Seleziona l'opzione dimensione e profondità del voxel e modifica la lunghezza d'onda a 568 nanometri. Imposta la dimensione dei pixel XY su 166,1 nanometri, il passo Z su 200 nanometri. Imposta la dimensione XYZ in modo che corrisponda a una risoluzione dell'immagine di 512 x 512 e configura lo stack Z in modo che contenga 10 sezioni Z.

Fare clic su Esegui. Salva la PSF come file tif nella sua cartella. Passa a Plugin, seleziona Macro, quindi scegli Modifica, seguito da Deconvolution_time_lapse_mine.

ijm per accedere alla macro di deconvoluzione. Modificare le righe di input e output in base alle esigenze e premere Esegui per eseguire la macro. Per il miglioramento del contrasto dell'immagine e la sfocatura, vai su Plugin, seleziona Macro, scegli Modifica e apri Pre-elaborazione.

ijm per accedere alla macro di pre-elaborazione. Eseguire la sottrazione dello sfondo impostando il raggio della sfera rotante su 6. Impostare il Sigma Filter Plus in modo che il raggio sia impostato su 1 volte il fattore di scala.

Il numero di pixel utilizzati è 2 e la frazione minima di pixel è 0,2, assicurando che il plug-in sia impostato per essere outlier aware. Regolare le impostazioni CLAHE configurando la dimensione del blocco su 64, i contenitori dell'istogramma su 256, la pendenza massima su 2,5 e la gamma su 0,8, quindi fare clic su Esegui. Aprire un file di interesse che è stato modificato utilizzando la Pre-elaborazione.

Macro ijm in ImageJ. Passa a Plug-in e seleziona Soglia adattiva. Imposta la soglia locale sulla media ponderata e regola la dimensione del blocco di pixel secondo necessità.

Fare clic su Anteprima e regolare la dimensione del blocco per includere chiaramente il maggior numero possibile di mitocondri. Modifica il valore di sottrazione per ogni cella per eliminare lo sfondo non necessario e prendi nota della micrografia risultante. Per ottimizzare il tempo, ordina le immagini in file in base al valore di sottrazione applicato.

Ora vai su Plugin, seleziona Macro, scegli Modifica e apri Soglia. ijm per accedere alla macro di soglia. Modifica lo script macro per definire i percorsi di input e output corretti, la dimensione del blocco e la sottrazione dei valori.

Fare clic su Esegui per eseguire la macro. Apri fino a 10 micrografie a soglia che appartengono alla stessa condizione di trattamento. Passa a Immagine, Pile, Strumenti e seleziona Concatena, quindi premi OK.To rimuovere i piccoli punti residui lasciati dalla soglia, vai su Plugin, seguito da Filtri immagine integrati, quindi seleziona Rimuovi valori anomali.

Usa l'anteprima per regolare con precisione le dimensioni X e Y per eliminare i frammenti. Salvare il file concatenato come file TIF. Infine, vai su Plugin, Macro, Modifica, QuickTest_new.ijm.

Modificare le righe del percorso di input e output in modo che puntino alle directory appropriate, fare clic su Esegui e visualizzare il localizzatore di eventi mitocondriali o i risultati MEL. Le dinamiche mitocondriali sono state tracciate nel tempo con punti rossi che segnano gli eventi di fissione e punti verdi che segnano gli eventi di fusione sia nelle viste 3D che 2D. Le reti mitocondriali hanno mostrato differenze specifiche di struttura nel tempo con forme più allungate e interconnesse nelle cellule trattate con metformina e reti altamente frammentate nelle cellule trattate con metformina CCCP Baf.

Il gruppo CCCP Baf della metformina ha mostrato un'attività di fissione e fusione significativamente più elevata rispetto ai gruppi di controllo o solo metformina, suggerendo un aumento del rimodellamento mitocondriale. Questo gruppo aveva anche una conta mitocondriale significativamente più alta, coerente con una maggiore frammentazione. Il volume mitocondriale è stato significativamente ridotto nello stesso gruppo, supportando ulteriormente uno spostamento verso la fissione.

Tuttavia, quando normalizzato al numero mitocondriale, il gruppo con sola metformina ha mostrato la più alta attività dinamica relativa, suggerendo che la metformina da sola promuove una rete di rimodellamento più attiva ed efficiente, mentre il co-trattamento guida un turnover strutturale ampio ma meno efficiente.