Un protocollo basato sulla fluorescenza per lo screening preliminare degli inibitori della sintesi proteica da fonti naturali

Un protocollo basato sulla fluorescenza per lo screening preliminare degli inibitori della sintesi proteica da fonti naturali. La sintesi proteica coinvolge processi altamente regolati, trascrizione e traduzione. La trascrizione è principalmente regolata da fattori di trascrizione, modifiche della cromatina e RNA regolatori.

Mentre la traduzione è regolata da fattori di iniziazione, vie di segnalazione e meccanismi di stabilità dell'RNA. Questi sistemi regolatori permettono alle cellule di mantenere le funzioni cellulari e di rispondere efficacemente allo stress o ai danni. Le cellule tumorali disregolano la sintesi proteica dirottando i meccanismi traslazionali per sostenere le loro elevate esigenze energetiche e la crescita incontrollata.

Questa riprogrammazione è il risultato di una disregolazione di quasi tutte le principali vie di segnalazione oncogeniche, che promuove la sopravvivenza, la proliferazione e la metastasi cellulare mentre sopprime le vie di morte cellulare. Poiché questa sintesi proteica potenziata è cruciale per la sopravvivenza al cancro, i trattamenti che mirano e bloccano questo processo mostrano potenziali terapie. Per identificare gli inibitori della sintesi proteica, si può utilizzare il seguente saggio di fluorescenza per inibizione della sintesi proteica.

Prima di iniziare l'esperimento, per ottenere risultati affidabili, i composti devono essere somministrati a una concentrazione appropriata al di sotto della soglia di tossicità. Per stabilire una concentrazione iniziale, dovrebbe essere eseguito un test di citotossicità per determinare la CE 50 del composto. Se ciò non è fattibile, i composti in questo saggio possono essere testati in modo dipendente dalla dose per determinare i parametri di concentrazione più efficaci.

Se la concentrazione dei composti provoca la morte cellulare, diventa necessario testare a concentrazioni ridotte. È inoltre importante proteggere i coloranti dalla luce in ogni momento in cui non vengono utilizzati. Un'esposizione prolungata alla luce causerà fotosbiancamento, che compromette la qualità dei dati.

Passo 3.1, prepara il mix master A, etichetta un tubo centrifuga come A, poi pipetta 598,5 microlitri di mezzo di coltura e 1,5 microlitri di proteina in A. Sospensi questa miscela per garantirne l'omogeneità pipettando su e giù. Ora prepara il master mix B. Etichetta un tubo centrifuga come B, poi pipetta 1,5 microlitri di etichettatura proteica, 6,6 microlitri di cicloessimide e 591,9 microlitri di mezzo di coltura in B. Risospensi questa miscela per garantire l'omogeneità pipettando su e giù. Dopo aver pipetato un microlitro di composto di prova e un microlitro di veicolo in due pozzi, si pipettano delicatamente 99 microlitri di master mix A in entrambi questi pozzi, pipetta ad angolo sul lato del pozzo per prevenire la rottura cinetica delle celle.

Pipetta 100 microlitri di master mix B in due pozzi non trattati. Pipetta ad angolo verso il lato del pozzo per prevenire la rottura cinetica delle cellule. Tocca delicatamente la piastra per ottenere un'integrazione completa dei componenti desiderati nelle cellule.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino a due ore. Rimuovere il mezzo di coltura cellulare tramite aspirazione. Inclinare la piastra e aspirare sul lato del pozzo invece che al centro per prevenire disturbi cinetici delle cellule.

Poi aggiungi 100 microlitri di PBS buffer in ogni pozzo e centrifuga la piastra a 900g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, ricorda di rimuovere il buffer PBS tramite aspirazione. Passo cinque, fissazione e permeabilizzazione.

Aggiungi 100 microlitri di soluzione fissativa in ogni pozzo. Poi incubare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti in un ambiente buio. Poi aspira le cellule.

Lavare le cellule con 100 microlitri di tampone di lavaggio e rimuovere tramite aspirazione. Ripeti questo due volte. Aggiungi 100 microlitri di buffer di permeabilizzazione a ciascun pozzo.

Dopodiché, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Rimuovere il buffer di permeabilizzazione tramite aspirazione. Sesto passo, reazione proteica e colorazione.

Prepara il mix master cocktail di reazione. Aggiungi 651 microlitri di buffer PBS a un tubo centrifuga. Poi aggiungi sette microlitri di reagente di rame 100x.

Poi sette microlitri di azide fluorescente. Infine, aggiungi 35 microlitri di agente riducente al tubo della centrifuga. Segui esattamente questo ordine quando aggiungi i reagenti, poi aggiungi 100 microlitri del cocktail di reazione in ogni pozzo.

Incubare le cellule per 30 minuti in un ambiente buio a temperatura ambiente per prevenire il fotosbiancamento. Centrifuga le celle a 900g per cinque minuti. Aspira, lava le cellule e poi aspira di nuovo.

Prepara una diluizione 1x di colorazione totale di DNA e aggiungi 100 microlitri a ciascun pozzo. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti in un ambiente buio per prevenire il fotosbiancamento. Centrifuga la piastra a 900g per cinque minuti.

Lavare le celle con 100 microlitri di tampone di lavaggio, rimuovere tramite aspirazione. Ripeti questo passaggio due volte. Infine, risospendere le cellule con 100 microlitri di PBS buffer raffreddato per prepararle all'immagini.

Otto passo, fare l'imaging. Inserisci la piastra nel lettore di piastre e imposta l'ingrandimento a 20 x. Analizzare la colorazione del nucleo con il canale GFP 469/525 nanometri.

Usa l'auto-bending e l'auto-focus per migliorare i risultati di immagiing. Analizzare la sintesi attiva delle proteine con il canale Texas Red 586/647 nanometri. Usa l'auto-bending e l'auto-focus per migliorare i risultati di immagiing.

Le sonde fluorescenti sono sensibili allo sbiancamento fotofluorescente, un fenomeno in cui una radiazione con luce fa perdere ai fluorofori le loro proprietà fluorescenti. I coloranti dovrebbero essere protetti dalla luce in ogni momento quando non vengono usati. Inoltre, il numero di scansioni all'interno di ogni pozzo e il tempo di tempo sotto luce irradiata devono essere limitati.

Un'esposizione prolungata alla luce causerà fotosbiancamento, che alla fine compromette la qualità dei dati. Vediamo i risultati rappresentativi. Qui si vedono cellule vive in verde e la sintesi attiva delle proteine è indicata dal rosso.

L'inibitore della sintesi proteica cicloessimide noto comporta una forte diminuzione della sintesi proteica come osservato nella figura 1B rispetto al DMSO di controllo negativo nella figura 1A, con meno luce fluorescente rossa emessa in modo inferiore. Il trattamento con il composto uno, come visto nella figura 1C, ha portato o al distacco cellulare o alla morte cellulare. Pertanto, non possiamo fare affermazioni definitive sulla sua attività di inibizione della sintesi proteica.

Questo richiede ulteriori studi di risposta alla dose per cercare di determinare se inibisca la sintesi proteica a concentrazioni più basse. Il composto due mostra un'inibizione moderata della sintesi proteica come indicato nella figura 1D. Questo saggio fluorometrico è uno strumento di ricerca prezioso e un metodo accessibile di biologia chimica per la formazione degli studenti universitari.

Fornendo un protocollo accessibile ed efficiente con un trattamento minimo dei dati, fornisce agli studenti esperienza pratica e tecniche moderne di scoperta di farmaci, accelerando il processo di scoperta di farmaci. Il protocollo impiega un substrato fluorescente e tecniche avanzate di microscopia fluorescente per rilevare e misurare sistematicamente le capacità inibitorie dei composti di prodotti naturali uno e due. Utilizzando la cicloessimide come inibitore di riferimento, entrambi i prodotti naturali hanno mostrato diversi livelli di inibizione della sintesi proteica.

Con la crescita della domanda di nuovi inibitori della sintesi proteica, questo approccio offre agli studenti universitari opportunità di ricerca significative, contribuendo al contempo ai progressi nelle terapie oncologiche.