Name: Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per lanalisi degli acidi nucleici specifici della sequenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Scopri le sonde di ibridazione divise per l'analisi degli acidi nucleici utilizzando l'aptamero fluorescente DAP-10-42. Questo metodo migliora la rilevazione delle sostituzioni di singoli nucleotidi con segnali senza marcatura.

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1. Progettazione del sensore aptamero di illuminazione divisa (SLAS) con DAP-10-42 come reporter di segnale
<ol>
	<li>Progettare le sequenze di due filamenti di oligonucleotidi di DNA non modificati che costituiscono SLAS. Utilizzare un frammento contenente nucleotidi (nts) 4,6-39 di DAP-10-42 (Tabella 1, Figura 1A).</li>
	<li>Convertire la sequenza dello stelo 1 (nts 1-8 e 36-42) in stem 1' rimuovendo un residuo di timina rigonfio nella posizione nt 5, accorciando lo stelo a 4 bp (nts 4,6-8 e 36-39) e aggiungendo un C-G bp terminale (Figura 1A, passaggio 1). Inoltre, uno dei filamenti SLAS contiene nts 9-29 della sequenza centrale DAP-10-42, mentre un altro filamento SLAS contiene nts 30-35 della sequenza.</li>
	<li>Estendere la sequenza 3'-terminale del frammento contenente nts 9-29 con d(GGTCAT) e la sequenza 5'-terminale del frammento nts 30-35 con d(ATGACC) per formare uno stelo 2 da 6-bp (Figura 1A, passaggio 2). NOTA: Le coppie di basi T4-A39, A6-T38, C7-G37 e G8-C36 dello stelo 1 in DAP-10-42 sono necessarie per la funzione di illuminazione dell'aptamero. La sequenza del gambo 1' può essere modificata solo al terminale bp e può essere una coppia di basi G-C, A-T, T-A o estesa con 1-2 coppie di basi secondo necessità. La sequenza del gambo 2 è arbitraria e può essere modificata. Tuttavia, si raccomanda di preservare la stabilità termodinamica dello stelo 2 a meno che la temperatura del saggio non venga aumentata oltre i 28 °C. L'accorciamento o la destabilizzazione dello stelo 2 impedisce il legame prematuro del colorante senza un bersaglio se si osserva un elevato fondo del test fluorescente basato su SLAS. È consentita anche la suddivisione della sequenza nucleotidica DAP-10-42 tra nts 28-29, 27-28 o 26-27 invece di nts 29-30 (Figura 1B).</li>
	<li>Per adattare lo SLAS progettato a un bersaglio o interesse dell'acido nucleico, estendere lo stelo 1' con sequenze di DNA complementari ai frammenti di legame bersaglio-bersaglio (bracci) attraverso i linker d(TT) (Figura 1A, passaggio 3). Questo produce le sequenze dei filamenti SLAS-U e SLAS-S che costituiscono la sonda.</li>
	<li>Rendere il braccio di legame del bersaglio di SLAS-S complementare a un frammento di 7-10 nt del bersaglio contenente il sito SNS e il braccio di legame al bersaglio di SLAS-U - complementare a un frammento di 15-25 nt del bersaglio adiacente al braccio di legame del bersaglio di SLAS-S (Tabella 1). NOTA: È facoltativo se collegare il braccio di rilegatura del bersaglio di SLAS-S a nt 4 o nt 39 della sequenza DAP-10-42 (Figura 1, braccio 1 o braccio 2, rispettivamente).</li>
	<li>Valutare la temperatura di fusione (Tm) dei duplex tra il bersaglio di interesse e i bracci di legatura del bersaglio di SLAS-S e SLAS-U utilizzando il Web Server UNAFold (unafold.org)19.<ol>
		<li>Fare clic sulla scheda DINAMelt nella parte superiore della pagina web; andare su Applicazioni e selezionare Ibridazione di fusione a due stati (Figura supplementare 3A). Nella pagina Ibridazione di fusione a due stati, inserire una delle sequenze interagenti nella casella di sinistra e un'altra nella casella di destra (Figura 3B supplementare). Assicurati che entrambe le sequenze siano in ordine da 5' a 3'. È possibile immettere più di una coppia di sequenze interagenti separandole con un punto e virgola.</li>
		<li>Nella parte inferiore della pagina, indicare la temperatura del test (22 °C), le concentrazioni di cationi monovalenti e bivalenti (20 mM e 25 mM, rispettivamente) in modo che corrispondano alle condizioni del test. Indicare la concentrazione delle sequenze interagenti.</li>
		<li>Premere Invia (Figura supplementare 3B). Osservare i risultati che includono la variazione di energia di Gibbs, la variazione di entalpia e la variazione di entropia del legame, nonché i valori di Tm per i duplex corrispondenti (Figura supplementare 3B).</li>
		<li>Assicurarsi che i valori Tm per i duplex tra il target completamente abbinato (M) e i bracci di fissaggio del target di SLAS-S e SLAS-U siano superiori alla temperatura del saggio, che è di 22 °C nel protocollo corrente. Qui, i valori di Tm erano rispettivamente di 32,2 °C e 74,4 °C (Figura supplementare 3C).</li>
		<li>Assicurarsi che il duplex tra SLAS-S e un target non corrispondente (MM) contenente un SNS abbia un Tm inferiore alla temperatura del saggio. Ciò garantisce un'elevata selettività del riconoscimento sonda-bersaglio, impedendo al fluorogeno AO di segnalare la presenza dell'analita di acido nucleico mirato se contiene un SNS nel frammento legante SAS (Figura 2). Qui, il Tm era di 21,3 °C (Figura supplementare 3C), che era sufficiente per discriminare la discrepanza dal complesso abbinato.</li>
		<li>Regolare le sequenze dei bracci di legatura del bersaglio accorciando o estendendo i frammenti complementari al bersaglio, se necessario, per soddisfare i requisiti di stabilità indicati.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ottenere i filamenti progettati SLAS-S e SLAS-U da qualsiasi fornitore commerciale che fornisca oligonucleotidi di DNA su misura o sintetizzare i filamenti di DNA internamente utilizzando un sintetizzatore di oligonucleotidi automatizzato.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig1.jpg"> 
Figura 1: Conversione di un aptamero fluorescente (FLAP) DAP-10-42 in un sensore di aptamero a luce divisa (SLAS). (A)La struttura secondaria di DAP-10-4212 è prevista da un'applicazione di ripiegamento del DNA del Web Server19 UNAFold a 22 °C, 20 mM Na+, 25 mM Mg2+. L'aptamero presenta una struttura secondaria a forcina con un'anima che presumibilmente si ripiega in un motivo G-quadruplex stabilizzato dal gambo 1. Affinché DAP-10-42 possa essere convertito in un SLAS, (1) lo stelo 1 dell'aptamero viene accorciato a 4 bp e affiancato da un ulteriore G-C bp per ottenere lo stelo 1'; (2) la sequenza centrale è divisa tra NTS 29 e 30, con i lati 3' e 5' del sito diviso estesi con sequenze complementari d(GGTCAT) e d(ATGACC), rispettivamente, per formare il gambo 2; (3) lo stelo 1' è esteso con le sequenze complementari ai frammenti adiacenti di un bersaglio di interesse - bracci leganti il bersaglio, con un d(TT)-linker tra i bracci leganti il bersaglio e il dominio di segnalazione del segnale della sonda. (B) Il nucleo può anche essere diviso tra nts 28-29, 27-28 o 26-27 senza perdita significativa del segnale e/o aumento della piega della fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2.jpg"> 
Figura 2: Meccanismo di generazione del segnale SLAS. SLAS è composto da due filamenti - SLAS-U e SLAS-S - e da un colorante fluorogenico (ad esempio, Auramina O; AO). In assenza di un bersaglio di acido nucleico di interesse, entrambi i filamenti sono nello stato dissociato e incapaci di legare il colorante; Non viene osservato alcun segnale (centro). In presenza di un bersaglio M completamente abbinato, sia SLAS-U che SLAS-S ibridano il frammento adiacente di M per portare i frammenti del nucleo in prossimità. Ciò consente la formazione del sito di legame del colorante. Il legame dell'AO ne migliora la fluorescenza, che viene misurata come lettura del segnale fluorescente (a sinistra). In presenza di un MM bersaglio non corrispondente contenente una sostituzione a singolo nucleotide (SNS) in un frammento che interagisce con SLAS-S, solo SLAS-U può ibridarsi con il bersaglio MM , mentre SLAS-S è nello stato dissociato. Ciò impedisce la formazione del sito di legame del colorante e non si osserva alcun segnale (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. Amplificazione della sequenza bersaglio
<ol>
	<li>Amplificare un frammento del gene da analizzare con il test SLAS. Per l'amplificazione PCR o RPA, utilizzare condizioni asimmetriche (ad esempio, con il Forward Primer aggiunto a un eccesso di 10 volte rispetto al Reverse Primer) per generare un amplicone a filamento singolo. Per amplificare un frammento di 126 nt dal gene NANOGP8 utilizzando la PCR20 lineare dopo l'esponenziale (LATE), utilizzare le sequenze di primer elencate nella Tabella 2. In questo caso, è stato utilizzato un modello di DNA a filamento singolo (Template NANOGP8 o Template G1423C, Tabella 2) corrispondente al frammento di 126 nt del gene. Il modello è stato sintetizzato su misura da Integrated DNA Technologies, Inc.<ol>
		<li>Preparare una reazione PCR da 100 μL mescolando 10 μL di 10x Standard Taq Reaction Buffer, 2 μL di 10 mM di miscela dNTP (per ottenere la concentrazione finale di 0,2 mM), 10 μL di 10 μM Forward Primer e 10 μL di 1 μM Reverse Primer (per la concentrazione finale di 1 μM e 0,1 μM, rispettivamente), 0,5 μL di 5U/μL Taq DNA polimerasi, DNA stampo e acqua priva di nucleasi. Per un controllo senza modello, aggiungere acqua al posto del modello.</li>
		<li>Utilizzare le seguenti condizioni di termociclo: denaturazione iniziale a 95 °C per 1 min; 45 cicli di (1) denaturazione a 95 °C per 15 s, (2) ricottura con primer a 60 °C per 30 s, (3) prolungamento con primer a 68 °C per 30 s; e prolungamento finale a 68 °C per 5 min. NOTA: Le tecniche di amplificazione basate sulla trascrizione come NASBA18 possono essere utilizzate al posto della PCR o dell'RPA, soprattutto se è disponibile un modello di RNA per l'amplificazione. NASBA genera un amplicone di RNA a singolo filamento a una concentrazione del prodotto finale nell'intervallo dei micromolari, che è sufficientemente alta da poter essere utilizzata nel saggio SLAS a valle senza concentrazione di prodotto.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Precipitare i campioni amplificati con etanolo aggiungendo 0,1x il volume di acetato di sodio 3 M (pH 5,5) e 3x il volume di etanolo. Incubare a -20 °C per 1 ora, centrifugare a 12.000-18.000 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.</li>
	<li>Lavare il pellet con etanolo al 70%, centrifugare nuovamente e scartare nuovamente il surnatante. Asciugare il pellet all'aria e scioglierlo in 10 μL di acqua priva di nucleasi da utilizzare nel test SLAS.</li>
</ol>
3. Saggio di fluorescenza mediante SLAS
<ol>
	<li>Preparare soluzioni madre di AO (0,1 mM in DMSO, 10x), SLAS-S (10 μM in acqua priva di nucleasi, 10x), SLAS-U (10 μM in acqua priva di nucleasi, 10x) e 4 tamponi per saggio (80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 80 mM KCl). NOTA: Gli ioni potassio sono necessari per stabilizzare il presunto motivo G-quadruplex dell'aptamero, che fa parte del sito di legame del colorante. Un minimo di 1 mM di KCl (a 25 mM di MgCl2) in un tampone di saggio 1x è sufficiente per garantire un aumento della fluorescenza di ~14 volte in presenza del target specifico M sul bianco (campione senza target; Figura supplementare 2B). Gli ioni magnesio stabilizzano le interazioni dei filamenti di acido nucleico (tra SLAS-S, SLAS-U e il bersaglio). La concentrazione di Mg2+ nel tampone del saggio 1x deve essere di almeno 5 mM (a 20 mM KCl; Figura supplementare 2C, D). La soluzione madre di AO (~1 mM) viene preparata in DMSO. Le concentrazioni di SLAS-S e SLAS-U sono arbitrarie e possono essere regolate se necessario, purché vengano mantenute le concentrazioni finali dei filamenti (vedere la logica per la selezione della concentrazione finale di SLAS nella Discussione). ATTENZIONE: L'AO è dannosa se ingerita, tossica a contatto con la pelle e sospettata di causare il cancro. Indossare sempre i guanti quando si lavora con le soluzioni AO. La pesatura dell'AO e la preparazione delle sue soluzioni madre devono essere effettuate sotto il cofano chimico.</li>
	<li>Preparare la miscela master contenente tutti i componenti del saggio tranne il target. Calcolare il volume della miscela master (Vmix) moltiplicando il volume del campione (60 μL) per il numero di campioni più uno (n+1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq01.jpg" style="margin: auto;"> Il numero di campioni n deve includere i controlli negativi e positivi necessari.</li>
	<li>Combinare 0,25μl di miscela da 4 μL di saggio, μl di miscela da 0,1 V di AO da 0,1 mM, μl di miscela da 0,1 V di SLAS-S da 10 μM e μL di miscela da 0,1 V di SLAS-S da 10 μM. Aggiungere acqua priva di nucleasi al volume finale di <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68483/68483eq02.jpg" style="margin: auto;"> in modo che contenga il volume target aggiunto al passaggio 3.4. Agitare e centrifugare brevemente la miscela master. Aliquotare 50 μl della miscela master in n provette. NOTA: Il volume del campione può essere regolato in base alle caratteristiche dello strumento utilizzato per rilevare il segnale fluorescente. Il volume della miscela master aliquotata nelle provette del campione può essere regolato in base al volume target aggiunto al passaggio 3.4. Il volume di acqua priva di nucleasi aggiunta per ottenere la miscela master deve essere regolato di conseguenza. Ad esempio, se il campione contenente il target viene aggiunto al 10% (V/V) del volume del campione finale, l'acqua deve essere aggiunta alla miscela master fino a 0,9 volte lamiscela V.</li>
	<li>Utilizzare un campione come controllo senza target (vuoto) e un campione come controllo positivo. Aggiungere 10 μl del campione contenente il target alla miscela master (50 μl) per ottenere il volume finale del campione di 60 μl contenente un target da 10 a 1000 nM. Per il bianco, utilizzare acqua priva di nucleasi (10 μL) al posto del bersaglio. Per un controllo positivo, utilizzare un oligonucleotide di DNA sintetico contenente la sequenza mirata (ad esempio, bersaglio M, Tabella 1). Aggiungere 10 μl di controllo 0,6-3 μM per ottenere una concentrazione finale di 0,1-0,5 μM. NOTA: L'elevata fluorescenza in questo controllo positivo garantisce che il test funzioni come previsto, anche se si osserva un segnale negativo per i campioni sconosciuti testati.</li>
	<li>Mescolare i campioni e centrifugarli con una microcentrifuga. Incubare i campioni a 22 °C per 10-60 minuti. Il segnale aumenta solo del &lt;15% tra 40 min e 60 min (Figura 3).</li>
	<li>Misurare la fluorescenza dei campioni a 540 nm dopo eccitazione a 475 nm utilizzando uno spettrofotometro fluorescente. NOTA: È possibile utilizzare un fluorimetro portatile che misura la fluorescenza in provette PCR a parete sottile. Il fluorimetro deve essere dotato di filtri di eccitazione ed emissione adatti a rilevare la fluorescenza AO. Un esempio di filtro di eccitazione adatto è un passaggio corto da 495 nm. Un esempio di filtro di emissione adatto è 510-580 nm. In alternativa, il segnale può essere osservato visivamente dopo l'eccitazione della fluorescenza AO nel campione con una sorgente di luce UV o blu. ATTENZIONE: Se si utilizza una lampada UV, indossare occhiali protettivi dai raggi UV.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68483/68483fig3.jpg"> 
Figura 3: Dipendenza dal tempo della generazione del segnale per SLAS-29U/30S. Un campione contenente AO, SLAS-29U e SLAS-30S è stato analizzato utilizzando la modalità cinetica di uno spettrofotometro fluorescente (eccitazione a 475 nm, emissione a 540 nm, fessure di eccitazione/emissione a 5 nm) per 60 minuti. A un tempo di 5 minuti (indicato con una freccia), il bersaglio M è stato aggiunto al campione. I dati sono la media di due studi indipendenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68483/68483fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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<li>Vaidya, M., Bacchus, M., Sugaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+sequences+of+exosomal+NANOG+DNA+as+a+potential+diagnostic+cancer+marker%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential sequences of exosomal NANOG DNA as a potential diagnostic cancer marker.</a> PLoS One. 13, e0197782(2018).</li>
<li>Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Walder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+stability+of+DNA+duplexes+in+solutions+containing+magnesium+and+monovalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations.</a> Biochemistry. 47, 5336-5353 (2008).</li>
<li>Bhattacharyya, D., Arachchilage, G. M., Basu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+cations+in+G-quadruplex+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal cations in G-quadruplex folding and stability.</a> Front Chem. 4, 2296-2646 (2016).</li>
<li>Chen, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+of+free+and+protein-bound+auramine+O%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence of free and protein-bound auramine O.</a> Arch Biochem Biophys. 179 (2), 672-681 (1977).</li>
<li>Klymchenko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvatochromic+and+fluorogenic+dyes+as+environment-sensitive+probes%3A+Design+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Solvatochromic and fluorogenic dyes as environment-sensitive probes: Design and biological applications.</a> Acc Chem Res. 50 (2), 366-375 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aauramina O</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>195064</td><td>un colorante fluorogenico utilizzato per la segnalazione dei segnali</td></tr><tr><td>Fluorimetro Cary Eclipse</td><td>Tecnologie Agilent</td><td>G9800A</td><td>per misurare il segnale fluorescente dei campioni</td></tr><tr><td>Dimethy Sulfoxide</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>196055</td><td>solvente per preparare soluzioni madre di Auramina O</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi di DNA (primer, filamenti SLAS, stampo sintetico per PCR)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>Realizzato su misura e dissalato dal venditore, utilizzato senza ulteriore purificazione</td></tr><tr><td>Miscela dNTP, 10 mM</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>R0191</td><td>per reazione di PCR tardiva</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td>componente tampone; necessario per la corretta associazione dei filamenti della sonda con il target analizzato</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga (1,5 mL)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>plastica per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Micropipetta (0,1-2,5 &; micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K56877G</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Micropipetta (100-1000 &micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>K13160F</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Micropipetta (20-200 & micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>J05253M</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Micropipetta (2-20 & micro; L)</td><td>Eppendorph</td><td>G24675G</td><td>Utilizzato per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>Corning&nbsp;</td><td>6770</td><td>utilizzato per la filatura dei campioni&nbsp;</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC)</td><td>ThermoFisher Scientifico</td><td>AM9932</td><td>Utilizzo per campioni in saggi PCR e SLAS</td></tr><tr><td>Provette per PCR (0,5 mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9932</td><td>per misurare la fluorescenza utilizzando il fluorimetro Quantus</td></tr><tr><td>Punte di pipetta (20-200 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>76322-150</td><td>plastica per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (1-10 uL)</td><td>VWR</td><td>76322-528</td><td>plastica per la preparazione dei campioni</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9640G</td><td>componente tampone; necessario per il corretto ripiegamento del dominio dell'aptamero fluorescente della sonda</td></tr><tr><td>Fluorimetro Quantus</td><td>Promega</td><td>E6150</td><td>Fluorimetro portatile a basso costo che può essere utilizzato per misure di fluorescenza</td></tr><tr><td>Cuvetta al quarzo</td><td>Distretto di Starna</td><td>16.50F-Q-10/Z15</td><td>da utilizzare per la misurazione della fluorescenza con il fluorimetro Cary Eclipse</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi con tampone Taq standard</td><td>Biolaboratori del New England</td><td>Codice: M0273S</td><td>per l'amplificazione di un frammento genico da analizzare con il saggio SLAS&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampone Tris-HCl (pH 7,4)</td><td>Boston Bioproducts</td><td>R-314</td><td>Componente buffer</td></tr><tr><td>Lampada UV</td><td>UVP</td><td>95-0016-14</td><td>per eccitare l'AO per l'osservazione del segnale visivo</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>utilizzato per miscelare i campioni</td></tr></tbody></table>

sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a dna come reporter di segnale per l'analisi degli acidi nucleici specifici della sequenza

Split Hybridization Probe Utilizing a DNA Fluorescent Light-up Aptamer as a Signal Reporter for Sequence-Specific Nucleic Acid Analysis

Le prestazioni di SLAS che utilizzano il core DAP-10-42 come reporter di segnale sono state dimostrate utilizzando una sonda progettata per interrogare un frammento del gene NANOGP8 importante per la progressione del glioblastoma multiforme (GBM), una forma aggressiva di cancro al cervello21. Questo frammento è stato riportato per contenere SNS nel carico di DNA di esosomi derivati da cellule tumorali22. Pertanto, lo SLAS è stato adattato al sito SNS del gene. Per ...

Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per l'analisi degli acidi nucleici specifici della sequenza

DNA-based fluorescent light-up aptamers (FLAPs) are promising for bioanalytical assays because they provide a low-cost fluorescent signal readout without ...

split-hybridization-probe-utilizing-dna-fluorescent-light-up-aptamer

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Dimostrazione di quantificazione del dsDNA utilizzando sonde molecolari PicoGreen colorante e Hitachi F-7000 Spettrofotometro a fluorescenza dotato di un accessorio lettore di micropiastre.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

In questo video, le cellule infettate da virioni MCPyV sono state sottoposte a reazione a catena di ibridazione in situ per rilevare genomi specifici di MCPyV. Inoltre, la tecnica DNA-HCR è stata combinata con la FISH per visualizzare il DNA MCPyV nelle cellule della pelle umana infetta.

HCR-DNA FISH: Una tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza per rilevare il DNA virale nelle cellule infette

Questo video descrive una strategia di ibridazione sequenziale che prevede l'ibridazione di sonde di mRNA su mRNA target specifici. Dopo l'ibridazione della sonda, viene eseguita l'amplificazione del segnale per migliorare la risoluzione attraverso la riduzione del rapporto segnale/rumore durante l'RNA-CISH dei campioni istologici.

Ibridazione con sonda e amplificazione del segnale nell'ibridazione in situ dell'RNA: una tecnica per rilevare specifiche sequenze di RNA in sezioni di tessuto

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

Qui, presentiamo un metodo semplice per eseguire l'ibridazione in situ del DNA a fluorescenza (DNA ISH) per visualizzare sequenze eterocromatiche ripetitive su cromosomi montati su vetrini. Il metodo richiede un numero minimo di reagenti ed è versatile per l'uso con sonde corte o lunghe, tessuti diversi e per la rilevazione con segnali basati sulla fluorescenza o non sulla fluorescenza.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

I coloranti fotostabili della cianina sono attaccati agli oligonucleotidi per monitorare l'ibridazione mediante trasferimento di energia.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

Qui viene presentato un protocollo per il dosaggio degli enzimi metabolizzanti degli acidi nucleici, utilizzando esempi di enzimi ligasi, nucleasi e polimerasi. Il test utilizza oligonucleotidi marcati in fluorescenza e non marcati che possono essere combinati per formare duplex che imitano i danni all'RNA e/o al DNA o gli intermedi di percorso, consentendo la caratterizzazione del comportamento enzimatico.

Utilizzo di oligonucleotidi sintetici modificati per il dosaggio degli enzimi che metabolizzano gli acidi nucleici

Gli acidi nucleici sono analiti comuni per la valutazione dei sistemi biologici; tuttavia, le distorsioni derivanti dalla manipolazione enzimatica possono causare preoccupazione. Qui viene descritto un metodo per la rilevazione senza marcatura di acidi nucleici utilizzando la polianilina. Questa tecnologia di sensori sensibile ed economica è in grado di distinguere le differenze di un singolo nucleotide tra le molecole.

Un sensore polianilina a base di acidi nucleici

Scopri le sonde di ibridazione divise per l'analisi degli acidi nucleici utilizzando l'aptamero fluorescente DAP-10-42. Questo metodo migliora la rilevazione delle sostituzioni di singoli nucleotidi con segnali senza marcatura.

Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per lanalisi degli acidi nucleici specifici della sequenza (Video) | JoVE Journal

Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per l'analisi degli acidi nucleici specifici della sequenza

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