Sonda di ibridazione divisa che utilizza un aptamero fluorescente a DNA come reporter di segnale per l'analisi degli acidi nucleici specifici della sequenza

Stiamo sviluppando nuovi tipi di sonde di ibridazione fluorescente per l'analisi degli acidi nucleici sequenziali specifici. Più recentemente, gli strumenti di analisi dell'ibridazione si sono ampliati con saggi che sfruttano i sistemi CRISPR-Cas. Attualmente, le sonde di ibridazione all'avanguardia, come TaqMan, e le sonde molecolari beacon, sono le più utilizzate per analizzare i bersagli degli acidi nucleici.

Il rilevamento accurato delle sostituzioni di singoli nucleotidi e dei bersagli degli acidi nucleici è ancora praticamente impegnativo. Il nostro protocollo garantisce il livello richiesto di attività cellulare, fornendo al contempo una lettura del segnale fluorescente senza marcatura. Per iniziare, progettare le sequenze di due filamenti di oligonucleotidi di DNA non modificati che costituiscono SLAS.

Utilizzare un frammento contenente nucleotidi per 6-39 di DAP-10-42. Convertire lo stelo 1 costituito dai nucleotidi da 1 a 8 e da 36 a 42 in radice 1 primaria rimuovendo una timina sporgente in posizione 5, accorciando lo stelo a quattro coppie di basi e aggiungendo una coppia terminale di basi citosina-guanina. Includere i nucleotidi da 9 a 29 in un filamento SLAS e i nucleotidi da 30 a 35 nell'altro.

Estendere la sequenza terminale a tre numeri primi del frammento con nucleotidi da 9 a 29 aggiungendo deossi GGTCAT. Quindi estendere la sequenza terminale a cinque primi del frammento da 30 a 35 con deossi TGACC per formare una coppia di sei basi 2. Ora estendere lo stelo 1 prime su entrambi i filamenti con linker deossi TT e sequenze di DNA complementari al bersaglio dell'acido nucleico.

Questo produce le sequenze dei filamenti SLAS-U e SLAS-S che costituiscono la sonda. Rende SLAS-S complementare a una regione da 7 a 10 nucleotidi. Ciò include il sito di sostituzione a singolo nucleotide.

Quindi assicurarsi che il braccio di legame target di SLAS-U sia complementare a un frammento di 15-25 nucleotidi adiacente alla regione SLAS-S. Valutare le temperature di fusione dei duplex di binding target utilizzando il server Web UNAFold. Fare clic sulla scheda INAMelt.

Vai su Applicazioni e seleziona Ibridazione di fusione a due stati. Inserisci le sequenze che interagiscono nell'ordine da cinque a tre numeri primi nelle caselle sinistra e destra. Quindi regolare la temperatura del test a 22 gradi Celsius e inserire le concentrazioni di cationi monovalenti e bivalenti rispettivamente a 20 millimolari e 25 millimolari.

Regolare le concentrazioni delle sequenze interagenti nella casella corrispondente. Premi invio e rivedi i valori di variazione di energia di Gibbs, entalpia, entropia e temperatura di fusione per i duplex corrispondenti. Verificare che le temperature di fusione per i target perfettamente abbinati e i bracci di legatura dei target di SLAS-S e SLAS-U siano superiori alla temperatura del saggio, 22 gradi Celsius.

Assicurarsi che il duplex tra SLAS-S e un target non corrispondente produca temperature di fusione inferiori alla temperatura del saggio per mantenere la specificità. Se necessario, regolare le lunghezze dei bracci di legatura del bersaglio per soddisfare queste condizioni. Ottenere i filamenti di oligonucleotidi SLAS-U e SLAS-S finalizzati da un fornitore commerciale di DNA o sintetizzarli internamente utilizzando un sintetizzatore di DNA automatizzato.

Preparare le soluzioni madre di Auramina O, SLAS-S, SLAS-U e tampone di saggio. Preparare la miscela master contenente tutti i componenti del saggio tranne il target. Aggiungere acqua priva di nucleasi al volume finale di cinque per sesto della miscela master.

Quindi vorticare e far girare il master mix. Erogare 50 microlitri in ciascuna provetta per campioni. Quindi, etichettare un campione come bianco senza target e uno come controllo positivo.

Aggiungere 10 microlitri di campione contenente il target in una provetta contenente la miscela master per ottenere un campione da 60 microlitri. Per il bianco, aggiungere 10 microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi pipettare 10 microlitri di oligonucleotide di DNA sintetico contenente la sequenza target nella provetta di controllo positivo.

Mescolare brevemente tutti i campioni in centrifuga utilizzando una microcentrifuga. Quindi incubare le provette a 22 gradi Celsius per 10-60 minuti. Misurare la fluorescenza a 540 nanometri dopo l'eccitazione a 475 nanometri utilizzando uno spettrofotometro fluorescente.

SLAS è stato adattato per colpire un frammento specifico del gene NANOGP8. Il bersaglio M era completamente complementare al filamento SLAS-S, mentre il bersaglio MM aveva una posizione nucleotidica di citosina 1, 423, introducendo una discrepanza con SLAS-S. Dopo l'aggiunta del bersaglio M completamente complementare, la fluorescenza è aumentata costantemente e si è stabilizzata dopo 45-50 minuti.

Tuttavia, un segnale chiaro era rilevabile entro 10 minuti con un rapporto segnale/bianco di 10 SLAS ha mostrato un segnale di fluorescenza elevato per bersagli completamente abbinati, ma non per bersagli non corrispondenti o spazi vuoti. L'output della fluorescenza è aumentato linearmente con una concentrazione target fino a 500 nanomolari, consentendo la quantificazione e la determinazione dei limiti di rilevamento. I campioni amplificati con PCR hanno mostrato livelli variabili di segnale con solo il campione 2 che superava il valore di soglia di fluorescenza di 2.

Sulla base della curva di calibrazione, la concentrazione di NANOGP8 amplicone nel campione 2 è stata stimata a 124+ o 13 nanomolari. La rilevazione a fluorescenza del segnale SLAS è risultata coerente sia con uno spettrofotometro da banco che con un fluorimetro portatile. Un rapporto segnale/bianco superiore a 20 è stato osservato anche visivamente utilizzando la luce UV.