Modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione

La nostra ricerca si concentra sull'uso dell'elettroporazione, in particolare degli impulsi bipolari di microsecondi, per il trattamento del cancro. Attualmente stiamo esaminando l'ablazione dei tessuti molli, ma stiamo anche per passare alla trasfezione in vivo utilizzando questi impulsi. Il nostro protocollo consente infatti di avere una visione più efficiente delle soglie di elettroporazione irreversibili e reversibili.

Può anche essere un po' meglio di un sistema basato su cubo perché ci permette di vedere in 3D piuttosto che in un ambiente 2D. E un ambiente 3D sarebbe molto più simile a quello che vedremmo nei tessuti. In futuro, cercheremo di tradurre in vivo ciò che vediamo in questo modello, e ciò che questo modello sta realmente facendo è informare le scelte dei parametri che faremo quando cercheremo di fornire cose come i vaccini a DNA, le chemioterapie e i sistemi CRISPR-Cas9.

Per iniziare, posizionare la sospensione cellulare e i reagenti necessari in una cappa di biosicurezza. Miscelare accuratamente la sospensione cellulare preparata con una soluzione di collagene bovino di tipo 1 in rapporto 1:1. Mettere la miscela su ghiaccio o in un bagno di perline fredde per evitare una polimerizzazione prematura.

Quindi, pipettare 500 microlitri della soluzione combinata per rivestire il fondo di ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che il gel tocchi le pareti di ogni pozzetto. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 6 ore o fino a quando i gel non diventano solidi.

Quindi, inclinare la piastra a pozzetti e aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto, lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra. Rimuovere la connessione dell'esca in plastica da due aghi per siringa con punte smussate in acciaio inossidabile 304 da 1,64 millimetri. Metti da parte un ago che funga da elettrodo a spillo.

Per l'altro ago, appiattire gli ultimi 5 millimetri di un'estremità. Quindi, tagliare una sezione di un tubo in acciaio inossidabile 316 con un diametro di 19 millimetri abbastanza lungo da essere posizionato a filo contro il fondo di una piastra a pozzetti per creare l'elettrodo ad anello. Progetta un portaelettrodo utilizzando un software CAD per adattarlo ai componenti dell'elettrodo.

Inserire gli elettrodi ad anello e a perno nel portaelettrodo per assemblare l'elettrodo e inserire a pressione l'ago con l'estremità appiattita nel supporto per fissare l'elettrodo ad anello. In una cappa di biosicurezza, inclinare la piastra preparata e aspirare 400 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto. Aggiungere 20 microlitri di 5 microgrammi per microlitro di soluzione di plasmidi proteici fluorescenti verdi ai pozzetti aspirati.

Agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che la soluzione si distribuisca uniformemente sulla superficie del gel. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 10 minuti. Quindi, inserire la sonda di temperatura in fibra ottica nell'elettrodo a spillo e iniziare a registrare la temperatura.

Collegare il cavo positivo dell'elettroporatore all'elettrodo a spillo e il cavo negativo all'ago, fissando l'elettrodo ad anello. Ora accendi la piastra calda e scalda i gel per mantenere una temperatura di 37 gradi Celsius. Quindi inserire l'anello assemblato e l'elettrodo a spillo con la sonda di temperatura nel pozzetto e assicurarsi che il gel abbia raggiunto una temperatura di 37 gradi Celsius.

Attivare l'elettroporatore per erogare il trattamento. Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura a tutti i gel che appaiono asciutti e continuare a elettrificare i gel non trattati. Una volta completati tutti i trattamenti, incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 10 minuti.

Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto lungo la parete della piastra. Incubare nuovamente i gel nell'incubatore umidificato per 24 ore. Inclinare la piastra e aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto.

Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di PBS in ogni pozzetto lungo le pareti della piastra. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 5 minuti. Quindi, aspirare il PBS da ciascun pozzetto.

Aggiungere delicatamente 500 microlitri di PBS a ciascun pozzetto lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra. Agitare delicatamente la piastra, quindi inclinarla e aspirare il PBS da ogni pozzetto. Ora, aggiungi 100 microlitri di PBS fresco a ciascun pozzetto per mantenere i gel idratati per l'imaging.

Quindi, visualizza la lastra utilizzando tecniche di microscopia fluorescente standard. Dopo l'imaging, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto della piastra e incubare per 24 ore. Ripeti l'intero flusso di lavoro di imaging e recupero per ogni punto temporale designato.

Dopo aver creato un modello computazionale, utilizzare il software del microscopio per misurare il diametro dei bordi esterno e interno della regione a forma di toroide lungo gli assi verticale e orizzontale. Fare la media dei diametri esterno e interno rispettivamente e dividere per 2 per calcolare i raggi corrispondenti. Infine, utilizzando la tabella di ricerca creata in precedenza, derivare l'intensità del campo elettrico ai raggi misurati.

Il raggio esterno della regione trasfettata è stato utilizzato per quantificare l'elettroporazione reversibile o soglia RE correlandola con le intensità del campo elettrico da un modello computazionale. Mentre il raggio interno è stato utilizzato per determinare l'elettroporazione irreversibile o soglia IRE. Tutti e tre i protocolli di impulsi bipolari al microsecondo hanno prodotto regioni di trasfezione a forma di toroide con confini RE e IRE chiaramente visibili.

Tra le forme d'onda testate, la forma d'onda bilanciata burst 2-1-1 ha generato la soglia IRE più alta, mentre la forma d'onda sbilanciata 2-1-1 ha mostrato la più bassa. Un protocollo di elettroporazione monopolare standard che utilizzava 420 volt ha portato a una regione di trasfezione circolare con una soglia RE di 642 volt per centimetro, ma non è riuscito a produrre la morte cellulare, impedendo la determinazione della soglia IRE. La deformazione dei tessuti nel tempo dovuta alla degradazione del gel ha causato la perdita della forma circolare delle regioni trasfettate, rendendo difficile una quantificazione accurata di RE e IRE.

Il disallineamento degli elettrodi ad anello e a spillo con il fondo del pozzetto ha prodotto anche modelli di trasfezione asimmetrici non circolari, complicando la misurazione della soglia.