Name: Modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Scopri la modellazione computazionale per quantificare le soglie di elettroporazione reversibile e irreversibile utilizzando mimiche tissutali tridimensionali. Questo metodo ottimizza i protocolli di trasfezione cellulare.

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<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette da 1000 uL</td><td>Fisher Scientifico</td><td>13-811-164</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Fisher Scientifico</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette da 200 uL</td><td>Fisher Scientifico</td><td>13-811-139</td><td></td></tr><tr><td>Aghi a punta smussata in acciaio inossidabile 304</td><td>McMaster Carr</td><td>Codice: 75165A753</td><td></td></tr><tr><td>Tubi in acciaio inox 316</td><td>McMaster Carr</td><td>Codice 89785K319</td><td></td></tr><tr><td>Acrilico</td><td>McMaster Carr</td><td>Codice 8505K754</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza</td><td>Fisher Scientifico</td><td>13-261-312</td><td></td></tr><tr><td>Programmi CAD</td><td>Sistemi Dassault</td><td>SolidWorks</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Nuaire</td><td>NU-C200R</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>Hbio</td><td>45-0662</td><td>In questo studio sono stati utilizzati un dispositivo personalizzato e un sistema BTX ECM 830</td></tr><tr><td>EMEM</td><td>Fisher Scientifico</td><td>MT10009CV</td><td>Questo può variare&nbsp; se si utilizza una linea cellulare diversa da HEK293</td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare multipozzetto con TC a fondo piatto trasparente Falcon a 12 pozzetti, con coperchio</td><td>Corning</td><td>353043</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi piastra a 12 pozzetti, basta assicurarsi che le dimensioni del pozzetto siano prese in considerazione quando si fabbrica il portaelettrodo.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientifico</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di temperatura in fibra ottica</td><td>Micronor Inc.</td><td>TS5-20MM-02</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide GFP</td><td>Aldeveron</td><td>gWiz-GFP</td><td></td></tr><tr><td>Celle HEK293</td><td>ATCC</td><td>Codice CRL-1573</td><td>È possibile utilizzare altre linee cellulari, è sufficiente assicurarsi che venga utilizzato il terreno di coltura corretto</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Raffreddamento termoelettrico America Corporation</td><td>AHP-301CPV</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di perline con ghiaccio o refrigerato</td><td>Fisher Scientifico</td><td>10-876-001</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Fisher Scientifico</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza invertito</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Taglio laser</td><td>McMaster Carr</td><td>Codice: 7344N11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Fisher Scientifico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Kit</td><td>Fisher Scientifico</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Software di simulazione</td><td>IL BAGNO</td><td>COMSOL Multiphysics 6.2</td><td></td></tr><tr><td>Pallone T75</td><td>Fisher Scientifico</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di collagene bovino di tipo I</td><td>Biomatrice avanzata</td><td>5005</td><td>3 mg/mL</td></tr></tbody></table>

modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione

High-Throughput Capable Three-Dimensional Tissue Model for Quantification of Electroporation Thresholds

L'anello e l'elettrodo a spillo hanno consegnato con successo un plasmide di DNA che codifica una proteina fluorescente verde (GFP) in imitazioni di tessuto di collagene 3D incorporate con cellule HEK293. La quantificazione della soglia RE è stata ottenuta misurando il raggio esterno della regione trasfettata e derivando l'intensità di campo corrispondente dal modello computazionale della configurazione sperimentale, come mostrato nella Figura 2. La soglia IR...

Modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione

Electroporation is a promising technology utilizing electrical pulses for macromolecule delivery and soft-tissue ablation, with applications that include ...

La nostra ricerca si concentra sull'uso dell'elettroporazione, in particolare degli impulsi bipolari di microsecondi, per il trattamento del cancro. Attualmente stiamo esaminando l'ablazione dei tessuti molli, ma stiamo anche per passare alla trasfezione in vivo utilizzando questi impulsi. Il nostro protocollo consente infatti di avere una visione più efficiente delle soglie di elettroporazione irreversibili e reversibili.Può anche essere un po' meglio di un sistema basato su cubo perché ci permette di vedere in 3D piuttosto che in un ambiente 2D. E un ambiente 3D sarebbe molto più simile a quello che vedremmo nei tessuti. In futuro, cercheremo di tradurre in vivo ciò che vediamo in questo modello, e ciò che questo modello sta realmente facendo è informare le scelte dei parametri che faremo quando cercheremo di fornire cose come i vaccini a DNA, le chemioterapie e i sistemi CRISPR-Cas9.Per iniziare, posizionare la sospensione cellulare e i reagenti necessari in una cappa di biosicurezza. Miscelare accuratamente la sospensione cellulare preparata con una soluzione di collagene bovino di tipo 1 in rapporto 1:1. Mettere la miscela su ghiaccio o in un bagno di perline fredde per evitare una polimerizzazione prematura.Quindi, pipettare 500 microlitri della soluzione combinata per rivestire il fondo di ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che il gel tocchi le pareti di ogni pozzetto. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 6 ore o fino a quando i gel non diventano solidi.Quindi, inclinare la piastra a pozzetti e aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto, lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra. Rimuovere la connessione dell'esca in plastica da due aghi per siringa con punte smussate in acciaio inossidabile 304 da 1,64 millimetri. Metti da parte un ago che funga da elettrodo a spillo.Per l'altro ago, appiattire gli ultimi 5 millimetri di un'estremità. Quindi, tagliare una sezione di un tubo in acciaio inossidabile 316 con un diametro di 19 millimetri abbastanza lungo da essere posizionato a filo contro il fondo di una piastra a pozzetti per creare l'elettrodo ad anello. Progetta un portaelettrodo utilizzando un software CAD per adattarlo ai componenti dell'elettrodo.Inserire gli elettrodi ad anello e a perno nel portaelettrodo per assemblare l'elettrodo e inserire a pressione l'ago con l'estremità appiattita nel supporto per fissare l'elettrodo ad anello. In una cappa di biosicurezza, inclinare la piastra preparata e aspirare 400 microlitri di terreno di coltura da ciascun pozzetto. Aggiungere 20 microlitri di 5 microgrammi per microlitro di soluzione di plasmidi proteici fluorescenti verdi ai pozzetti aspirati.Agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che la soluzione si distribuisca uniformemente sulla superficie del gel. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 10 minuti. Quindi, inserire la sonda di temperatura in fibra ottica nell'elettrodo a spillo e iniziare a registrare la temperatura.Collegare il cavo positivo dell'elettroporatore all'elettrodo a spillo e il cavo negativo all'ago, fissando l'elettrodo ad anello. Ora accendi la piastra calda e scalda i gel per mantenere una temperatura di 37 gradi Celsius. Quindi inserire l'anello assemblato e l'elettrodo a spillo con la sonda di temperatura nel pozzetto e assicurarsi che il gel abbia raggiunto una temperatura di 37 gradi Celsius.Attivare l'elettroporatore per erogare il trattamento. Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura a tutti i gel che appaiono asciutti e continuare a elettrificare i gel non trattati. Una volta completati tutti i trattamenti, incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 10 minuti.Dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto lungo la parete della piastra. Incubare nuovamente i gel nell'incubatore umidificato per 24 ore. Inclinare la piastra e aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto.Quindi, aggiungere delicatamente 500 microlitri di PBS in ogni pozzetto lungo le pareti della piastra. Incubare i gel in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 5 minuti. Quindi, aspirare il PBS da ciascun pozzetto.Aggiungere delicatamente 500 microlitri di PBS a ciascun pozzetto lasciandolo scivolare lungo la parete della piastra. Agitare delicatamente la piastra, quindi inclinarla e aspirare il PBS da ogni pozzetto. Ora, aggiungi 100 microlitri di PBS fresco a ciascun pozzetto per mantenere i gel idratati per l'imaging.Quindi, visualizza la lastra utilizzando tecniche di microscopia fluorescente standard. Dopo l'imaging, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto della piastra e incubare per 24 ore. Ripeti l'intero flusso di lavoro di imaging e recupero per ogni punto temporale designato.Dopo aver creato un modello computazionale, utilizzare il software del microscopio per misurare il diametro dei bordi esterno e interno della regione a forma di toroide lungo gli assi verticale e orizzontale. Fare la media dei diametri esterno e interno rispettivamente e dividere per 2 per calcolare i raggi corrispondenti. Infine, utilizzando la tabella di ricerca creata in precedenza, derivare l'intensità del campo elettrico ai raggi misurati.Il raggio esterno della regione trasfettata è stato utilizzato per quantificare l'elettroporazione reversibile o soglia RE correlandola con le intensità del campo elettrico da un modello computazionale. Mentre il raggio interno è stato utilizzato per determinare l'elettroporazione irreversibile o soglia IRE. Tutti e tre i protocolli di impulsi bipolari al microsecondo hanno prodotto regioni di trasfezione a forma di toroide con confini RE e IRE chiaramente visibili.Tra le forme d'onda testate, la forma d'onda bilanciata burst 2-1-1 ha generato la soglia IRE più alta, mentre la forma d'onda sbilanciata 2-1-1 ha mostrato la più bassa. Un protocollo di elettroporazione monopolare standard che utilizzava 420 volt ha portato a una regione di trasfezione circolare con una soglia RE di 642 volt per centimetro, ma non è riuscito a produrre la morte cellulare, impedendo la determinazione della soglia IRE. La deformazione dei tessuti nel tempo dovuta alla degradazione del gel ha causato la perdita della forma circolare delle regioni trasfettate, rendendo difficile una quantificazione accurata di RE e IRE.Il disallineamento degli elettrodi ad anello e a spillo con il fondo del pozzetto ha prodotto anche modelli di trasfezione asimmetrici non circolari, complicando la misurazione della soglia.

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Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

Un vortice microfluidica piattaforma elettroporazione assistito è stato sviluppato per la consegna sequenziale di più molecole in popolazioni di cellule identiche, con un controllo preciso e indipendente il dosaggio. Formato basato fase di purificazione delle cellule bersaglio precedente elettroporazione del sistema aiutato a migliorare l'efficienza di consegna molecolare e la vitalità cellulare trasformati.

Microscala Vortex-assistita Elettroporatore per sequenziale molecolare di consegna

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Questo lavoro descrive lo sviluppo di elettrodi interdigitati flessibili per l'implementazione in modelli 3D di tumore cerebrale, vale a dire, coltura in vitro , modello ovo e modello murino in vivo . Il metodo proposto può essere utilizzato per valutare gli effetti dei campi elettrici pulsati sui tumori a diversi livelli di complessità.

Dispositivi elettronici organici flessibili per la terapia del campo elettrico pulsato del glioblastoma

L'elettroporazione del substrato poroso (PSEP) abbina un'erogazione costante e ad alta produttività con un'elevata vitalità cellulare. L'introduzione delle misure dell'impedenza elettrica transepiteliale (TEEI) fornisce informazioni sui processi intermedi del PSEP e consente la somministrazione senza marcatura. Questo articolo illustra un metodo per eseguire contemporaneamente esperimenti di consegna PSEP e analisi delle misure TEEI.

Elettroporazione basata su substrato poroso con monitoraggio dell'impedenza elettrica transepiteliale

Per lo studio delle risposte delle cellule eccitabili in vitro, il protocollo descrive il monitoraggio ottico dei cambiamenti nella generazione del potenziale d'azione dovuti all'elettroporazione su un semplice modello di cellula eccitabile di cellule HEK tet-on spiking geneticamente modificate, nonché i cambiamenti nella tensione transmembrana con estrazione automatizzata dei parametri rilevanti.

Monitoraggio dei cambiamenti indotti dall'elettroporazione nella generazione di potenziale d'azione nelle cellule HEK Tet-On Spiking geneticamente modificate

Qui, presentiamo la manipolazione genetica acuta di organoidi corticali umani affettati mediante elettroporazione. Questi modelli di organoidi corticali sono particolarmente suscettibili di iniezione in quanto le strutture simili a ventricole possono essere facilmente identificate dopo lo slicing, consentendo l'indagine funzionale dello sviluppo corticale umano, dei disturbi dello sviluppo neurologico e dell'evoluzione corticale.

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

L'elettroporazione è l'uso di campi elettrici pulsati (PEF) per creare pori transitori nelle colture cellulari per introdurre il carico molecolare. Questa tecnica è recentemente diventata ampiamente utilizzata nella ricerca e in contesti clinici. Qui, descriviamo le tecniche di elettroporazione utilizzando il "Sistema di citometria per elettroporazione" recentemente sviluppato per l'esecuzione di microscopia a fluorescenza su cellule vive.

Un protocollo di citometria per elettroporazione per microscopia a fluorescenza su cellule vive utilizzando la coltura cellulare U2 OS

Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare un dispositivo microfluidico a due strati unico per studiare la regolazione elettromeccanica dell'omeostasi del tessuto epiteliale. Il dispositivo applica correnti elettriche fisiologiche statiche perpendicolari al piano del tessuto, influenzando l'adesione, la proliferazione e l'estrusione cellula-cellula. L'imaging su cellule vive e le misurazioni dello stress meccanico rivelano i meccanismi di questi processi.

Rivelazione del controllo elettromeccanico dell'omeostasi tissutale utilizzando un dispositivo microfluidico a due strati

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro completo e riproducibile per la simulazione e validazione specifica del campo elettrico per paziente (ECT) per la metastasi spinale. Il flusso di lavoro integra imaging multimodale, segmentazione semiautomatica e manuale, modellazione della conducibilità tissutale, simulazione lineare a elementi finiti del campo elettrico e validazione sperimentale tramite analisi di sovrapposizione di necrosi basata su risonanza magnetica post-procedura.

Simulazione del campo elettrico specifico per paziente nell'elettrochemioterapia per metastasi spinale

Scopri la modellazione computazionale per quantificare le soglie di elettroporazione reversibile e irreversibile utilizzando mimiche tissutali tridimensionali. Questo metodo ottimizza i protocolli di trasfezione cellulare.

Modello tissutale tridimensionale ad alta produttività per la quantificazione delle soglie di elettroporazione

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