In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV)

La nostra ricerca esplora se una cellula sintetica minima può replicare funzioni biologiche chiave, concentrandosi sulla progettazione di membrane che imitano da vicino la struttura e il comportamento delle membrane cellulari naturali.

Diverse tecnologie vengono impiegate per realizzare vescicole separate in fase e utilizzare questi microvettori per una varietà di applicazioni. Le tecnologie, ad esempio, sono il cDICE a doppio strato e l'elettroformazione. Una delle principali sfide è mantenere la funzionalità delle proteine generando al contempo la separazione di fase sulla vescicola della membrana. L'aumento della temperatura può destabilizzare le proteine e altre biomolecole.

[Narratore] Per iniziare, procurati fiale di miscele lipidiche biotinilate e non biotinilate. Sciogliere 50 microlitri di ciascuna miscela lipidica da 32 millimolari nel cloroformio. Quindi, asciugarli in due fiale di vetro sotto flusso di azoto gassoso per circa 15 minuti. Mettere le fiale di vetro in un essiccatore. Conservateli sottovuoto per circa 30 minuti per eliminare eventuali residui di cloroformio. Ora, disperdere i film lipidici essiccati in una miscela di 20 microlitri di decano e 500 microlitri di olio minerale nelle stesse fiale per ottenere una concentrazione lipidica finale di 3,2 millimolari. Utilizzando un sonicatore da bagno, sonicare le due miscele a circa 50 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, trasferire le miscele di lipidi e oli in due tubi. Durante l'incubazione delle miscele, preparare la miscela di incapsulamento interna per le proteine. Per preparare la miscela proteica FtsZ, aggiungere i reagenti elencati fino a un volume finale di 10 microlitri in una provetta. Conservare il composto in ghiaccio fino al momento dell'utilizzo. Per l'incapsulamento dei fasci di actina, preparare prima 10 microlitri di actina Master Mix, contenente l'86% di G-actina, il 10% di actina ATTO 488 e il 4% di actina biotinilata in acqua. Tenete il composto sul ghiaccio e proteggetelo dalla luce. Poco prima dell'uso, preparare la soluzione finale di actina aggiungendo, nell'ordine, iodixanolo, acqua, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, tampone di polimerizzazione dell'actina 10x, A-Mix, fascina e ATP. Mescolare bene e utilizzare cinque microlitri per l'incapsulamento. Per incapsulare FtsZ, pipettare 500 microlitri di tampone di reazione FtsZ in una provetta di plastica da 1,5 millilitri. Aggiungere delicatamente 200 microlitri di miscela di lipidi e oli per formare un'interfaccia olio-acqua. In un secondo tubo, aggiungere 200 microlitri di miscela di lipidi e oli. Incubare questa provetta a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, pipettare cinque microlitri della miscela proteica FtsZ nella provetta di lipidi e olio incubata, lasciandola affondare sotto forma di gocciolina. Picchiettare delicatamente il tubo cinque o sei volte, fino a quando la soluzione diventa torbida, per formare un'emulsione. Pipettare con cura questa emulsione sopra l'interfaccia olio-acqua preparata in precedenza. Quindi, centrifugare il campione a 6.000 g per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Raffreddare il campione a temperatura ambiente per 30 minuti. Ora, usa una pipetta per rimuovere delicatamente lo strato superiore di olio, lasciando da 100 a 200 microlitri di soluzione per l'imaging. Tagliare la punta di una pipetta ad angolo. Usalo per recuperare da 50 a 100 microlitri di soluzione GUV dal fondo del tubo. Per incapsulare l'actina direttamente in una piastra a 96 pozzetti, combinare 198 microlitri di glucosio molare con 802 microlitri di acqua per preparare una soluzione di glucosio esterna che corrisponda all'osmolarità della miscela interna di actina. Passivare un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 100 microlitri di BSA da 10 grammi per litro a un pozzetto. Dopo un'incubazione di 10-15 minuti, lavare il pozzetto cinque volte con 100 microlitri di soluzione esterna. Lasciare 100 microlitri del lavaggio finale. Ora, aggiungere delicatamente 50 microlitri di miscela di lipidi e oli al pozzetto appoggiando la pipetta sulla parete laterale per garantire una corretta stratificazione sopra la soluzione esterna. In una provetta separata, aggiungere 100 microlitri di lipidi nell'olio e incubare. Aggiungere 2,5 microlitri di soluzione finale di actina alla provetta di lipidi e olio incubata, lasciandola affondare sotto forma di gocciolina. Picchiettare delicatamente il fondo del tubo da 10 a 20 volte, fino a quando la miscela diventa torbida. Pipettare delicatamente l'emulsione al centro del monostrato di olio nel pozzetto, senza rompere l'interfaccia. Quindi, centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 200 g per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Lasciare raffreddare la lastra a temperatura ambiente per 30 minuti prima di eseguire l'imaging. Sono state ottenute vescicole unilamellari giganti, o GUV, con membrane demiscelate in domini liquidi disordinati e ordinati nei liquidi e un'elevata resa di vescicole di dimensioni comprese tra cinque e 30 micrometri. Le reti FtsZ sono state ricapitolate all'interno dei GUV e localizzate preferenzialmente nei domini di membrana disordinati dai liquidi in presenza di GTP e Ficoll 70. Le reti di actina, una volta ricostituite, apparivano come sottili fasci che aderiscono alla membrana e formano strutture sparse simili a ragnatele. Senza lipidi biotinilati, i fasci di actina non riuscivano ad aderire alla membrana e rimanevano invece rigidi e dritti all'interno del lume della vescicola. In condizioni di centrifugazione più elevate, le vescicole contenenti actina miosina si aggregavano in un'architettura simile a un tessuto impaccato nel pozzetto di produzione.