Name: In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche allinterno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Scopri la ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV). Questo metodo consente l'incapsulamento versatile di biomolecole funzionali per studi di biologia cellulare e biofisica.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (sale sodico) (DOPG)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>840475</td><td>In cloroformio</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>850375</td><td>In cloroformio</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolammin-N-(cap biotinyl) (sale sodico) (18:1 Biotinyl Cap PE)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>870273</td><td>In cloroformio</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) (sale sodico) (DPPG)</td><td>Avanti Polar lipidi</td><td>840455</td><td>In cloroformio</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>850355</td><td>In cloroformio</td></tr><tr><td>Micropiastra a fondo piatto a 96 pozzetti (SensoPlate)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Actina (alfa-actina muscolo scheletrico, coniglio)</td><td>HYPERMOL</td><td>8101-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto488-Actin (alfa-actina muscolo scheletrico, coniglio)</td><td>HYPERMOL</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto655-DOPE</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655-16</td><td>Sonicatore</td></tr> da bagno in polvere <tr><td></td><td>Branson&nbsp;</td><td>1510R-MTH</td><td>Pulitore ad ultrasuoni Bransonic</td></tr><tr><td>Biotina-Actina (alfa-actina muscolo scheletrico, coniglio)</td><td>HYPERMOL</td><td>8109-01</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo (ovino)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>700000</td><td>In cloroformio</td></tr><tr><td>Decane</td><td>TCI Deutschland GmbH</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>Fascin (umano, ricombinante)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>CS-FSC01-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll70</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2878</td><td></td></tr><tr><td>Iodixanol (OptiPrep)</td>Laser confocale <td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>LSM800 microscopio a scansione</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40&thinsp; &volte; &sottilesp;/1.2 obiettivo ad immersione in acqua. Laser a stato solido pompati a diodi: 488&thinsp; nm e 640&thinsp; Nm.</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Miosina II (muscolo scheletrico di coniglio)</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>MY02-A</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Osmometro</td><td>Fiske Associates</td><td></td><td>Micro-Osmometro Fiske modello 120</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One</td><td>&nbsp; GmbH</td><td>07-000-109</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (guv)

In vitro Reconstitution of Cytoskeletal Networks inside Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)

Come primo passo, i GUV con separazione di fase a membrana sono stati prodotti seguendo un approccio di emulsione invertita modificato (Figura 1A). Ciò si traduce in un'elevata resa di GUV, che presentano una membrana demiscelata nei domini Ld e Lo , come rappresentato dall'etichetta Atto 655-DOPE sul dominio Ld e dalle regioni scure corrispondenti ai domini Lo non marcati (Figura 1B). Questo metodo produce GUV separati in fase di dimensioni comprese tra 5 e 30 μm (Figura 1C) a temperature elevate (tutti i passaggi eseguiti a 37 °C e ripresi a RT). Inoltre, le velocità di centrifugazione sono state regolate per garantire l'incorporazione dei lipidi componenti originali all'interno dei GUV e per evitare un'eccessiva sovrappopolazione.
Inoltre, per dimostrare il successo dell'incapsulamento di biomolecole utilizzando il metodo dell'emulsione descritto nell'attuale protocollo, sia le reti di FtsZ che quelle di actina sono state ricostituite in esperimenti individuali. Le reti FtsZ sono ricapitolate all'interno di GUV, che emergono come filamenti che si legano preferenzialmente ai domini Ld attraverso la loro sequenza di targeting di membrana (MTS) in presenza di 2,5 mM GTP e 50 g/L di Ficoll70 (come illustrato in Figura 2). Le reti sono state osservate circa 1 ora dopo la fase di incapsulamento. Tuttavia, le reti di actomiosina emergono come fasci sottili (in contrasto con le reti spesse di FtsZ) dopo la ricostituzione all'interno dei GUV (Figura 3). Va notato che i lipidi biotinilati svolgono un ruolo cruciale nel legame delle reti di actomiosina alla membrana dei GUV. Senza lipidi biotinilati, i fasci di actomiosina non possono adottare una configurazione curva e rimangono come fasci diritti, corti e rigidi al lume invece di aderire alla membrana come una rete aggrovigliata di lunghi fasci (Figura 4).
Nel protocollo di emulsione modificato, la velocità di centrifugazione viene regolata per ottenere GUV separati in fase, come accennato in precedenza. Infatti, velocità di centrifugazione più elevate con campioni contenenti reti di actomiosina (600 x g per 15 minuti) provocano l'aggregazione delle vescicole in una configurazione simile a un tessuto all'interno del pozzetto di produzione. Pertanto, in tutti gli esperimenti standard di ricostituzione delle reti di actomiosina, la velocità di centrifugazione ottimale è stata impostata a 200 x g per ottenere GUV non aggregati (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig1.jpg"> 
Figura 1: Generazione one-pot di GUV separati di fase utilizzando il metodo del doppio trasferimento di emulsione. (A) Schema sperimentale delle fasi chiave nella produzione one-pot di vescicole separate di fase tramite doppio trasferimento di emulsione. (B) Immagine confocale di proiezione Z dei GUV risultanti generati seguendo il metodo descritto in A. La barra della scala è di 50 μm. (C) Grafico a barre con la frazione di GUV a separazione di fase generata in base al loro diametro. Esperimenti eseguiti n = 3, il numero totale di GUV analizzati per esperimento = 100. I dati mostrati come valori medi, i singoli punti dati sono i tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei tre esperimenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig2.jpg"> 
Figura 2: Vescicole separate di fase con reti FtsZ incapsulate. (A) Immagini di proiezione 3D confocali eseguite su uno z-stack completamente acquisito di un GUV separato di fase contenente una rete FtsZ. (B) Immagini confocali a proiezione Z eseguite solo sulla metà superiore della vescicola. A causa della formazione eterogenea di domini sulla superficie del GUV, la ricostruzione 3D delle fette confocali acquisite mostra la sovrapposizione dei domini lipidici dalle aree superiore e inferiore della vescicola. Per evitare sovrapposizioni e facilitare l'ispezione visiva dei domini, la metà inferiore degli z-stack acquisiti viene rimossa dal file. La metà superiore risultante viene quindi utilizzata per la sua proiezione 3D tramite deviazione standard. Le barre della scala sono entrambe da 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig3.jpg"> 
Figura 3: Vescicole separate in fase con reti di actomiosina incapsulate. (A) Immagini confocali in proiezione Z di un intero stack acquisito con una vista zoom-out del pozzetto dopo la produzione di vescicole. L'elevata resa delle vescicole ottenute consente lo studio di diverse strutture di actomiosina all'interno delle vescicole. La barra della scala è di 50 μm. (B) Immagini confocali in proiezione Z eseguite sulla metà superiore di una vescicola. Per facilitare l'analisi visiva dei domini lipidici, solo la metà superiore delle fette di immagine viene utilizzata per eseguire una proiezione 3D. La barra della scala è di 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig4.jpg"> 
Figura 4: Importanza dei lipidi biotinilati per la generazione di reti di actomiosina legate alla membrana all'interno di vescicole separate di fase. Proiezioni 3D confocali raffiguranti vescicole separate di fase con reti di actomiosina non attaccate. Se i lipidi biotinilati non sono incorporati nella miscela, le strutture di actomiosina si formano al lume e non acquisiscono una configurazione curva sul foglietto interno delle vescicole (pannello di destra, actina marcata con Atto488). La barra della scala è di 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig5.jpg"> 
Figura 5: Effetto della velocità di centrifugazione sulla produzione di vescicole separate in fase tramite trasferimento di emulsione. Immagini 2D confocali che mostrano un campione GUV generato impiegando una forza di centrifugazione di 600 x g per 15 minuti. La velocità di centrifugazione impiegata, superiore a quella ottimizzata di 200 x g, determina l'aggregazione delle vescicole in una configurazione simile a quella dei tessuti all'interno del pozzetto. La barra della scala è di 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV)

Biomimetic lipid membranes in the form of giant unilamellar vesicles (GUVs) are commonly used to mimic cellular membrane behavior because of the ease of ...

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La ricostituzione della proteina transmembrana, KvAP, in giganti vescicole unilamellari (GUVs) è dimostrato per due metodi di disidratazione, reidratazione - electroformation, e gonfiore gel assistita. In entrambi i metodi, piccole vescicole unilamellari contenenti la proteina sono fusi insieme per formare GUVs che possono poi essere studiate mediante microscopia a fluorescenza e patch-clamp elettrofisiologia.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Le vescicole giganti contenenti componenti altamente impacchettati di dimensioni micrometriche sono utili modelli cellulari. Il metodo di centrifugazione dell'emulsione acqua-in-olio è uno strumento semplice e potente per la preparazione di vescicole giganti con materiali incapsulati.

Preparazione di giganti Vescicole Encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio

Esperimenti sulle vescicole unilamellari gigante di fase separati (GUV) trascurano frequentemente condizioni di soluzione fisiologica. Questo lavoro presenta approcci per studiare l'effetto del buffer ad alta salinità sulla separazione di fase liquido-liquido in carica GUV multicomponente come una funzione di trans-membrana soluzione asimmetria e temperatura.

Comportamento di fase di caricate vescicole sotto soluzione simmetrica e asimmetrica condizioni monitorate con microscopia di fluorescenza

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

Presentiamo una tecnica di micromanipolazione senza contatto delle vescicole, usando le pendenze dello ione calcio localizzata. Microiniezione di una soluzione di ioni di calcio, in prossimità di una vescicola gigante del lipido, è utilizzato per rimodellare la membrana lipidica, con conseguente produzione di tubolari protrusioni di membrana.

Rimodellamento della membrana di vescicole giganti in risposta a gradienti di ioni calcio localizzata

Questo articolo introduce un metodo semplice per la produzione rapida di vescicole unilamellari giganti con proteine citoscheletriche incapsulate. Il metodo si rivela utile per la ricostituzione bottom-up delle strutture citoscheletriche nelle interazioni confinamento e citoscheletro-membrana.

Incapsulamento rapido del citoscheletro ricostituito all'interno di vescicole unilamellari giganti

Le settine sono proteine citoscheletriche. Interagiscono con le membrane lipidiche e possono percepire ma anche generare curvatura della membrana su scala micron. Descriviamo in questo protocollo metodologie bottom-up in vitro per l'analisi delle deformazioni della membrana, del legame della settina sensibile alla curvatura e dell'ultrastruttura del filamento di settino.

Metodi in vitro bottom-up per saggiare l'organizzazione ultrastrutturale, il rimodellamento della membrana e il comportamento di sensibilità alla curvatura delle settine

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Presentiamo un protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento di enzimi e altri componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche e micrometriche.

Costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche

Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di vescicole unilamellari giganti composte (cGUV) con una struttura vescicola nella vescicola, con conducibilità elettrica personalizzata nelle regioni interne, anulari ed esterne. L'elettroformazione sintetizza semplici GUV, che vengono trasformati in stomatociti e cGUV tramite shock osmotico, fornendo un modello prezioso per lo studio della biofisica delle cellule nucleate.

Sintesi di vescicole unilamellari giganti composte: un modello biomimetico di cellule nucleate

Scopri la ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV). Questo metodo consente l'incapsulamento versatile di biomolecole funzionali per studi di biologia cellulare e biofisica.

In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV)

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