Protocollo aggiornato per l'assemblaggio e l'uso dell'array di minibioreattori (MBRA)

Quindi la nostra ricerca si concentra sul microbioma intestinale, in particolare su come può essere ingegnerizzato per prevenire la colonizzazione di agenti patogeni dannosi. Allo stesso tempo, siamo anche interessati a capire le regole ecologiche e i meccanismi alla base di questa resistenza alla colonizzazione. La tecnologia, come il sequenziamento di nuova generazione, la bioinformatica avanzata, i topi privi di germi e i modelli intestinali in vitro, stanno trasformando il modo in cui studiamo le comunità microbiche e il loro ruolo nella salute e nella malattia.

Una delle maggiori sfide con i modelli intestinali in vitro è il loro funzionamento ad alta produttività. Ciò di cui abbiamo bisogno sono sistemi che consentano l'interrogazione funzionale delle comunità microbiche su larga scala. L'array di minibioreattori è un sistema di coltura a flusso continuo progettato per affrontare la mancanza di capacità di produzione in altri sistemi.

Ci consente di aumentare gli esperimenti pur catturando il comportamento complesso e riproducibile della comunità microbica. Per iniziare, assicurati che le strisce dell'array del minibioreattore siano stampate in 3D e contengano sei camere di bioreattore indipendenti. Disporre tutti i componenti necessari per il montaggio.

Utilizzando un rubinetto per frazioni da 1/4 di pollice 28 NF con una chiave per maschi con impugnatura a T. Infilare le tre porte da 1/4 di pollice in ciascuna camera per inserire i raccordi. Dopo aver lavato la camera con acqua, posizionare un'ancoretta magnetica da 10 x 3 millimetri in ciascuna camera e aggiungere un millilitro di acqua distillata.

Quindi posizionare una rondella di gomma sopra ogni porta del bioreattore. Per ogni camera, avvitare un'esca maschio filettata con cannuccia media, un'esca maschio filettata con cannuccia di scarto e un'esca maschio filettata vuota nelle porte. Ora inserisci sei setti di gomma su punte per esche femminili da 3/32 di pollice e piega la manica superiore di ciascun setto verso il basso per coprire il collo.

Attaccali alle porte designate di ciascuna camera. Tagliare le strisce di tubo C-flex della lunghezza e del numero desiderati. Collegare una punta per esca femmina da 1/8 di pollice a un'estremità e un connettore di blocco esca maschio all'estremità opposta di ciascuna lunghezza di tubo.

Quindi inserire un'aletta femmina da 1/16 di pollice in ciascuna estremità del tubo E-lab rosso a due stop con un diametro interno di 1,14 millimetri e il tubo E-lab arancione a due stop con un diametro interno di 0,89 mm. Collegare il tubo E-lab preparato al tubo C-flex e assicurarsi che ciascuna delle sei lunghezze del tubo C-flex sia collegata a una linea E-lab rossa e una arancione tramite esche femminili. Quindi, tagliare il tubo C-flex a lunghezze diverse secondo necessità.

Collegare l'aletta femmina da 1/8 di pollice e un connettore maschio di blocco dell'esca a entrambe le estremità di un pezzo da 3 pollici e del pezzo da 12 pollici di tubo C-flex. Fissare i connettori maschio del blocco dell'esca a entrambe le estremità dei pezzi rimanenti. Assemblare l'albero della linea di scarico secondo il diagramma 3D.

Collegare le estremità esposte del tubo rosso E-lab a due stop ai blocchi dell'esca maschio terminale sull'albero della linea di scarico in ordine crescente in base alla lunghezza del tubo C-flex. Quindi collegare il tubo C-flex da 3 pollici con l'aletta femmina da 1/8 di pollice e il connettore maschio di blocco dell'esca alla parte superiore dell'albero della linea di scarico. Assemblare l'albero della linea di alimentazione secondo il diagramma 3D.

Collegare le estremità esposte del tubo E-lab arancione a due stop ai blocchi dell'esca maschio terminale sull'albero della linea di alimentazione in ordine crescente in base alla lunghezza del tubo C-flex e collegare il tubo C-flex da 12 pollici alla parte superiore dell'albero della linea di alimentazione. Collegare al bioreattore i tubi C-flex di lunghezza variabile all'estremità dell'albero della linea di alimentazione, disponendoli in ordine crescente dalla linea più corta a sinistra a quella più lunga a destra. Collegare il tubo C-flex di lunghezza variabile all'estremità dell'albero della linea di scarico alla striscia del bioreattore in ordine decrescente con la linea più lunga a sinistra e la più corta a destra per adattarsi al posizionamento della pompa.

Raggruppare tutte le linee di alimentazione C-flex sul lato sinistro della striscia e fissarle con una fascetta. Formare un anello con il tubo E-lab arancione a due stop tra le linee C-flex e fissare l'anello utilizzando del nastro adesivo per autoclave, quindi ripetere il processo per il tubo E-lab rosso a due stop sul lato di scarto della striscia del bioreattore. Coprire l'esca femmina all'estremità dei rifiuti e alimentare gli alberi della linea con un foglio per evitare la contaminazione.

Allentare le esche filettate maschio con setti su ciascuna camera del bioreattore per consentire la fuoriuscita del vapore durante la sterilizzazione in autoclave. Dopo aver posizionato il gruppo in un contenitore per autoclave, stendere gli alberi della linea di alimentazione e di scarto in contenitori separati adiacenti a quello contenente le strisce MBRA. Per collegare il sistema alle pompe, rimuovere il nastro dell'autoclave che fissa il tubo E-lab sia per le linee di scarico che per quelle di alimentazione e slegare i fasci di tubi C-flex.

Posizionare l'MBRA tra le due pompe sopra la piastra di agitazione. Fissalo utilizzando i supporti stampati in 3D e allinealo con le posizioni di agitazione contrassegnate sulla piastra. Collegare ora il tubo E-lab della linea di alimentazione alle cartucce della pompa peristaltica e posizionare i fermi del tubo nelle fessure delle cartucce.

Ripetere la procedura per il tubo E-lab della linea di scarico sulla pompa situata a destra della piastra di agitazione. Quindi bloccare le cartucce della pompa peristaltica nella pompa. Disporre ordinatamente il tubo C-flex utilizzando i supporti per tubi stampati in 3D.

Collegare l'estremità dell'albero della linea di scarico al tubo collegato alle bottiglie di scarico. Quindi, collegare l'esca femmina sul tubo di ingresso della linea di alimentazione al connettore maschio sul tubo da 12 pollici dal tappo del flacone del supporto. Accendere entrambe le pompe per avviare il flusso del fluido e assicurarsi che entrambe le pompe siano impostate sulla rotazione in senso orario quando i rifiuti sono posizionati a destra delle pompe.

Osservare la dimensione e la cadenza delle goccioline in ciascuna camera del bioreattore. Se si nota una variabilità o un'anomalia, sostituire il tubo E-lab arancione a due stop collegato alla camera interessata per ridurre la variazione della portata. Una volta che le camere sono piene, spegnere entrambe le pompe e lasciare riposare i bioreattori per 24-48 ore per verificare la presenza di contaminanti prima di iniziare l'esperimento.

Commutare l'ingresso del fluido in un contenitore da un litro di candeggina al 10% in acqua deionizzata e aumentare la portata su entrambe le pompe al massimo per spostare il contenuto delle camere del bioreattore con la candeggina. Una volta che le camere sono libere dai fluidi, capovolgere l'MBRA per disinfettare sopra la linea di riempimento per cinque minuti. Dopo cinque minuti, raddrizzare il sistema e attendere altri cinque minuti per la sterilizzazione.

Dopo che le camere sono state ripulite dai terreni e sono state sterilizzate per 10 minuti, sostituire la candeggina con un litro di acqua deionizzata e lavare il sistema fino a quando l'acqua non è passata. Quindi scollegare il tubo E-lab del bioreattore dalle pompe e rimuovere gli MBRA. Rimuovere i setti usati dal bioreattore e svuotare ogni camera fino a quando rimane solo un millilitro d'acqua.

Sostituire i setti, il tubo arancione a due stop E-lab e sterilizzare in autoclave la striscia completamente assemblata come dimostrato in precedenza. Dopo tre cicli di riutilizzo, attenersi alla seguente procedura. Un campione fecale umano è stato preparato e coltivato nel sistema MBRA.

Dopo quattro giorni di flusso continuo, la comunità microbica in tutti e nove i bioreattori era dominata da 18 generi batterici, ciascuno dei quali comprendeva almeno il 2% di abbondanza relativa in qualsiasi replica. 22 dei 65 generi rilevati erano presenti in tutte e nove le repliche dei bioreattori, dimostrando un'elevata riproducibilità. L'analisi della diversità alfa ha mostrato una variazione minima tra le repliche sia nelle unità tassonomiche operative osservate che nell'indice di diversità di Shannon.