Modellizzazione della metastasi cerebrale: analisi standardizzata della colonizzazione metastatica e dei modelli di crescita istologica tramite iniezione intracorticale stereotattica

Il nostro gruppo indaga come le cellule tumorali colonizzino il cervello e come i modelli di crescita metastatica influenzino gli esiti clinici e le risposte terapeutiche. Per cominciare, pesa ogni topo usando una bilancia di precisione per calcolare il volume necessario di anestetico in base al suo peso corporeo. Dopo aver somministrato l'anestetico, posiziona il topo su una borsa riscaldante preriscaldata, mantenuta a 37-38 gradi Celsius per supportare la termoregolazione, poi applica una pomata per gli occhi per proteggere la cornea dall'essiccazione.

Prepara il topo utilizzando una tecnica asettica approvata dal comitato locale di etica animale. Disinfetta accuratamente il cuoio capelluto usando una soluzione a base di iodio. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzicotto all'allucco, poi allungare la pelle fino a una lunghezza tesa e eseguire un'incisione mediana di circa tre o quattro millimetri lungo il cranio usando un bisturi sterile.

Usando lo stesso bisturi, raschia delicatamente via il periosto per esporre la superficie del cranio. Fissa la testa del mouse in un frame stereotassico usando delle barra per le orecchie. Utilizzando il braccio stereotattico, individuare il bregma, poi spostare il braccio due millimetri anteriore e un millimetro laterale a destra, e segnare il sito bersaglio nella corteccia frontale con un marcatore chirurgico.

Forare con attenzione il cranio nel punto segnato utilizzando un trapano dentale di precisione, assicurandosi che la dura madre non venga penetrata. Conferma l'apertura sondando delicatamente il sito con una pinza sterile. Successivamente, risospendi la sospensione delle cellule tumorali pipettando su e giù per garantire una distribuzione uniforme.

Carica tre microlitri della sospensione in una siringa Hamilton da 10 microlitri e inseriscila nel telaio stereotattico usando il supporto appropriato. Posiziona con cura l'ago della siringa sopra il foro del foro, assicurandoti che la bisella sia rivolta verso sinistra per garantire la consistenza dell'iniezione. Inserire l'ago verticalmente nel tessuto cerebrale fino a una profondità di 3,5 millimetri.

Una volta raggiunta la profondità richiesta, si ritira lentamente l'ago di 0,5 millimetri per aiutare a prevenire il reflusso della sospensione cellulare e inietta lentamente tre microlitri della sospensione cellulare tumorale nell'arco di un minuto. Dopo l'iniezione, mantenere l'ago in posizione per altri due minuti per permettere alle cellule e alla matrice extracellulare di stabilizzarsi e minimizzare il reflusso. Poi ritira con attenzione la siringa e rimuovi il mouse dal telaio stereotattico.

Risciacqua delicatamente il cranio con una soluzione sterile di cloruro di sodio al 0,9% e sigilla il foro del foro usando cera ossea. Chiudi l'incisione del cuoio capelluto usando tre o quattro punti di sutura che legano ogni punto con tre nodi stretti posizionati vicino ai bordi della ferita per una guarigione ottimale. Segna le orecchie del topo usando un motivo appropriato per il perforatore corrispondente al numero di identificazione designato.

Successivamente, riapplica la pomata per gli occhi se necessario per evitare la secchezza corneale durante il recupero e riporta il topo a un cuscinetto riscaldante preriscaldato mantenuto a 37-38 gradi Celsius per facilitare il recupero dall'anestesia. Pulisci e disinfetta accuratamente la siringa Hamilton risciacquando ago e canna tre volte consecutivamente, prima con acqua distillata, poi con etanolo al 70% e infine con una soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%. Dopo il risciacquo, conservare la siringa Hamilton sul ghiaccio fino al prossimo utilizzo.

Infine, somministrare analgesico sottocutaneamente mentre il topo è ancora sotto anestesia per garantire un sollievo immediato dal dolore post-operatorio. I topi domestici singolarmente durante il recupero per un breve periodo, non superiore a un'ora, per prevenire ferite dovute alle interazioni tra animali svegli e in fase di guarigione. Se durante il periodo di monitoraggio vengono osservati segni di disagio o comportamenti anomali, valuta la funzione neurologica utilizzando il test del filo sospeso per valutare la forza della presa e la coordinazione.

Sostieni un mouse su un filo orizzontale e registra se raggiunge una piattaforma di fuga entro 60 secondi. Un topo non sano non riesce a raggiungere la piattaforma e cade dal filo. Dopo l'eutanasia e la raccolta dei tessuti animali, si valuta il modello istologico di crescita della metastasi e le caratteristiche associate sui vetri digitali del tessuto.

Le immagini macroscopiche hanno confermato l'assenza di crescita tumorale nei topi con valvola di controllo C iniettati con ECM, mentre lesioni metastatiche visibili erano presenti nei topi iniettati con sospensioni ECM a cellule tumorali. I topi iniettati con cellule tumorali al seno 4T1 o 410.4 hanno mostrato un carico metastatico significativamente più elevato rispetto ai controlli iniettati con ECM, senza differenze significative tra le due linee cellulari tumorali. L'analisi di sopravvivenza di Kaplan Meyer ha dimostrato che i topi iniettati con 410,4 cellule tumorali avevano una sopravvivenza complessiva significativamente più lunga rispetto a quelli iniettati con cellule 4T1.

L'analisi istologica ha mostrato che le metastasi cerebrali 4T1 e 410,4 hanno mostrato modelli di crescita distinti, con 4T1 che mostrava una coorte e 410,4 una crescita epiteliale infiltrativa simile a filamenti. Iniezioni stereotattiche improprie hanno portato alla crescita tumorale nel cranio e meningi dovute a perdite di sospensione cellulare, mentre una corretta iniezione intracorticale ha portato a metastasi parenchimatose con successiva disseminazione meningea. Abbiamo dimostrato che i modelli di crescita delle metastasi cerebrali influenzano la prognosi e la morte neurologica, supportando la rilevanza per guidare le decisioni cliniche.

Questo protocollo è particolarmente utile per studiare la colonizzazione metastatica in stadi tardivi, affrontando aspetti clinicamente rilevanti come la dinamica della crescita e la diffusione secondaria. A differenza di altri metodi, il modello stereotattico assicura la colonizzazione specifica del cervello e preserva la complessità del sistema completo, consentendo studi a lungo termine sulla progressione tumorale e sulla risposta alla terapia. Fornendo una piattaforma clinicamente riproducibile e rilevante, il nostro modello contribuisce a comprendere i meccanismi della colonizzazione cerebrale e a esplorare nuove strategie terapeutiche.